CN1134728A - 降低了吸附能力以及增加了水解能力的枯草杆菌蛋白酶bpn′变体 - Google Patents

降低了吸附能力以及增加了水解能力的枯草杆菌蛋白酶bpn′变体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及枯草杆菌蛋白酶BPN′变体，该变体在第199—220位中含有与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′不相同的至少一个或多个氨基酸位置(即替代)，从而该BPN′变体与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN相比降低了对不溶性底物的吸附作用并增加了水解不溶性底物的能力。

Description

降低了吸附能力以及增加了水解 能力的枯草杆菌蛋白酶BPN′变体
技术领域
本发明涉及用于各种清洁组合物中的新型酶变体，以及编码所述酶变体的基因。
背景
酶构成了最大类的天然存在的蛋白质。各类酶通常催化(使未被耗尽的反应加速进行)不同类型的化学反应。已经知道称为蛋白酶的一类酶具有水解(通过在被裂解化学键的任一侧吸取水分子的H和OH而将一种化合物分裂为二种或多种较简单化合物)其他蛋白质的能力。通过将天然存在的和以蛋白质工程技术制造的蛋白酶作为添加剂掺入到洗衣用去污制剂中，这种水解蛋白质的能力已发挥了其优点。衣服上的许多污渍是蛋白质的并且有广泛特异的蛋白酶能从实质上更好地去除这些污渍。
但不幸的是，在自然的细菌环境中这些蛋白质的效率水平通常不会转变成相对的非天然洗涤环境。特别是，对于在酶的天然环境之外使用时并不一定能使蛋白质特性例如热稳定性，pH稳定性，氧化稳定性以及底物特异性达到最佳化。
蛋白酶的氨基酸序列决定着该蛋白酶的特性。依据氨基酸序列变化的位置，性质和/或量的大小，蛋白酶氨基酸序列的变化可在不同程度上改变酶的特性，或者甚至使酶失活。已采用几种方法用于在试图改善其特性中改变蛋白酶的野生型氨基酸序列，达到增加蛋白质在洗涤环境中的效率。这些方法包括改变氨基酸序列以便在十分不利的条件下提高其热稳定性以及改善其氧化稳定性。
尽管本领域内描述了各种方法，但仍需要适用于清洁各种表面的新的有效的蛋白酶变体。
发明目的
本发明的一个目的是提供枯草杆菌蛋白酶酶变体，相对于野生型酶该酶变体改善了水解能力。
本发明还有一个目的是提供含有这种枯草杆菌蛋白酶酶变体的清洁组合物。
发明概要
本发明涉及枯草杆菌蛋白酶BPN′变体，它在特异性鉴别的位置上至少含有一、二或三个氨基酸位置上具有不同于野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸(即替代)，从而与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′相比，所述BPN′变体增加了对不溶性底物的吸附作用，增加了水解不溶性底物的能力。本发明还涉及编码所述枯草杆菌蛋白酶BPN′变体的基因。本发明还涉及含有所述枯草杆菌蛋白酶BPN′变体的用于清洁各种表面的组合物。
发明的描述
1.枯草杆菌蛋白酶变体
本发明涉及枯草杆菌蛋白酶，尤其是已通过将编码该酶的各个核苷酸序列进行突变，从而修饰该酶的氨基酸序列所得到的经过修饰的BPN′。与野生型枯草杆菌蛋白酶相比，本发明所述经过修饰的枯草杆菌蛋白酶(下文中称为“BPN′变体”)降低了对不溶性底物的吸附作用并且提高了对不溶性底物的水解作用。本发明还涉及编码所述BPN′变体的突变基因。
本发明的枯草杆菌蛋白酶属于称为蛋白酶的一类酶。蛋白酶是裂解肽键的催化剂。一种类型的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。由于在活性位点存在必需的丝氨酸残基这一事实而得以区分丝氨酸蛋白酶。
在文献中已详细地记载了酶水解可溶性底物的速度随酶浓度增加而加速的研究资料。因此对于表面结合的底物例如许多清洁应用中遇到的情况而言，水解速率随表面浓度增加而提高似乎是合情合理的。这种现象已得到证实(Brode，P.F.111和D.S.Rauch，LANGMUIR，“Subtilisin BPN′：Activity on an Immolbilized Substrate”，Vol.8，pp.1325-1329(1992))。事实上，对于不溶性底物，当酶的表面浓度变化时，发现水解速率对表面浓度的线性依赖性(Rubingh，D.N.和M.D.Bauer，“Catalysis of Hydrolysis byProteases at the Protein-Solution Interface，”inPolymer Solution，Blends And Interfaces，Ed.by I.Nodaand D.N.Rubingh，Elsevier，P.464(1992))。令人惊奇的是，当应用该原则寻找有更好清洁性能的变异蛋白酶时，我们没有发现具有更好吸附效能的酶。事实上，我们出人意料地确认了相反的情况：酶对底物的吸附作用降低了导致了对底物之水解作用的提高(即较好的清洁性能)。
虽然不拘泥于理论，但据信当将一种变异体与另一种相比较时，改善的清洁性能是由于酶吸附较少时结合紧密程度也较小，因而在待去除之不溶性蛋白质底物的表面上的移动性更大。在有差不多的酶溶液浓度时，这种移动性的提高足以超过任何优点，所述优点是因较高浓度的酶释放到表面上而提供的。
将本文描述的突变设计为改变(即降低)酶对表面结合之污物的吸附作用。在BPN′中，第200-220位的氨基酸在酶分子上形成一个大的外部环。已经发现该环在酶分子对表面结合肽的吸附中起着重要作用，并且该环上特定的突变对吸附作用具有显著的影响。虽然不拘泥于理论，但据信至少有两种原因认为该环对于BPN′分子的吸附作用是重要的。首先，含有该外部环的氨基酸可以与暴露于该分子的表面紧密接触。第二，该环与BPN′分子的活性位点以及结合袋接近使之在酶对表面结合之底物(肽/蛋白质污渍)的催化生产性吸附中起作用。
如本文使用的，“变体”指具有不同于野生型氨基酸序列的酶。
如本文使用的，“突变BPN′基因”指编码BPN′变体的基因。
如本文使用的，“野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′”是指由SEQ IDNO：1表示的枯草杆菌蛋白酶，该枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列可进一步参见Wells，J.A.，E.Ferrari，D.J.Henner，D.A.Estell和E.Y.Chen，Nucleic Acids Research，Vol.II，7911-7925(1983)的描述，该文献引入本文作参考。
如本文使用的，术语“野生型氨基酸序列”包括SEQ ID NO：1以及在除第199-220位以外的氨基酸序列上有修饰的SEQ ID N0：1。
如本文使用的，“更亲水的氨基酸”是指其亲水性大于下表中所示主题氨基酸之亲水性的任何其他氨基酸。下面的亲水性表(表1)列出了其亲水性的增加呈递减次序的氨基酸(参见Hopp，T.P.，以及Woods，K.R.，“Prediction of Protein AntigenicDeterminants from Amino Acid Sequences”，Proceedingsof the National Academy of Science USA，Vol.78，pp.3824-3828，1981，引入本文作参考)。
表1
     氨基酸     亲水性值
      Trp      -3.4
      Phe      -2.5
      Tyr      -2.3
     Leu，Ile      -1.8
      Val      -1.5
      Met      -1.3
      Cys      -1.0
     Ala，His      -0.5
      Thr      -0.4
     Pro，Gly      -0.0
     Gln，Asn       0.2
      Ser       0.3
  Arg+，Lys+，Glu-，Asp-       3.0
表1还指出了携带电荷的氨基酸(这种特性是以pH为约8-9为基础的)。带正电的氨基酸是Arg和Lys，带负电荷的氨基酸是Glu和Asp，其余的氨基酸则为中性。在本发明的一个优选实施例中，替代氨基酸是中性或者带负电的，较好的是带负电的(即Glu或Asp)。
因此，例如“用中性或具有负电荷的同等或更亲水的氨基酸替代Gln”是指用Asn(与Gln具同样亲水性)或Ser，Glu或Asp(比Gln的亲水性大)替代Gln；这里用于替代的各种氨基酸都是中性或带负电荷的；并且与Gln相比具有更大的亲水性值。同样，“用中性或具负电荷的更亲水的氨基酸替代Pro”的说法是指用Gln，Asn，Ser，Glu或Asp替代Pro。
A.含有至少一个氨基酸替代的变异体
在本发明的一个实施方案中，BPN′变体含有野生型氨基酸序列，其中野生型氨基酸序列在199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、218、219或220中的一个或多个位置上被替代；从而与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′相比该BPN′变体降低了对不溶性底物的吸附作用并且提高了水解不溶性底物的能力。具有替代氨基酸的位置较好是199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212或者215，更优选的是200、201、202、205或者207位。
第199位的替代氨基酸较好是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第200位的替代氨基酸较好是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第201位的替代氨基酸较好是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第202位的替代氨基酸较好是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第203位的替代氨基酸较好是Met、Cys、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
