CN1130462C - 碱性蛋白酶 - Google Patents
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Abstract
一种具有下列特性的碱性蛋白酶;一种编码该蛋白酶的基因;一种产生该蛋白酶的微生物和含有该蛋白酶的洗涤组合物;(i)在pH4~13的广泛范围内起作用并且在pH6~12达到最适pH值时的活性的80%或更大;(ii)当在40℃处理30分钟时,对pH值范围6~11稳定;(iii)等电点大约为8.9~9.1;以及(iv)具有不被油酸抑制的消化酪蛋白的活性。本发明的碱性蛋白酶对各种表面活性剂高度稳定,对脂肪酸有抗性,并且表现为对氧化剂的高度稳定性,因而可用作自动洗碗机洗涤剂和衣用洗涤剂的酶,两种洗涤剂均含有漂白组分。
Description
技术领域
本发明涉及一种用作酶掺入到洗涤剂中的碱性蛋白酶;一种编码该酶的基因;一种产生该酶的微生物;和一种含有该酶的洗涤剂组合物。
技术背景
蛋白酶被广泛地用在各种洗涤剂中,例如衣用洗涤剂;化妆品组合物;浴用添加剂;食品修饰剂;以及药物如消化辅助药和消炎药。
用于洗涤剂的蛋白酶最大量地按工业规模生产,因此占商品供应的主要部分。上述蛋白酶的实例包括Alcalase和Savinase(NovoNordisk公司的产品)、Maxacal(Genencor公司的产品)、Blap(Henkel公司的产品)、和蛋白酶K(KAP,Kao联合公司的产品)。
同时,进行了许多尝试以改善用在洗涤剂中酶类的特性。例如,日本专利申请公开(kokai)6-70765号公开了一种对热和表面活性剂高度稳定的酶。日本专利申请公开(kokai)9-121855号公开了一种对如角蛋白等不溶蛋白起作用并且具有高度专一活性的酶。日本专利申请公开(kokai)5-211868和9-121856号公开了一种在低温度范围具有优异活性的酶。欧洲专利0130756号公开了一种增强酶对氧化剂稳定性的方法。
在许多情况下,衣服上的污渍包括多种非蛋白诸如脂类和固体颗粒的组分。因此,对上述复杂的污渍需要用优良去垢性的洗涤剂。为了满足该需求,一般来说洗涤剂中掺入各种酶类和表面活性剂。
然而,尽管掺入了各种酶类,但假如存在复杂的污渍时,酶类不稳定以及不表现稳定和足够的活性,酶类的作用就不能完全发挥。在这一点上普通酶类并不令人满意。
发明公开
鉴于前面已描述,本发明者发现了一种碱性蛋白酶,该蛋白酶甚至在高浓度的脂肪酸存在下也具有稳定的降解酪蛋白的活性,并且甚至在复杂污渍存在条件下,如含有蛋白和皮脂的污渍,表现出优异的去垢性。
相应地,本发明的一个方面提供一种具有下列物理化学特性的碱性蛋白酶:
(i)起作用的pH范围
在4-13的广泛pH范围起作用并且在6-12的pH范围内有在最适pH值时活性的80%或更多;
(ii)pH范围的稳定性
在6-11pH范围内当在40℃下处理30分钟时,表现稳定;
(iii)等电点
等电点为大约8.9-9.1;以及
(iv)脂肪酸的影响
降解酪蛋白活性不被油酸所抑制。
本发明的另一方面,提供一种编码如上所述的碱性蛋白酶的基因。
本发明的再一方面,提供一种产生如上所述的碱性蛋白酶的微生物。
本发明的再一方面,提供一种含有如上所述的碱性蛋白酶的洗涤剂组合物。
附图简述
图1显示pH对碱性蛋白酶KP43活性的影响。图2显示pH对碱性蛋白酶KP43稳定性的影响(40℃,30分钟)。图3显示pH对碱性蛋白酶KP43稳定性的影响(10℃,24小时)。图4显示温度对碱性蛋白酶KP43活性的影响。图5显示温度对碱性蛋白酶KP43稳定性的影响。图6显示氧化剂(50mM过氧化氢)对碱性蛋白酶KP43活性的影响。图7显示KP9860蛋白酶的N-末端序列和其部分降解产物。图8显示根据KP9860蛋白酶的N-末端序列设计的引物序列。图9显示57bp的PCR扩增片段和设计的引物。
实施本发明的最佳方式
本发明的碱性蛋白酶具有上面所述的从(i)至(iv)的物理化学特性。这些特性中,特性(iv)尤为重要。所述的碱性蛋白酶在10mM的油酸、皮脂组分的存在下具有降解酪蛋白的活性,其活性与在缺乏油酸时一样高。
优选的本发明的碱性蛋白酶(v)具有大约43,000的估计分子量,该值由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定。
特别优选的是除了(i)至(v)特性外,还具有如下所述的从(vi)至(ix)特性的碱性蛋白酶。
(vi)作用温度和最适的温度
在60℃-70℃的最适温度下起作用,并且也在低于20℃或更低的温度下作用;
(vii)金属离子的影向
活性被Hg2+和Cu2+抑制而热稳定性被Ca2+所增强;
(viii)抑制剂的影响
活性不被乙二胺四乙酸(EDTA)和对氯汞苯甲酸(PCMB)所抑制,但被二异丙基氟代磷酸(DEP)和苯甲基磺酰氟(PMSF)所抑制。
(ix)表面活性剂的影响
活性不被线性烷基苯磺酸钠、聚氧乙烯烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、α-烯属磺酸钠或α-磺基脂肪酸酯所抑制。
优选的本发明的碱性蛋白酶具有由序列No.1或2、或其中一个或多个氨基酸被缺失、替换或添加的上述序列所显示的氨基酸序列。序列No.1与序列No.2不同,在于在序列No.2中的第3位的赖氨酸被缺失。在序列Nos.1和2中的Xaa指的是一种任意的氨基酸。在序列No.2中每个部位的Xaa的优选氨基酸在下列表中显示。
表
位置 位置
24 Ser或Asn 30 Gly或Asp
33 Asn或Thr 47 Ala或Val
48 Lys或Ser 54 Gly或Arg
71 Pro或Leu 75 Gln或Leu
90 Ile或Val 103 Gln或Lys
106 Lys或Thr 129 Lys或Gln
131 Ala或Lys 132 Thr或Val
133 Ser或Arg 134 Thr或Ser
147 Ile或Lys 149 Arg或Lys
161 Glu或Thr 166 Val或Leu
173 Lys或Asn 184 Gln或Glu
188 Phe或Tyr 189 Ala或Val
190 Ile或Ala 195 Leu或His
287 Ser或Ala 307 Gly或Ser
325 Tyr或Phe 370 Gly或Arg
432 Phe或Tyr 502 Ile或Val
532 Ser或Ala 542 Ser或Thr
585 Gln或Arg 592 Thr或Ser
593 Ser或Ala 595 Tyr或Phe
596 Asn或Asp 597 Asp或Asn
612 Ala或Ser 633 Thr或Asn
在本发明碱性蛋白酶中的缺失、替换和添加没有特别限制。然而,在序列No.1或2中显示的氨基酸序列优选地70%或更高量的保守性,更优选的80%或更高。特别优选的90%或更高的保守性。
该碱性蛋白酶的实例包括具有由序列号3、4或5、或其中一个或多个氨基酸被缺失、替换或添加的上述序列所显示的氨基酸序列。
通过培养芽孢杆菌属的产碱性蛋白酶的微生物,然后从培养液中收集该酶,可生产本发明的碱性蛋白酶。根据本发明产生碱性蛋白酶的微生物的实例包括芽孢杆菌属的野生型菌株和一种含有编码具有上述氨基酸序列的肽的基因的转化体。野生型菌株的实例包括KP-43、KP-1790和KP-9860。这些菌株的细菌学特点在以下显示。
表1-a