替代第204位的氨基酸较好是Glu。
第205位的替代氨基酸较好是Leu、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第206位的替代氨基酸较好是Pro、Ash或者Ser。
第207位的替代氨基酸较好是Asp或者Glu。
第208位的替代氨基酸较好是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第209位的替代氨基酸较好是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第210位的替代氨基酸较好是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第211位的替代氨基酸较好是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第212位的替代氨基酸较好是Gln、Ser、Asp或者Glu。
第213位的替代氨基酸较好是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第214位的替代氨基酸较好是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或者Glu。
第215位的替代氨基酸较好是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第216位的替代氨基酸较好是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第218位的替代氨基酸较好是Glu。
第219位的替代氨基酸较好是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第220位的替代氨基酸较好是Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或者Glu。
参照表1，第199、200、201、202、202、205、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、219和220中任一位置的替代氨基酸较好是中性或者带负电并且与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′的目的位的氨基酸相比具有同等或更高的亲水性，较好是有更高的亲水性。
第199、200、201、202、203、205、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、219和220中任一位置的替代氨基酸最好是Asp或者Glu；并且第204或218位的替代氨基酸是Glu。
B.至少含有两个替代氨基酸的变异体
在本发明的另一个实施方案中，BPN′变异体含有野生型氨基酸序列，其中所述野生型氨基酸序列在第199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220位中的两个或者多个位置被替代，从而与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′相比，该BPN′变体降低了对不溶性底物的吸附作用并且增加了对不溶性底物的水解作用。含有替代氨基酸的位置较好是199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212或者215位；更好是200、201、202、205或者207位。
199位的替代氨基酸较好是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
200位的替代氨基酸较好是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
201位的替代氨基酸较好是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
202位的替代氨基酸较好是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
203位的替代氨基酸较好是Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
204位的替代氨基酸较好是Asp或者Glu。
205位的替代氨基酸较好是Leu、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
206位的替代氨基酸较好是Pro、Asn、Ser、Asp或者Glu。
207位的替代氨基酸较好是Asp或者Glu。
208位的替代氨基酸较好是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
209位的替代氨基酸较好是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
210位的替代氨基酸较好是Ala、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
211位的替代氨基酸较好是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
212位的替代氨基酸较好是Gln、Ser、Asp或者Glu。
213位的替代氨基酸较好是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
214位的替代氨基酸较好是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
215位的替代氨基酸较好是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
216位的替代氨基酸较好是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
217位的替代氨基酸较好是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
218位的替代氨基酸较好是Gln、Ser、Asp或者Glu。
219位的替代氨基酸较好是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
220位的替代氨基酸较好是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
第199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220中的任一位置的替代氨基酸更好是表1所示的中性或者带负电荷的，并且与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′的目的位置氨基酸相比是具有同等或者更大亲水性的，特别是更亲水的。
199、200、201、202、203、204、205、206、202、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220中任一位置的替代氨基酸最好是Asp和Glu。
C.至少含三个氨基酸替代的变异体
在本发明另一个实施方案中，BPN′变异体含有野生型氨基酸序列，其中野生型氨基酸序列的第199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220位中的三个或者更多个位置被替代；从而与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′相比，该BPN′变体降低了对不溶性底物的吸附作用，并且提高了对不溶性底物的水解作用。具有替代氨基酸的位置较好是199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212、或者215位，更优选的位置是200、201、202、205或者207。
199位的替代氨基酸较好是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
200位的替代氨基酸较好是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
201位的替代氨基酸较好是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
202位的替代氨基酸较好是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
203位的替代氨基酸较好是Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
204位的替代氨基酸选自于Asp或者Glu。
205位的替代氨基酸较好是Leu、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
206位的替代氨基酸较好是Pro、Asn、Ser、Asp或者Glu。
207位的替代氨基酸较好是Asp或者Glu。
208位的替代氨基酸较好是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
209位的替代氨基酸较好是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
210位的替代氨基酸较好是Ala、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
211位的替代氨基酸较好是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
212位的替代氨基酸较好是Gln、Ser、Asp或者Glu。
213位的替代氨基酸较好是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
214位的替代氨基酸较好是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
215位的替代氨基酸较好是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
216位的替代氨基酸较好是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
217位的替代氨基酸较好是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
218位的替代氨基酸较好是Gln、Ser、Asp或者Glu。
219位的替代氨基酸较好是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
220位的替代氨基酸较好是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
l99、200、201、202、202、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220中任一位置的替代氨基酸更好是表1所示的中性或者带负电荷的，并且与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′的目的位置的氨基酸相比具有同等或者更大亲水性，优选的更亲水的氨基酸。
199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220中任一位置的替代氨基酸更好是Asp或者Glu。
D.酶变体的制备
实施例1
突变的BPN′基因
将含有野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′基因的噬菌粒(pSS-5)(Mitchinson，C.and J.A.Wells，(1989)，“ProteinEngineering of Disulfide Bonds in Subtilisin BPN′BIOCHEMISTRY，Vol.28，4807-4815)转化到大肠杆菌ung-菌株CJ236中，并且利用VCSM13辅助噬菌体制备含尿嘧啶的单链DNA模板(Kunkel，T.A.，J.D.Roberts and R.A.Zakour，“Rapidand efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection”，METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.154，pp.367-382(1987)；如由Yuckenberg，P.D.，F.Witney，J.Geisselsoder和J.McClary修改的，“Site-directed in vitromutagenesis using uracil-containing DNA和phagemidvectors”，DIRECTED MUTAGENESIS-A PRACtiCAL Approach，ed.M.J.McPherson，pp.27-48(1991)；两者引入本文作参考)。利用Zoller和Smith的单引物定位诱变修饰方法(Zoller，M.J.，and M.Smith，“Oligonucleotide-directed mutagenesis usingM13-derived vectors：an efficient and generalprocedure for the production of point mutations inany fragment of DNA”，Mucleic Acids Research，Vol.10，pp.6487-6500(1982)，引入本文作参考)制备所有突变体(基本上按是由Yuckenberg等人，1991(上文)提出的)。利用AppliedBiosystem Inc.380B DNA合成仪制备寡核苷酸。将诱变反应产物转化到大肠杆菌MM294菌株(American Type Culture·Collection大肠杆菌33625)中。采用DNA测序方法验证所有突变体并且将分离到的DNA转化到枯草芽孢杆菌表达菌株BG2036(Yang，M.Y.，E.Ferrari和D.J.Henner，(1984)，“Cloning of the NeutralProtease Gene of Bacillus subtillis and the Use ofthe Cloned Gene to Create an In Vitro-derivedDeletion Mutation”，Journal of Bacteriology，Vol.160，pp.15-21)中。对于某些突变体，使用在217位氨基酸有移码终止密码子突变的经修饰的pSS-5产生尿嘧啶模板。设计寡核苷酸，使之在第217位恢复正确阅读框架并且还编码在199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219和220位上的随机替代(对于这些密码子的所有三个碱基，取所有四种核苷酸的等摩尔和/或可变量混合物)。根据其消化酪蛋白的能力鉴别出纠正移码终止并产生功能性酶的突变。采用DNA测序法确定随机替代。
实施例2
发酵
在1升LB葡萄糖肉汤中将含有所需枯草杆菌蛋白酶突变体的枯草芽孢杆菌细胞(BE2036)培养至对数生长中期，并以10升总体积接种到Biostat ED发酵罐(B.Braun Biotech，Inc.，Allentown，Pennsylvania)中。发酵培养基含有酵母提取物、淀粉、消沫剂、缓冲剂以及微量无机物(参见FERMENTATION：A PRACTICALAPPROACH，Ed，B.McNeil and L.M.Harvey，1990)。在发酵周期中保持肉汤恒定pH为7。加入氯霉素，对诱变质粒进行抗生素选择，将细胞在37℃培养过夜至A600约为60并收获细胞。
实施例3
纯化
采用下列步骤处理发酵肉汤以获得纯酶。离心去除肉汤中的枯草芽孢杆菌细胞，并且用100K截留膜去除细颗粒而使肉汤澄清。接着用l0K截留膜浓缩，并且流式透析以减低离子强度并利用0.025M MES缓冲液(2-(N-吗啉代)甲磺酸)调pH至5.5。将其加样到阳离子交换层析柱或者亲和吸附层析柱上并用NaCl或者聚乙二醇梯度从柱上洗脱对酶作进一步的纯化(参见Scopes，R.K.，PROTEINPURIFICATION PRINCIPLES AND PRACTICE Springer-Verlag，New York(1984)，引入本文作参考)。
利用pNA检测法(DelMar，E.G.，C.Largman，J.W.Brodrickand M.C.Geokas，ANAL.BiocHEM.，Vol.99，pp.316-320(1979)，引入本文作参考)确定在梯度洗脱期间收集之馏分的活性酶浓度。该检测法检测当酶水解可溶性合成底物，琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-N-酰基对硝基苯胺(sAAPF-pNA)时释放硝基苯胺的速率。在分光光度计上于410nm处检测经水解反应产生黄颜色的速率并且该速率与活性酶浓度成正比例。另外，检测280nm处的吸光率以确定总蛋白质浓度。计算活性酶/总蛋白的比例得到酶纯度，并用于鉴定收集的馏分作为贮存溶液。
为了避免贮存期间酶的自溶，向从层析柱上收集的馏分中加入等量的聚乙二醇。在纯化步骤完成之后用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)方法检查贮存酶溶液的纯度并且利用购自Sigma化学公司(St.Louis，Missouri)的胰蛋白酶抑制剂II型：火鸡卵清，以活性位点滴定方法测定绝对酶浓度。测得的转变因子将显示在该酶分子的各个位置上造成的何种变化会产生具有高于野生型的分解可溶性底物pNA活性的酶变体。
在准备使用时，将酶贮存溶液通过一个Sephadex-G25(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)大小排阻柱进行洗脱以去除聚乙二醇和交换缓冲剂。酶贮存溶液中的MES缓冲剂与含有0.01MCaCl2并且用HCl将pH调至8.6的0.1M Tris缓冲液三(羟甲基氨基甲烷)进行交换。所有试验均在温度稳定于25℃，pH8.6的Tris缓冲液中进行。
E.酶变体的特征
实施例4
模型表面制备
用购自于CPG Inc.(Fairfield，New Jersey)的氨基丙基控制的微孔玻璃(CPG)作为共价吸附购自于Bachem，Inc，(Torrence，California)之sAAPF-pNA底物的载体。该反应在二甲亚砜中完成并且以(1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳化二亚胺盐酸盐)(EDC)用作为偶联剂。反应完成(通过pNA检测法监控)后，除去过量的溶剂，并用二甲亚砜(DMSO)以及重蒸馏水淋洗CPG：sAAPF-pNA。随后在用N2净化的约70℃烘箱中干燥之。按照Brode，P.F.111，以及D.S.Rauch，“Subtilisin BPN′：Activity onan Immobilized Substrate”，LANGMUIR，Vol.8，p.1325-1329(1992)(引入本文作参考)描述的方法进行反应并制备固相化底物。
CPG表面具有62,000±7,000个pNA分子/μm2。其表面积将保持于由CPG Inc.报道的，公认为50.0m2/g的CPG表面积值不变。这表明所使用的将sAAPF-pNA加到CPG上的步骤没有损坏孔径结构(平均直径为486)。
实施例5
表面水解检测法
利用CPG：sAAPF-pNA，可在单一实验中检测出酶变体的吸附作用及对CPG结合之肽的水解作用。将小体积酶变体贮存溶液加到已经过除气的Tris缓冲液和CPG：sAAPF-pNA的烧瓶中。在肘节作用摇床上将烧瓶振荡培养90分钟，在此期间以不同时间间隔(例如在吸附水解的早期阶段例如前20分钟每次间隔2分钟，直到实验结束前每次间隔10分钟)关闭摇床。使CPG：sAAPF-pNA沉积并且从溶液中取样。按照Brode等人(1992，上文)所述方法完成实验程序并计算吸附和水解作用水平。