KP43 KP1790 KP9860
A.形态学特征(a)格兰氏染色(b)氨肽酶(c)运动性(d)鞭毛(e)孢子(类型、形状、位点、肿大)B.生理学特征(a)硝酸盐还原性(b)吲哚的产生(c)生长pH范围(d)对氯化钠的抗性(e)生长温度范围(f)β-半乳糖苷酶(g)Arginine dihydrolase(h)Lysine dihydrolase(i)氧化酶(j)柠檬酸利用性(k)尿素的利用性(l)过氧化氢酶(m)从葡萄糖和硝酸盐产生气体(n)在厌氧条件下生长(o)V-P测验 | 阳性未确定有有绿毛鞭毛形成孢子,椭圆形,中心,无肿大阴性阴性能在pH 6.2-11.7下生长,pH 8-10生长良好不能生长在≥7% NaCl下10-40℃阳性阴性阴性阳性阴性阴性阳性阴性阴性阴性 | 阳性未确定有有绿毛鞭毛形成孢子,椭圆形,中心,无肿大阴性阴性能在pH 6.2-11.7下生长,在pH8.5-10下生长良好不能生长在≥7% NaCl下10-40℃阳性阴性阴性阳性阴性阴性阳性阴性阴性阴性 | 阳性未确定有有绿毛鞭毛形成孢子,椭圆形,中心至末端,肿大阴性阴性能在pH 6.2-10.0下生长,大约在pH 9下生长良好不能生长在≥7% NaCl下20-40℃阳性阴性阴性阳性阴性阴性阳性阴性阴性阴性 |
(续表1-b)
表1-b
KP43 KP1790 KP9860
(p)从糖类的酸产生D-葡萄糖L-阿拉伯糖D-木糖D-甘露醇D-半乳糖蔗糖D-甘露糖肌醇D-山梨糖醇海藻糖乳糖甘油麦芽糖D-果糖棉子糖蜜二糖淀粉 | +--+±++-+±--++-++ | ±--+-+±--+--±+--+ | +--+-++--+--++--+ |
根据上述细菌学特征,参考在“Bergery”氏系统细菌学手册的有关描述,检测三种菌株(Williams和Wilkins Co.,1984),可认为它们属于芽孢杆菌属。然而,这些菌株是新颖的微生物,因为这些物种的特性不完全与那些属于芽孢杆菌属的已知物种的特性相匹配。因此,该三种菌株以Bacillus sp.KSM-KP43(FERM BP-6532)、Bacillus sp.KSM-KP1790(FERM BP-6533)和Bacillus sp.KSM-KP9860(FERM BP-6534)的名称保藏在通商产业省工业技术院生命工学和人体技术研究所(日本茨城县筑波市东1丁目1番3号,305-0046),最初保藏日期1996年9月18日。
为了利用上述菌株生产本发明的碱性蛋白酶,将菌株接种在含有能同化的碳源、氮源和必需营养成分的培养基中,通过常规方法培养。
按照常规应用于收集和纯化的普通酶的方法,从上面得到的培养液中,进行目标碱性蛋白酶的收集和纯化。例如,通过离心法和过滤法从培养液中分离细胞,然后通过常规纯化方法从该上清液中得到目标碱性蛋白酶。上述得到的酶液可按上述方法应用,或通过熟知的方法进一步纯化和结晶。
另外,本发明的碱性蛋白酶可通过下列步骤产生:得到编码该碱性蛋白酶的基因;使用该基因制备重组载体;培养获得的转化体;然后从培养产物中收集该目标碱性蛋白酶。
编码本发明碱性蛋白酶的基因可从上述三种菌株中的任一种克隆。克隆可通过熟知的方法进行。这些方法的实施例包括(1)鸟枪方法,该方法包括应用合适的限制性核酸内切酶,通过完全或部分消化染色体DNA,制备DNA片段;将该片段结合到合适的载体中;然后导入到大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中表达,(2)合成合适的引物,通过PCR克隆靶基因的方法。
本发明碱性蛋白酶的核苷酸序列的实例在Nos.3~5中显示。该核苷酸序列并不局限于序列Nos.3~5,能接受的序列可以包括编码在序列 No.1或2的氨基酸序列的核苷酸序列,也包括编码其中一种或多种氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列的核苷酸序列。这些序列中,由序列Nos.3~5表示的核苷酸序列,或者其中一个或多个氨基酸被缺失、替换或添加的上述序列是优选的。在这些情况中,优选的缺失、替换或添加在上述氨基酸序列的变异体中产生。
为了制备包括上述编码碱性蛋白酶基因的重组载体,所述的基因可结合到适于在目的宿主中进行基因表达的任意载体中。这些载体的实例包括pUC18、pBR322和pUC19,这是在大肠杆菌用作宿主时;以及枯草芽孢杆菌用作宿主时的pUB110。
使用由此获得的重组载体,通过诸如原生质体法或感受态细胞法等常规方法,转化宿主。虽然对宿主没有具体的限制,微生物是优选的。实施例包括诸如属于芽孢杆菌属微生物的革兰氏阳性细菌、如大肠杆菌的革兰氏阴性菌、属于糖酵母属的酵母,以及属于曲霉的真菌。
为了通过培养所得到的转化体生产本发明的碱性蛋白酶,可使用上述野生菌株所采用的方法相一致的方法,进行培养、收集和纯化。
如上面所述,本发明的碱性蛋白酶具有对碱性条件优异的抗性,并且甚至在脂类存在下拥有优异的蛋白酶活性。因此,该碱性蛋白酶是可用于掺入到各种洗涤剂组合物的酶。
对于掺入到洗涤剂组合物中的上述碱性蛋白酶的数量,没有具体限制,优选地以1kg洗涤剂组合物计量为0.1-5000U,特别优选的是每kg洗涤剂组合物中加入1-500U。
熟知的洗涤剂组分可以掺入到含有碱性蛋白酶的本发明的洗涤剂组合物中。例如,可以采用在WO 94/26881所描述的组分(p5页,右上角栏,14行-右下角栏,29行)。
表面活性剂以0.5%-60%总重量比的用量掺入到洗涤剂组合物中(自此之后简化为“%”),掺入到粉状洗涤剂组合物中特别优选的用量为10%-45%,而掺入列液体洗涤剂组合物中特别优选的用量为20%-50%。当本发明的洗涤剂组合物用作漂白洗涤剂组合物或用于自动洗碗机的洗涤剂组合物时,一般掺入表面活性剂的用量为1%-10%,优选地为1%-5%。
二价金属离子捕捉剂以0.01%-50%的用量掺入,优选地为5%-40%。
碱性剂和无机盐以用量0.01%-80%掺入,优选地为1%-40%。
抗再沉积剂以用量0.001%-10%掺入,优选地为1%-5%。
洗涤剂组合物可以含有除了本发明的碱性蛋白酶之外的酶类。实施例包括纤维素酶、淀粉酶、原果胶酶、果胶酶、脂酶、半纤维素酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖氧化酶和胆固醇氧化剂。这些酶类以用量0.001%-5%掺入,优选地为0.1%-3%。
诸如过氧化氢或过碳酸盐的漂白剂优选地以用量1%-10%掺入。当漂白剂掺入时,漂白活化剂以用量0.01%-10%掺入。
掺入到组合物中荧光剂的实施例包括联苯化合物,如CinopearlCBS-X和1,2-二苯乙烯化合物如DM-型荧光剂。优选地荧光剂的用量为0.001%-2%。
上面所描述的洗涤剂组合物可以加工成诸如液体、粉末和颗粒等各种形态。洗涤剂组合物可用于洗衣房、自动洗碗机、排水管、和牙科,也可用作漂白剂。
实施例
实施例1(产生碱性蛋白酶的微生物的筛选)