监测所有酶抵抗自溶作用的稳定性，并且在整个试验期间不应该显示有可估计到的自溶损失。因此，可以通过检测溶液损耗来确定酶的吸附作用。根据酶变体起始浓度与在各个不同时间点测出的浓度之间的差异算出被吸附的酶变体的量。根据在410nm处测出的一等份样品的吸光率读数以测出从表面水解的pNA量。将取样的量与留在烧瓶中的量相加计算出水解的pNA的总量。通过减去无酶存在时由pH＝8.6的Tris缓冲液水解的pNA的量校正该总量数值。依据酶效率不同，基底水解的量约为总水解量的7-29％。
实施例6
可溶性底物动力学分析
用DU-70分光光度计在410nm处检测作为时间函数的吸光率值的增加监测可溶性底物sAAPF-pNA的水解速率。每次动力学测定均保持恒定酶浓度，并且当底物浓度为90-700μM sAAPF-pNA时使酶浓度在6-10毫微摩尔的范围内。在900秒的时间内每秒钟检测一次吸光率，并将数据转到一张LOTUSTM扩大纸(LotusDevelopment Corporation，Cambridge，Massachusetts)上。采用标准的Lineweaver Burk分析法完成对动力学参数分析，其中将运转起始部分(通常是第一分钟)的数据与线性回归曲线相配合得到Vo。以标准的倒数方式用Vo和So作图得到KM和Kcat。
F.BPN′变体的实例
表2中列举了对表面结合之底物的吸附作用得以降低并且水解作用得以提高的本发明的BPN′变体。在描述特定突变时，首先给出野生型中出现的原有氨基酸，然后是其位置编号，第三是替代了的氨基酸。
表2
BPN′变体举例
-单突变-
Lys213Glu
Ala216Glu
Ala216Asp
Ala216Gly
Ser204Glu
Val203Glu
   -  双重突变  -
Lys213Glu＋Tyr217Leu
Ile205Leu＋Ala216Glu
Ile205Leu＋Ala216Asp
Pro210Ala＋Gly215Thr
Lys213Glu＋Ala216Glu
Tyr214Phe＋Tyr217Asn
Gln206Glu＋Ala216Glu
Ala216Glu＋Tyr217Leu
Gln206Glu＋Tyr217Leu
Gln206Glu＋Lys213Glu
         - 三重突变 -
Gln206Pro＋Gly211Ala＋Ala216Glu
Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu
Ile205Val＋Pro210Ala＋Lys213Glu
Gln206Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu
Gln206Glu＋Lys213Glu＋Tyr217Leu
              -  四重突变  -
Pro210Ala＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu
Gln206Glu＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu
Ser204Glu＋Gln206Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu
                -   五重突变   -Ile205Leu＋Pro210Ala＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu
Ser204Glu＋Gln206Glu＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋
                   Tyr217Leu
II.清洁组合物
在本发明另一个实施方案中，在用于清洁需要去除蛋白质污渍之各种各样表面的组合物中含有有效量的本发明的一种或多种酶变体。这样的清洁组合物包括用于清洁坚硬表面的形态不定(例如液体和颗粒)的去污组合物；用于清洁织物的形态不定(例如颗粒状的，液体和条状制剂)的去污组合物；碗碟洗涤组合物(形态不定)；形态不定(例如，洁牙液、牙膏和漱口药剂)的口腔清洁组合物；形态不定的假牙清洁组合物(例如液体或片剂)；以及形态不定(例如液体，片剂)的隐形眼镜清洁组合物。如本文使用，“酶变体的有效量”是指在特定的清洁组合物中获得必需的酶解活性所需的酶变体的量。本领域内普通技术人员很容易知道所述有效量，并且所述有效量取决于许多因素，例如所使用的稳定酶变体、清洁应用的对象、清洁组合物的特定组分、以及需要液体还是干燥(例如颗粒状、条状)组合物等等。本发明优选的清洁组合物包含约0.0001％-10％的一种或多种本发明的酶变体，较好是含约0.001％-1％，更优选的是含约0.01％-0.1％的酶变体。在下文中详细讨论其中应用了本发明酶变体的各种清洁组合物的几个实例。除非另有说明，本文使用的所有等份，百分数和比例都是按重量计算的。
如本文使用的，“非织物的清洁组合物”包括清洁坚硬表面的组合物，洗碗碟的组合物，口部清洁组合物，假牙清洁组合物以及隐形眼镜清洁组合物。
A.用于坚硬表面、碗碟和织物的清洁组合物
本发明的酶可用于期望有高泡沫产生和好的不溶性底物去除作用的任何去污组合物中。因此，本发明的酶变化可与各种常规成分一起使用从而提供全配方制造的坚硬表面清洁剂，碗碟洗涤组合物，织物洗涤组合物等等。这样的组合物可以是液体、颗粒、条形态的。可将这样的组合物配制成含有多至30％-60％重量的表面活性剂的流行的“浓缩”去污剂。
本文所述的清洁组合物可以并且较好含有阴离子、非离子、两性离子等表面活性剂。这样的表面活性剂通常以约占组合物5％至35％的量存在。
本文中使用的表面活性剂的非限制性的实例包括常规的C11-C18烷基苯磺酸盐以及低级和随意的烷基硫酸盐，通式为CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3 -M+)CH2CH3的C10-C18仲(2，3)烷基硫酸盐，其中x和(y＋1)是至少约7，较好是至少约为9的整数，并且M是可溶于水的阳离子，特别是钠，所述表面活性剂还包括C10-C18烷基烷氧基硫酸盐(尤其是EO1-5乙氧基硫酸盐)，C10-C18烷基烷氧基羧基盐(尤其是EO1-5乙氧基羧酸盐)，C10-C18烷基聚糖苷以及其相应的硫酸化聚糖苷，C12-C18α-磺化脂肪酸酯，C12-C18烷基以及烷基苯酚烷氧基化物(尤其是乙氧基化物和混合的乙氧/丙氧基化物)，C12-C18甜菜碱和硫代甜菜碱(“sultaines”)，C10-C18氧化胺等。本发明中优选的是烷基烷氧基硫酸盐(AES)以及烷基烷氧基羧酸盐(AEC)(依据制造商的要求，将所述的表面活性剂与前面所述的氧化胺和/或甜菜碱或硫代甜菜碱表面活性剂一起使用也是优选的)。其他常规使用的表面活性剂列于规范的教科书中。特别适用的表面活性剂包括在美国专利5,194,639(Connor等人，1993年3月16日公布，引入本文作为参考)中公开的C10-C18N-甲基葡糖酰胺。
可包含于本发明组合物中的适用于去污清洁组合物的多种其他成分包括其他的活性成分、载体、助溶剂、加工助剂、染料或色素、用于液体制剂的溶剂等。如果需要另外增加洗涤泡沫，则可将例如C10-C16烷醇酰胺的泡沫增进剂通常以约1％-约10％的水平掺入到组合物中。C10-C14单乙醇和二乙醇酰胺是这样的泡沫增进剂的一个典型类别的例子。将这样的泡沫增进剂与高泡沫添加表面活性剂例如上文中提到的氧化胺，甜菜碱以及硫代甜菜碱一起使用也是有利的。如果需要，也可通常加入大约0.1％到2％的可溶性镁盐例如MgCl2、MgSO4等以提供额外的泡沫发生。
本文所述的液体去污组合物可含有水和作为载体的其他溶剂。以甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇为代表的低分子量伯或仲醇是适用的。为了溶解表面活性剂可优选一水合醇，但也可使用多元醇例如那些含有约2-6个碳原子和约2-6个羟基的多元醇(例如，1，3-丙二醇、乙二醇、甘油和1，2-丙二醇)。该组合物可含有约5％-90％，通常约10％-50％的所述载体。
配制本发明的去污组合物较好在清洗操作期间使洗涤用水的pH将保持于大约6.8和大约11.0之间。为此通常在该pH范围内配制终产品。将pH值控制在推荐的使用水平上的技术包括使用缓冲液、碱、酸等以及使用本领域技术人员熟知的方法。
当配制本发明的硬表面清洁组合物和织物清洁组合物时，配制者可能希望使用含量为大约5％-50％重量比的各种助洗剂。典型的助洗剂包括1-10微米的蛭石，聚羧酸盐例如柠檬酸盐和氧化二琥珀酸盐，分层的硅酸盐、磷酸盐等。其他常规助洗剂列于标准配方集中。
同样地，配制者可能希望在这样的组合物中使用含量为大约0.001％-1％重量比的各种附加酶例如纤维素酶、脂酶、淀粉酶和蛋白酶。各种洗涤和织物护理酶是洗衣去污剂领域中熟知的。
在这样的组合物中可以使通常含量约为1％到15％重量比的各种漂白剂化合物，例如过碳酸盐、过硼酸盐等。如果需要，所述组合物还可以含有漂白活化剂例如四乙酰乙二胺，壬酰氧化苯磺酸盐等，这些也是本领域内已知的。其使用剂量通常在大约1％-10％重量比范围内。
在这些组合物中都可以以重量约占1％-35％的含量使用各种污斑释放剂尤其是阴离子寡聚酯型的污斑释放剂，各种螯合剂尤其是氨基磷酸盐以及乙二胺二琥珀酸盐，各种泥土污渍去除剂尤其是乙氧基化的四亚乙基五胺，各种分散剂尤其是多聚丙烯酸盐和多聚天门冬氨酸盐，各种增白剂尤其是阴离子增白剂，各种泡沫抑制剂尤其是硅酮和仲醇，各种织物柔软剂尤其是蒙脱石粘土等。规范的配方集以及公开的专利中包括对这样的常规材料的多方面详细描述。
本发明的清洁组合物中也可以使用酶稳定剂。这样的酶稳定剂包括丙二醇(较好为大约1％-10％)，甲酸钠(较好为大约0.1％-1％)以及甲酸钙(较好为大约0.1％-1％)。
1.硬表面清洁组合物
如本文使用，“硬表面清洁组合物”是指用于清洁坚硬表面例如地板、墙壁、浴室磁砖等的液体和颗粒状去污组合物。本发明所述的坚硬表面清洁组合物含有有效量的本发明的一种或多种酶变体，该组合物中活性酶重量较好约占0.001％-10％，更好是约占0.1％-5％，最好是约占0.05％-1％。除含有本发明的-种或多种酶变体以外，所述硬表面清洁组合物通常含有表面活性剂以及水溶性螯合助洗剂。然而，在某些特定产品如洗窗的喷雾清洁剂中，有时候不使用表面活性剂，因为它们在玻璃表面产生片状/条纹状残留物。