土壤样品(1g)悬浮在生理盐水溶液(10ml)中,80℃加热处理10分钟,接着接种到用于产生碱性蛋白酶微生物的液体富集培养基中,该培养基含有下列组合物,然后在20℃培养。在相同的培养基中重复亚培养富集大约三次后,培养过的产物涂布到用于判别蛋白酶产生的平板上,然后在20℃培养5-7天。挑选由降解脱脂乳形成周围透明区的集落,用作收集产蛋白酶的微生物。通过上述过程,得到Bacillus sp.KSM-KP43株、KSM-KP1790株和KSM-KP9860株,用作产生碱性蛋白酶的微生物。表2筛选用液体富集培养基的组成(pH 11)磷酸二氢钾 0.1%硫酸镁 0.02%酵母提取物(Difco) 0.05%角蛋白(Tokyo Kasei) 1.0%葡萄糖 0.5%碳酸钠 0.3%筛选用琼脂平板培养基营养琼脂(Difco) 2.3%脱脂乳(Difco) 0.3%碳酸钠 1.0%
实施例2
在实施例1获得的Bacillus sp.KSM-KP43菌株接种在液体培养基中,该液体培养基包含蛋白胨S(1%)、酵母提取物(0.05%)、磷酸钾(0.1%)、硫酸镁(0.02%)、葡萄糖(分别灭菌)(1%)和碳酸钠(分别灭菌)(0.5%),然后在30℃培养24小时。在上清液中的酶浓度大约为1.5U/L。在搅拌下4℃离心分离的上清液中,加入粉末硫酸铵,以达到90%的饱和浓度。在4℃搅拌条件下维持溶液一个完整的白天和晚上,然后离心收集产生的沉淀物。得到的沉淀物溶解在10mM的Tris-盐酸缓中液(pH 7.5),其中含有5mM的氯化钙中,然后用缓冲液透析。接着,透析过的液体被加到DEAE-葡聚糖FF柱(Pharmacia的产物),该FF柱已事先用含有5mM氯化钙的10mMTris-盐酸缓中液中(pH 7.5),因此收集非吸附的级分。分级分离过的液体通过含有2mM氯化钙的50mM HEPES缓中液(pH 7.5)透析,然后用相同缓中液平衡过的SP-Sepharose FF柱中,然后收集非吸附级分之后稍微抽提的活性级分。当以15%重获率的活性级分用作样品时,进行SDS-聚丙烯酰胺电泳,结果对各个酶获得单一泳带。
实施例3
获得的Bacillus sp.KSM-KP1790菌株和KSM-KP9860菌株培养在实施例2中所用的相同培养基中,然后按实施例2相同方式纯化的碱性蛋白酶。
实施例4
检测在实施例2和3中获得的碱性蛋白酶的酶特性。这些实验的方法和结果见下面描述。
I.用于实验的材料和方法
(1)活性测定方法
(a)酪蛋白用作底物的方法
1mL 50mmol/L含有1%(w/v)酪蛋白(Hammerstein:MerckInc.的产品)的各种缓冲液维持在40℃ 5分钟后,将0.1mL酶溶液加到该溶液中,然后在40℃温育10分钟。加入2mL的TCA溶液(0.11mol/L三氯乙酸:0.22mol/L乙酸钠:0.33mol/L乙酸)以终止反应,然后将混合液在室温下放置10分钟。接着,过滤酸变性的蛋白(No.2滤纸:Whattmann的产品)。往0.5mL滤液中加入2.5mL碱性铜试剂(1%(w/v))酒石酸钠钾:1%(w/v)硫酸铜:2%(w/v)碳酸钠、0.1mol/L氢氧化钠=1∶1∶100(v/v)),该溶液在30℃维持10分钟后,加入0.25mL稀释过的酚试剂(酚试剂(kanto化学公司的产品)用去离子水稀释2倍),在30℃维持30分钟后,该溶液在660nm下进行吸光值测定。下列溶液用作空白:与上面所述的酶反应系统和反应终止溶液混合,然后加入酶溶液。
酶活性的一个单位(P.U)定义为在以上反应条件下,每分钟释放与1mmol酪氨酸相等的酸可溶性的蛋白降解产物的酶量。
(b)使用合成寡肽作底物的方法
0.05mL的50mmol/L合成寡肽溶液(溶于二甲基亚砜中的琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-亮氨酸对硝基苯胺)与0.9mL的100mmol/L硼酸缓冲液(pH 10.0,含2mmol/L氯化钙)混合,该溶液在30℃维持5分钟后,加入0.05mL的酶溶液,然后在30℃温育10分钟。加入2ml 5%(w/v)柠檬酸终止反应,然后在420nm测定吸光率。
酶活性的一个单位(U)定义为在以上反应条件下每分钟释放与1mmol酪氨酸相等的酸可溶解的蛋白降解产物的酶量。
(c)用血红蛋白作底物的方法
按照Anson的方法(M.L.Anson,普通生理学杂志,22,79(1983)),用尿素变性牛血清血红蛋白,然后用氢氧化钠调pH至10.5。0.1mL的酶溶液(1.0×10-5~1.0×10-3A.U)加入到0.5mL的底物溶液中(对血红蛋白来说2.2%),得到的溶液在25℃下温育10分钟。往得到的溶液中加入1.0mL的4.9%三氯乙酸以终止反应。完成反应后,进行离心(3,000rpm,10分钟),然后根据Folin-Lowry法定量测定在上清液中蛋白降解产物(O.H.Lowry等,生物化学杂志,193,265(1951))。
酶活性的一个单位(A.U)定义为在上述反应条件下每分钟释放与1mmol酪氨酸相等的酸可溶性的蛋白降解产物的酶量。
(2)最适pH
0.1mL酶溶液(3.0×10-5mP.U)被加入到1mL含有1%(w/v)酪蛋白的50mmol/L Britlon-Robinson缓中液中,然后根据酪蛋白法测定活性。
(3)pH稳定性
酶溶液(8.0×10-4mP.U)混合到Britton-Robinson缓冲液中(20mmol/L,含2mmol/L氯化钙),接着在40℃处理30分钟或在10℃处理24小时。冰冷却后,该处理过的溶液用50mmol/L硼酸缓冲液稀释40倍,然后按照酪蛋白用作底物的方法测定残留活性。
(4)最适温度
0.1mL酶溶液(2.0×10-5mP.U.)被加入到1mL含有1%(w/v)酪蛋白的50mmol/L硼酸缓中液中(pH10.0),根据酪蛋白法在温度10-80℃测定酶活性。
在两种系统中,即存在5mmol/L氯化钙和不存在5mmol/L氯化钙时进行活性测定。
(5)热稳定性
在两种系统中即存在和缺乏5mmol/L氯化钙情况下,酶溶液(2.5×10-4mP.U)被加到20mmol/L的硼酸缓中液中(pH 10.0),然后在合适的温度下热处理10分钟。用水冷却后,该处理过的溶液用50mmol/L硼酸缓冲液(pH 10.0)稀释5倍,然后用酪蛋白作为底物测定残留活性。
(6)金属离子的影响
酶溶液(4.0×10-4mP.U.)被加到含有1mmol/L不同金属盐的20mmol/L硼酸缓冲液(pH 10.0)中,然后该产生溶液在30℃温育20分钟。该溶液用50mmol/L硼酸缓冲液(pH 10.0)稀释5倍,接着用酪蛋白作为底物测定活性。
(7)抑制剂的影响
酶溶液(1.0×10-3mP.U.)被加到含有各种抑制剂的10mmol/L磷酸缓中液(pH 7.0),以达到预先确定的浓度,然后该溶液在30℃温育20分钟。接着,该溶液用去离子水稀释20倍,用酪蛋白作为底物测定剩余活性。
(8)表面活性剂的影响
酶溶液(7.0×10-4mP.U.)被加到含有量为1%的溶解性表面活性剂的100mmol/L硼酸缓冲液中,然后产生的溶液在40℃温育4小时。该溶液用50mmol/L硼酸缓冲液(pH 10.0)稀释20倍,用酪蛋白作为底物测定剩余活性。
(9)氧化剂的影响(过氧化氢)
2.7mL含有过氧化氢和氯化钙的Britton-Robinson缓冲液(终浓度:50mmol/L过氧化氢,2mmol/L氯化钙,20mmol/L Britton-Robinson)(pH 8.0),在30℃维持15分钟,然后加入0.3mL的酶溶液。过了反应时间后,取0.8mL产生溶液的样品到预先准备的含有5μL过氧化氢酶(Boehringer Mannheim Co.:20mg/L)的试管中,因此终止氧化反应。每个样品用2mmol/L氯化钙适当稀释,按照合成寡肽用作底物的方法测定剩余活性。