如果有表面活性剂成分，则其含量可以低至占本文所述组合物的0.1％，但通常情况是该组合物含有的表面活性剂为约0.25％-10％，较好约为1％-5％。
该组合物通常含有约0.5％-50％的去污助洗剂，较好是约1％-10％。
pH较好是在约8-12的范围内。如果需要调整，可使用例如NaOH，碳酸钠或盐酸等常规pH调节剂。
在该组合物中可以包含溶剂。适用的溶剂包括但不只限于甘油醚例如二甘醇-己基醚、二甘醇-丁基醚、乙二醇-丁基醚、乙二醇-己基醚、丙二醇-丁基醚、二丙二醇-丁基醚，以及二醇例如2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇和2-乙基-1，3-己二醇。如果使用这些溶剂，则通常其含量约为0.5％-15％，较好为大约3％-11％。
另外，如果将组合物以“足够强度”应用到表面上之后表面没有被漂清时，则可以在本发明组合物中使用高挥发溶剂例如异丙醇或乙醇以有利于组合物较快地从表面上蒸发。如果使用这些挥发性溶剂，则通常使用量约占组合物的2％-12％。
下面的实施例中举例描述了本发明硬表面清洁组合物的配制实施方案。
实施例7-12
液体硬表面清洁组合物
实施例编号成分                     7      8       9       10      11     12Lys213Glu              0.05    0.50    0.02    0.03    0.10   0.03Ile205Leu＋Ala216Asp    -       -        -       -     0.20   0.02Na2 DIDA*EDTA**                 -       -      2.90    2.90      -      -柠檬酸钠                -       -        -       -     2.90   2.90C12烷基苯磺酸钠       1.95     -      1.95      -     1.95     -C12烷基硫酸钠          -      2.20      -     2.20      -    2.20C12(乙氧基)***硫酸钠  -      2.20      -     2.20      -    2.20C12氧化二甲胺          -      0.50      -     0.50      -    0.50异丙基苯磺酸钠         1.30     -      1.30      -     1.30     -己基二甘醇-乙醚***     6.30    6.30    6.30    6.30    6.30   6.30水****                                平衡至100％
*       N-二甘醇-N，N-亚氨基二乙酸二钠
**      乙二胺二乙酸四钠
***     二甘醇-己基醚
****    所有配方的pH均调到7。
在实施例7-10中，用表2中描述的其他BPN′变体替代Lys213Glu，得到基本上类似的结果。
在实施例11-12中，用表2中描述的其他的BPN′变体-结合物替代Lys213Glu和Ile205Leu＋Ala216Asp，获得基本上同样结果。
实施例13-18
用于清洁硬表面和清除家庭霉菌的喷雾组合物
实施例编号成分                    13     14    15    16     17    18Lys213Glu＋Tyr217Leu   0.50   0.05  0.60  0.30   0.20  0.30Ala216Glu               -       -     -    -     0.30  0.10辛基硫酸钠             2.00   2.00  2.00  2.00   2.00  2.00十二烷基硫酸钠         4.00   4.00  4.00  4.00   4.00  4.00氢氧化钠               0.80   0.80  0.80  0.80   0.80  0.80硅酸盐(钠)             0.04   0.04  0.04  0.04   0.04  0.04香精                   0.35   0.35  0.35  0.35   0.35  0.35水                              平衡至100％
产品pH约为7。
在实施例13-16中，用表2中描述的其他BPN′变体替代Lys213Glu＋Tyr217Leu，基本上具有相同结果。
在实施例17-18中，用表2中描述的其他BPN′变体结合物替代Lys213Glu＋Tyr217Leu和Ala216Glu，获得了基本相同结果。
2.碗碟洗涤组合物
在本发明的另一实施方案中，碗碟洗涤组合物含有本发明的一种或多种酶变体。如本文中使用的“碗碟洗涤组合物”是指所有形式的用于清洁碗碟的组合物，其包括但不只限于颗粒状的和液体形式的。下面的实施例中描述了本发明的碗碟清洗组合物的具体配制方案。
实施例19-24
碗碟清洗组合物
实施例编号成分                    19     20    21    22    23    24Glu206Pro＋Gly211Ala＋Ala216Glu            0.05   0.50  0.02  0.40  0.10  0.03Ile205Leu＋Ala216Asp     -      -     -    -    0.40  0.02C12-C14N-甲基-
葡糖酰胺           0.90   0.90  0.90  0.90  0.90  0.90C12乙氧基(1)硫酸盐   12.00  12.00 12.00 12.00 12.00 12.002-甲基十一烷酸         4.50   4.50  4.05  4.50  4.50  4.50C12乙氧基(2)羧酸盐    4.50   4.50  4.05  4.50  4.50  4.50C12醇乙氧基化物       3.00   3.00  3.00  3.00  3.00  3.00C12氧化胺             3.00   3.00  3.00  3.00  3.00  3.00异丙基苯磺酸钠         2.00   2.00  2.00  2.00  2.00  2.00乙醇                   4.00   4.00  4.00  4.00  4.00  4.00Mg++(如MgCl2)        0.20   0.20  0.20  0.20  0.20  0.20Ca++(如CaCl2)        0.40   0.40  0.40  0.40  0.40  0.40水****                            平衡至100％
产品pH均调到7。
在实施例19-22中，用表2中描述的其他BPN′变体替代Gln206Pro＋Gly211Ala＋Ala216Glu获得了基本上同样的结果。
在实施例23-24中，合用表2中描述的其他BPN′变体替代Gln206Pro＋Gly211Ala＋Ala216Glu和Ile205Leu＋Ala216Asp，获得了基本上同样结果。
3.织物清洁组合物
在本发明的另一实施方案中，用于清洁织物的组合物含有一种或多种本发明的酶变体。如本文中使用的“织物清洁组合物”是所有形式的指用于清洁织物的去污组合物，包括但不限于颗粒，液体和直条形状的组合物。
a.颗粒状织物清洁组合物
本发明的颗粒状织物清洁组合物含有有效量的一种或多种本发明的酶变体，组合物中活性酶的重量较好约占0.001％-10％，更好是约占0.005％-5％，最好是约占0.01％-1％。除含有一种或多种酶变体以外，颗粒状织物清洁组合物通常还含有至少一种表面活性剂，一种或多种助洗剂，以及在某些情况下还含有漂白剂。
下面的实施例中描述了本发明的颗粒状织物清洁组合物的具体配制方案。
实施例25-28
颗粒状织物清洁组合物
实施例编号成分                        25    26    27    28Ala216Asp                  0.10  0.20  0.03   0.05Ala216Gly                   -     -    0.02   0.05C13直链烷基苯磺酸盐      22.00 22.00 22.00  22.00磷酸盐(如三聚磷酸钠)      23.00 23.00 23.00  23.00碳酸钠                    23.00 23.00 23.00  23.00硅酸钠                    14.00 14.00 14.00  14.00蛭                         8.20  8.20  8.20   8.20螯合剂(二亚乙基三胺五乙酸) 0.40  0.40  0.40   0.40硫酸钠                     5.50  5.50  5.50   5.50水                              平衡至100％
在实施例25-26中，用表2中描述的其他的BPN′变体替代Ala216Asp，获得了基本上相似结果。
在实施例27-28中，合用表2中描述的其他的任何BPN′变体替代Ala216Asp和Ala216Gly，获得了基本上相似结果。
实施例29-32
颗粒状织物清洁组合物