(10)脂肪酸的影响
应用含有1%(w/v)酪蛋白作为底物溶液的50mM磷酸缓冲液(pH7),在0-10mM油酸钠存在下20℃进行反应15分钟,然后用酪蛋白作为底物测定活性。
II.结果
(1)最适pH
检测pH对三种蛋白酶(KP43、KP1790和KP9860)的影响。图1显示在每个和最佳pH相关活性(100%)正常化的pH值的KP43活性,表明本发明蛋白酶的最佳工作pH范围为6-12。因此,这些酶在十分宽工作pH范围表现为高降解蛋白活性。
(2)pH稳定性
放在40℃30分钟或10℃24小时后,在pH值范围测定KP43的剩余活性。图2和3显示处理前酶活性(100%)有关的正常化剩余活性。结果显示本发明的酶类在40℃处理30分钟后,在pH6-12范围稳定,加入钙离子在pH 5下改善酶的稳定性。相似地,该结果显示本发明的酶类在10℃处理24小时后在5-12广泛的pH范围稳定。
(3)最适温度
用酪蛋白作为底物,检测温度对蛋白酶的影响。图4显示KP43在一定温度范围的活性,该值随缺乏钙离子最高活性(100%)标准化。结果表示对所有三种蛋白酶来说,在缺乏钙离子时最适温度为60℃,而存在钙离子时最适温度为70℃。因此,结果显示最适温度通过加入钙离子向上漂移,用作洗涤剂的常规蛋白酶的情况也是如此。
(4)热稳定性
在30-80℃温度范围进行热处理10分钟(pH 10.0,存在和缺乏5mol/L氯化钙),然后测定剩余活性。图5显示在每个处理温度下KP43的剩余活性,该值随处理前活性(100%)标准化。结果表示所述的蛋白酶在缺乏氯化钙时温度直至60℃仍稳定,而加入氯化钙(5mmol/L)对温度稳定性有影响,使其向上移动大约10℃。与商业途径购得的洗涤剂酶类相比较,这些酶具有高度的温度稳定性,即,与Esperase的稳定性相比较,在商业途径购得的酶类中表现为最优异的温度稳定性。
(5)金属离子的影响
在20mmol/L硼酸缓中液(pH 10)中,用各种金属盐(1mmol/L)在30℃下处理3种蛋白酶20分钟,然后测定剩余活性。该剩余活性用相同方法处理但未加金属离子所获得的蛋白酶活性标准化(100%)(见表3)。结果显示该活性被氯化汞和硝酸银所抑制,但该活性对其他金属盐类极其稳定。表3
处理条件:1mM金属盐,20mM硼酸盐缓中液(pH 10.0)30℃,20
金属盐(1mM) | 剩余活性(%)KP43 KP1790 KP9860 |
未加AgNO3NiCl2CaCl2CoCl2FeCl3ZnCl2CuCl2HgCl2MgCl2 | 100 100 10066 70 4592 95 9697 95 10191 101 9893 113 9685 94 9191 96 9438 37 3392 103 100 |
分钟
(6)不同抑制剂的影响
检测了一般酶抑制剂对本发明碱性蛋白酶的影响。各种抑制剂被加到10mmol/L磷酸盐缓冲液中(pH 7.0),以达到预先设定的浓度,得到的溶液在30℃温育20分钟,自此之后测定剩余活性。该剩余活性用缺乏抑制剂的上述相同方法处理所获得的蛋白酶活性标准化(100%)(参见表4)。结果表明所有3种蛋白酶活性被二异丙基氟磷酸(DFP)、苯甲基磺酰氟和胰凝乳蛋白酶抑制剂所抑制,这些都是熟知的丝氨酸蛋白酶抑制剂。因此,可以认为本发明的蛋白酶在其活性中心拥有丝氨酸残基。相反,未发现据报道抑制丝氨酸蛋白酶来源于放线菌纲的antipine和亮氨酰抑蛋白酶肽的影响。表4