实施例编号成分                              29    30    31    32Lys2130lu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu  0.10  0.20  0.03  0.05Ile205Val＋Pro210Ala＋Lys213Glu   -     -    0.02  0.05C12烷基苯磺酸盐                12.00 12.00 12.00 12.00蛭石A(1-10微米)                 26.00 26.00 26.00 26.002-T基辛酸                        4.00  4.00  4.00  4.00C12-C14仲(2，3)烷基硫酸钠盐    5.00  5.00  5.00  5.00柠檬酸钠                         5.00  5.00  5.00  5.00荧光增白剂                       0.10  0.10  0.10  0.10硫酸钠                          17.00 17.00 17.00 17.00水和次要成分                            平衡至100％
在实施例29-30中，用表2中描述的其他BPN′变体替代Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu，得到基本上相似的结果。
在实施例31-32中，合用表2中描述的任何其他的BPN′变体替代Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu以及Ile205Val＋Pro210Ala＋Lys213Glu，得到基本上相似的结果。
b.液体织物清洁组合物
本发明的液体织物清洁组合物含有有效量的一种或多种本发明的酶变体，有效量按组合物中的活性酶重量计较好约为0.005％-5％，更好是约为0.01％-1％。通常所述液体织物清洁组合物还含有一种阴离子表面活性剂，一种脂肪酸，一种水溶性去污助洗剂和水。
下面实施例描述了本发明所述的液体织物清洁组合物的具体配制方案。
实施例33-37
液体织物清洁组合物
实施例编号成分                    33    24    25    36    37Pro210Ala＋Gly215Thr   0.05  0.03  0.30  0.03  0.10Pro210Ala＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu   -    -     -    0.01  0.20C12-C14烷基硫酸钠盐 20.00 20.00 20.00 20.00 20.002-T基辛酸              5.00  5.00  5.00  5.00  5.00柠檬酸钠               1.00  1.00  1.00  1.00  1.00C10醇乙氧基化物(3)   13.00 13.00 13.00 13.00 13.00单乙醇胺               2.50  2.50  2.50  2.50  2.50水/丙二醇/乙醇(100∶1∶1)        平衡至100％
在实施例33-35中，用表2中描述的其他的BPN′变体替代Pro210Ala＋Gly215Thr，得到基本相似的结果。
在实施例36-37中，任意合用表2中描述的其他的任何BPN′变体替代Pro210Ala＋Gly215Thr以及Pro210Ala＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu，得到基本相似的结果。
c.条状织物清洁组合物
适用于手洗去织物污斑的本发明所述的条状织物清洁组合物含有有效量的本发明的一种或多种酶变体，优选量为约占组合物重量的0.001％-1％，更优选的是约为0.01％-1％。
下列实施例中描述了本发明的条状织物清洁组合物的配制实施方案。
实施例38-41
条状织物清洁组合物
实施例编号成分                     38     39     40     41Lys213Glu＋hla216Glu     0.3     -     0.1    0.02Tyr214Phe＋Tyr217Asn      -      -     0.4    0.03C12-C16烷基硫酸Na盐   20.0   20.0   20.0   20.00C12-C14N-甲基葡糖酰胺  5.0    5.0    5.0    5.00C11-C13烷基苯磺酸Na盐 10.0   10.0   10.0   10.00碳酸钠                  25.0   25.0   25.0   25.00焦磷酸钠                 7.0    7.0    7.0    7.00三聚磷酸钠               7.0    7.0    7.0    7.00蛭石A(0.1-10μ)          5.0    5.0    5.0    5.00羧甲基纤维素             0.2    0.2    0.2    0.20聚丙烯酸盐(酯)(MW1400)   0.2    0.2    0.2    0.20椰子单乙醇酰胺           5.0    5.0    5.0    5.00增白剂，香料             0.2    0.2    0.2    0.20CaSO4                   1.0    1.0    1.0    1.00MgSO4                   1.0    1.0    1.0    1.00水                       4.0    4.0    4.0    4.00填充料*                         平衡至100％
*可选用常规材料例如CaCO3、滑石、粘土、硅酸盐等。
在实施例38-39中，用表2中描述的其他的BPN′变体替代Lys213Glu＋Ala216Glu，获得了相似的结果。
在实施例40-41中，合用表2中描述的其他任何BPN′变体替代Lys213Glu＋Ala216Glu以及Tyr214Phe＋Tyr217Asn，获得了基本上相似的结果。
B.其他的清洁组合物
除了上文中讨论的用于清洗硬表面、碗碟以及织物的清洁组合物以外，如果想要使不溶性底物水解，则可将本发明的一种或多种酶变体掺入到各种各样的其他清洁组合物中。这些其他清洁组合物包括但不只限于口腔清洁组合物，假牙清洁组合物以及隐形眼镜清洗组合物。
1.口腔清洁组合物
在本发明的另一实施方案中，适用于去除牙齿或假牙上的蛋白质污物的组合物中包含药物学上可接受量的本发明的一种或多种酶变体。如本文中如使用的，“口腔清洁组合物”是指洗牙水、牙膏、牙用凝胶体、牙粉、漱口液、口用喷洒液、口用凝胶、口香糖、糖锭、香粉、药片、生物胶、预防膏剂、假牙处理溶液等。本发明的清洗口腔组合物中较好含有占组合物重量约0.0001％-20％，更好约0.001％-10％，最好约0.01％-5％的本发明的一种或多种酶变体，以及药学学上可接受的载体。如本文中使用的“药学学上可接受的”是指该术语描述的药物、药剂或非活性成分适合于与人和低等动物组织接触使用而没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、过敏反应等，并具有合理的收益/风险比例。
通常，清洁口腔组合物中的口腔清洁成分的药物学上可接受的清洁口腔载体成分一般约占组合物重量的50％-约99.99％，较好是大约65％-99.99％，最好是大约65％-约99％。
可包含在本发明的清洁口腔组合物中的药学学上可接受的载体成分及其他非强制性使用的成分是本领域内技术人员熟知的。有关适用于口腔清洁组合物的各种组合物类型、载体成分以及非强制性使用成分，可参见美国专利5,096,700(Seibel，1992年3月17日公布)、美国专利5,028,414(Sampathkumar，1991年7月2日公布)以及美国专利5,028,415(Benedict，Bush和Sunberg，1991年7月2日公布)(所有文献引入本文作参考)。
下列实施例中描述了配制本发明清洁口腔组合物的实施方案。
实施例42-45
洗牙水组合物
实施例编号成分                               42      43      44     45Ile205Leu＋Pro210Ala＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu            2.000   3.500   1.500   2.000山梨醇(70％水溶液)               35.000  35.000  35.000  35.000PEG-6*                           1.000   1.000   1.000   1.000牙科磨料硅石**                  20.000  20.000  20.000  20.000氟化钠                            0.243   0.243   0.243   0.243二氧化钛                          0.500   0.500   0.500   0.500糖精钠                            0.286   0.286   0.286   0.286烷基硫酸钠(27.9％水溶液)          4.000   4.000   4.000   4.000辛香料                            1.040   1.040   1.040   1.040羧乙烯聚合物***                  0.300   0.300   0.300   0.300角叉莱胶****                     0.800   0.800   0.800   0.800水                                        平衡至100％
*       PEG-6＝分子量为600的聚乙二醇
**      由J.M.Huber提供的鉴定为Zeodent119的沉积硅石
***     由B.F.Goodrich化学公司提供的Carbopol。
****    由Hercules化学公司提供的lota角叉胶。
在实施例42-45中，用表2中描述的其他的BPN′变体替代Ile205Leu＋Pro210Ala＋Lys213Glu＋Ala216Glu＋Tyr217Leu，获得了基本上相似的效果。
实施例46-49
漱口组合物
实施例编号成分          46      47      48      49Ala216Gly    3.00    7.50    1.00    5.00SDA 40醇     8.00    8.00    8.00    8.00香料         0.08    0.08    0.08    0.08乳化剂       0.08    0.08    0.08    0.08氟化钠       0.05    0.05    0.05    0.05甘油        10.00   10.00   10.00   10.00甜味剂       0.02    0.02    0.02    0.02苯甲酸       0.05    0.05    0.05    0.05氢氧化钠     0.20    0.20    0.20    0.20染料         0.04    0.04    0.04    0.04水                     平衡至100％
在实施例46-49中，用表2中描述的其他的BPN′变体替代Ala216Gly，获得了基本上相似的结果。
实施例50-53
糖锭组合物
实施例编号成分                    50     51     52     53Tyr214Phe＋Tyr217Asn   0.01   0.03   0.10   0.02山梨醇                17.50  17.50  17.50  17.50甘露醇                17.50  17.50  17.50  17.50淀粉                  13.60  13.60  13.60  13.60甜味剂                 1.20   1.20   1.20   1.20香料                  11.70  11.70  11.70  11.70色素                   0.10   0.10   0.10   0.10玉米糖浆                        平衡至100％
在实施例50-53中，用表2中描述的其他的BPN′变体替代Tyr214Phe＋Tyr217Asn，获得了基本上相似的结果。
实施例54-57
口香糖组合物
实施例编号成分                              54     55    56      57Ile205Val＋Pro210Ala＋Lys213Glu  0.03   0.02   0.10   0.05山梨醇晶体                      38.44  38.40  38.40  38.40胶载体*                        20.00  20.00  20.00  20.00山梨醇(70％水溶液)              22.00  22.00  22.00  22.00甘露醇                          10.00  10.00  10.00  10.00甘油                             7.56   7.56   7.56   7.56香料                             1.00   1.00   1.00   1.00
*    由L.A.Dreyfus公司提供。
在实施例54-57中，表2中描述的其他BPN′变体用于替代Ile205Val＋Pro210Ala＋Lys213Glu，得到基本相似结果
2.假牙清洗组合物
在本发明另一实施方案中，用于清洗从口腔中拿出之假牙的清洗假牙组合物含有本发明的一种或多种酶变体。所述假牙清洗组合物含有有效量的本发明的一种或多种酶变体以及一种假牙清洗载体，本发明的一种或多种酶变体的量较好约占组合物重量的0.0001％-50％，更好是约占0.001％-35％，最好是约占0.01-20％。各种假牙清洗组合物形式例如泡腾片剂等是本领域熟知的(参见例如美国专利5,055,305，Young，引入本文作参考)，并且通常掺入一种或多种本发明的酶变体，以便去除假牙上的蛋白质污物。
下文实施例中描述了本发明假牙清洗组合物具体配制方案。
实施例58-61
清洗假牙的双层泡腾片剂
实施例编号成分                 58     59     60    61酸性层Ala216Glu             1.0   1.5   0.01   0.05酒石酸               24.0  24.0  24.00  24.00碳酸钠                4.0   4.0   4.00   4.00氨基磺酸             10.0  10.0  10.00  10.00PEG20,000             4.0   4.0   4.00   4.00碳酸氢钠             24.5  24.5  24.50  24.50过硫酸钾             15.0  15.0  15.00  15.00酸性焦磷酸钠          7.0   7.0   7.00   7.00煅制的硅石            2.0   2.0   2.00   2.00TAED*                7.0   7.0   7.00   7.00蓖麻油酰硫代琥珀酸酯  0.5   0.5   0.50   0.50香料                  1.0   1.0   1.00   1.00
实施例编号成分                  58      59      60     61碱性层一水合过硼酸钠       32.0    32.0    32.00  32.00碳酸氢钠             19.0    19.0    19.00  19.00EDTA                  3.0     3.0     3.00   3.00三聚磷酸钠           12.0    12.0    12.00  12.00PEG 20,000            2.0     2.0     2.00   2.00过硫酸钾             26.0    26.0    26.00  26.00碳酸钠                2.0     2.0     2.00   2.00煅制的硅              2.0     2.0     2.00   2.00染料/香料             2.0     2.0     2.00   2.00
*   四乙酰乙二胺
在实施例58-61中，用表2中描述的其他的BPN′变体替代Ala216Glu，得到基本相似的结果。
3.隐形眼镜清洗组合物
在本发明的另一实施方案中，隐形眼镜清洗组合物含有本发明的一种或多种酶变体。所述隐形眼镜清洗组合物含有有效量的一种或多种本发明的酶变体以及一种隐形眼镜清洗载体，其中本发明的一种或多种酶变体较好占组合物重量的大约0.01％-50％，更好约占0.01％-20％，最好约占1％-5％。各种隐形眼镜清洗组合物形式例如片剂，液体等是本领域内熟知的(例如参见美国专利4,863,627,Davies，Meaken和Rees，1989年9月5日公布；美国再颁专利32,672Huth，Lam和Kirai，1988年5月24日再公布；美国专利4,609,493，Schifer，1986年9月2日公布；美国专利4,690,793，Ogunbiyi和Smith，1987年9月1日公布；美国专利4,614,549，Ogunbiyi，Riedhammer和Smith，1986年9月30日公布；以及美国专利4,285,738，Ogata，1981年8月25日公布，所有文献引入本文作参考)并且通常掺入一种或多种本发明的酶变体以去除隐形眼镜上的蛋白质污物。
下面的实施例中描述了本发明的隐形眼镜清洗组合物的具体配制方案。
实施例62-65
隐形眼镜酶促清洗溶液
实施例编号成分                        62     63      64     65Ile205Leu＋Ala216Asp       0.01    0.5    0.1    2.0葡萄糖                    50.00   50.0   50.0   50.0非离子型表面活性剂(聚氧    2.00    2.0    2.0    2.0乙烯-聚氧丙烯共聚体)阳离子型表面活性剂(聚氧    1.00    1.0    1.0    1.0乙烯-烷基苯基醚硫酸酯钠盐氯化钠                     1.00    1.0    1.0    1.0硼砂                       0.30    0.3    0.3    0.3水                              平衡至100％
在实施例62-65中，用表2中描述的其他BPN′变体替代Ile205Leu＋Ala216Asp，获得基本相似的结果。
虽然已经描述了本发明的特定实施方案，但对本领域内技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的前提下对本发明进行的各种改变和修饰应是显而易见的。待批权利要求欲复盖所有落入本发明范围内的这些修饰。
                              序列表(1)一般信息：
(i)申请人：
(ii)发明题目：降低了吸附作用和增强了水解作用的丝氨酸蛋
              白酶
(iii)序列数：1
(iv)相关地址：
   (A)地址：THE PROCTER & GAMBLE COMPANY
   (B)街道：11810 EAST MIAMI RIVER ROAD
   (C)城市：ROSS
   (D)州：OH
   (E)国家：USA
   (F)邮编：45061
(v)计算机可读形式：
   (A)介质类型：软盘
   (B)计算机：IBM PC兼容机
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25
(vi)现行申请资料：
   (A)申请数量：
   (B)申请日：1993.3.1
   (C)类别：
(viii)代理人/代理机构资料：
   (A)姓名：CORSTANJE，BRAHM J.
   (B)登记号：34,804
(ix)通讯资料：
   (A)电话：513-627-2858
   (B)传真：513-627-0260(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：275个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1               5                   10                  15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
        20                  25                  30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala
    35                  40                  45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His
50                  55                  60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65                  70                  75                  80VaL Leu GLy VaL Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
            85                  90                  95Gly Ala Asp Gly Ser ely Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
        100                 105                 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly
    115                 120                 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala
130                 135                 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala ALa Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145                 150                 155                 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala
            165                 170                 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
        180                 185                 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr
    195                 200                 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser
210                 215                 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225                 230                 235                 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
            245                  250                255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala
        260                 265                 270Ala Ala Gln
    275

Claims (19)

1.含有野生型氨基酸序列的BPN′变体，其特征在于在野生型氨基酸序列的第199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、218、219或者220位中的一个或多个位置上的氨基酸被替代，其中
a.199位的替代氨基酸是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Ash、Ser、Asp或者Glu；
b.200位的替代氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
c.201位的替代氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
d.202位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
e.203位的替代氨基酸是Met、Cys、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
f.204位的替代氨基酸是Glu；
g.205位的替代氨基酸是Leu、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
h.206位的替代氨基酸是Pro、Asn或者Ser；
i.207位的替代氨基酸是Asp或者Glu；
j.208位的替代氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
k.209位的替代氨基酸是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
1.210位的替代氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
m.211位的替代氨基酸是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
n.212位的替代氨基酸是Gln、Ser、Asp或者Glu；
o.213位的替代氨基酸是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
p.214位的替代氨基酸是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或者Glu；
q.215位的替代氨基酸是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
r.216位的替代氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
s.218位的替代氨基酸是Glu；
t.219位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；以及
u.220位的替代氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或者Glu；其特征在于BPN′变体与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′相比其降低了对不溶性底物的吸收作用并且增加了对不溶性底物的水解作用。
2.根据权利要求1的BPN′变体，其特征在于：
  a.206位的替代氨基酸是Asn或者Ser；
  b.211位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
  c.214位的替代氨基酸是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或者Glu；
  d.215位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu。
3.根据权利要求2的BPN′变体，其特征在于用Gly替代216位的Ala。
4.根据权利要求2的BPN′变体，其特征在于199、200、201、202、203、205、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、219或者220中任一位置的替代氨基酸是Asp或者Glu；并且204或218位置的替代氨基酸是Glu；其中优选地是在199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212或者215位中一个或多个位置上替代，更优选地是在200、201、202、205或207位中一个或多个位置上替代。
5.具有单一的氨基酸替代的根据权利要求1的BPN′变体，其特征在于所述替代是
  a.在213位用Glu替代Lys，
  b.在216位用Glu替代Ala，
  c.在216位用Asp替代Ala，
  d.在204位用Glu替代Ser，或者
  e.在203位用Glu替代Val。
6.含有野生型氨基酸序列的BPN′变体，其特征在于该野生型氨基酸序列的第199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220位中的两个或多个位置被替代，其中
a.199位的替代氨基酸是Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
b.200位的替代氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
c.201位的替代氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
d.202位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
e.203位的替代氨基酸是Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
f.204位的替代氨基酸是Asp或者Glu；
g.205位的替代氨基酸是Leu、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
h.206位的替代氨基酸是Pro、Asn、Ser、Asp或者Glu；
i.207位的替代氨基酸是Asp或者Glu；
j.208位的替代氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
k.209位的替代氨基酸是Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
l.210位的替代氨基酸是Ala、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
m.211位的替代氨基酸是Ala、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
n.212位的替代氨基酸是Gln、Ser、Asp或者Glu；
o.213位的替代氨基酸是Trp、Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
p.214位的替代氨基酸是Phe、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
q.215位的替代氨基酸是Thr、Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
r.216位的替代氨基酸是His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
s.217位的替代氨基酸是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Thr、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu：
t.218位的替代氨基酸是Gln、Ser、Asp或者Glu；
u.219位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；以及
v.220位的替代氨基酸是Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；其特征在于BPN′变体与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′相比，其降低了对不溶性底物的吸附作用，并且增加了对不溶性底物的水解作用。
7.根据权利要求6的BPN′变体，其具有双氨基酸替代。
8.根据权利要求7的双氨基酸替代的BPN′变体，其特征在于该双替代是：
a.用Ala替代210位的Pro，用Thr替代215位的Gly；
b.用Phe替代214位的Tyr，用Asn替代217位的Tyr；
c.用Glu替代206位的Gln，用Glu替代216位的Ala；
d.用Glu替代216位的Ala，用Leu替代217位的Tyr；
e.用Glu替代206位的Gln，用leu替代217位的Tyr；
f.用Glu替代206位的Gln，用Glu替代213位的Lys；
g.用Glu替代213位的Lys，用Leu替代217位的Tyr；
h.用Leu替代205位的Ile，用Glu替代216位的Ala；或者i.用Leu替代205位的Ile，用Asp替代216位的Ala；
9.根据权利要求7的BPN′变体，其特征在于
a.206位的替代氨基酸是Asn或者Ser；
b.210位的替代氨基酸是Gly、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
c.211位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；
d.214位的替代氨基酸是Leu、Ile、Val、Met、Cys、Ala、His、Pro、Gly、Gln、Asn、Asp或者Glu；以及
e.215位的替代氨基酸是Pro、Gln、Asn、Ser、Asp或者Glu；且其中替代较好发生在199、200、201、202、205、207、208、209、210、211、212或者215位中的二个或多个位置，更好是在200、201、202、205或207位中的二个或多个位置。
10.根据权利要求9的BPN′变体，其特征在于199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或者220位中任一位的替代氨基酸是Asp或者Glu。
11.根据权利要求10的BPN′变体，其特征在于用Glu替代213位的Lys，并且用Glu替代216位的Ala。
12.根据权利要求6的BPN′变体，其具有三个氨基酸替代。
13.根据权利要求12的具有三个氨基酸替代的BPN′变体，其特征在于该三个替代是：
a.用Pro替代206位的Gln，用Ala替代211位的Gly，并且用Glu替代216位的Ala；
b.用Val替代205位的Ile，用Ala替代210位的Pro，并且用Glu替代213位的Lys；
c.用Glu替代206位的Gln，用Glu替代216位的Ala，并且用Leu替代217位的Tyr；
d.用Glu替代206位的Gln，用Glu替代213位的Lys，并且用Leu替代217位的Tyr；或者
e.用Glu替代213位的Lys，用Glu替代216位的Ala，并且用Leu替代217位的Tyr。
14.根据权利要求6的BPN′变体，其具有四或五个氨基酸替代。
15.根据权利要求14的具有四个替代的BPN′变体，其特征在于该四个替代是：
a.用Ala替代210位的Pro，用Glu替代213位的Lys，用Glu替代216位的Ala，并且用Leu替代217位的Tyr；
b.用Glu替代206位的Gln，用Glu替代213位的Lys，用Glu替代216位的Ala，并且用Leu替代217位的Tyr；或者
c.用Glu替代204位的Ser，用Glu替代206位的Gln，用Glu替代216位的Ala，并且用Leu替代217位的Tyr。
16.根据权利要求l4的具有五个替代的BPN′变体，其特征在于这五个替代是：
a.用Leu替代205位的Ile，用Ala替代210位的Pro，用Glu替代213位的Lys，用Glu替代216位的Ala，以及用Leu替代217位的Tyr；或者
b.用Glu替代204位的Ser，用Glu替代206位的Gln，用Glu替代213位的Lys，用Glu替代216位的Ala，并用Leu替代217位的Tyr。
17.选自于硬表面清洁组合物、碗碟清洗组合物、口腔清洁组合物、假牙清洗组合物以及隐形眼镜清洁组合物的清洁组合物，其特征在于该清洁组合物含有权利要求1、7、12或14的BPN′变体以及清洁组合物载体。
18.硬表面清洁组合物，其含有权利要求1、7、12或14的BPN′变体以及硬表面清洁载体。
19.突变的BPN′基因，其编码权利要求1、7、12或14的BPN′变体。
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