EDTA:乙二胺四乙酸 (Sigma)EGTA:乙二醇四乙酸 (Sigma)DTT:二硫苏糖醇 (Sigma)PCMB:对氯汞苯甲酸 (Sigma)NEM:N-乙基顺丁烯二酰亚胺(Sigma)DEP:二异丙基氟磷酸 (Sigma)PMSF:苯甲基磺酰氟 (Sigma)
抑制剂 | 剩余活性(%) | |||
浓度(mM) | KP43 | KP1790 | KP9860 | |
freeEDTAEGTA邻菲咯啉DTTPCMBNEMDEPPMSF胰凝乳蛋白酶抑制剂Antipine亮氨酰抑蛋白酶肽E-64弹性酶抑制剂 | -555515110.10.10.10.10.1 | 10011092100104125971408710310210499 | 1009791103102115100170879910199102 | 10010190100105126100160809793103102 |
(7)表面活性剂的影响
每种蛋白酶用在0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH 9.0)的1%各种表面活性剂40℃处理4小时,然后测定剩余活性。剩余活性用没有处理的情况下的酶活性标准化(100%)(参见表5),结果表明该3种酶对典型的表面活性剂线性烷基苯磺酸盐(LAS)极其稳定。因此,可以认为这些酶可用作含有表面活性剂的洗涤剂组分。表5
处理条件:1%表面活性剂,100mM硼酸缓中液(pH10.0)40℃,
表面活性剂(浓度:1%) | 剩余活性KP43 KP1790 KP9860 |
无表面活性剂线性烷基苯磺酸钠(LAS)聚氧乙烯钠烷基硫酸酯(ES)十二烷基磺酸钠(SDS)α-烯属磺酸酯钠(AOS)烷基硫酸钠(AS)α-磺基脂肪酸酯(α-SFE)Softanol 70H | 100 100 100100 88 100101 102 104104 97 103100 111 100113 107 107112 113 105109 109 104 |
4小时
(8)氧化剂的影响
每种蛋白酶用含有过氧化氢(pH 8.0)的50mmol/L Britton-Robinson缓冲液30℃处理,然后随着反应时间测定剩余活性。如在图6所示,KP43表现为比商业途径购得的Savinase或KAP更高的稳定性,并且显示与Durazyme(Novo Nordisk)一样高的稳定性,Durazyme是应用蛋白工程技术开发的破坏对Savinase氧化剂抗性的酶。
(9)脂肪酸的影响
如在表6所示,本发明的碱性蛋白酶活性不被皮脂的组分之一油酸所抑制。表6
存在脂肪酸时的相对活性(%)
油酸浓度(mM)
0 1 2 5 10KP43蛋白酶 100 100 100 103 119KP1790蛋白酶 100 100 100 103 121KP9860蛋白酶 100 100 100 100 106
实施例5(克隆编码KP9860蛋白酶的基因)
(1)KSM-KP9860基因组DNA的制备
KSM-KP9860菌株在液体培养基中(0.5%葡萄糖、0.2%蛋白胨-S、0.05%酵母提取物、0.1%KH2PO4·7H2O、0.26%NaCO3:pH9.0)(500mL),30℃培养2天,然后由离心法收集细胞。通过Saito和Miura(生物化学生物物理学报72,619(1963))的方法,从所获得的细胞中制备基因组DNA。
(2)KP9860蛋白酶的有限蛋白水解
1)KP9860蛋白酶的变性
KP9860蛋白酶(5mg/mL) 45μL
PMSF(100mM) 20μL
EDTA(200mM) 10μL
SDS(0.08mg/mL) 25μL
具有上述组分的蛋白酶溶液在沸水中加热10分钟。蛋白酶溶液用乙酸铵(2mM)透析,用该方法移去SDS、EDTA和PMSF,然后冷冻干燥。接着,冻干的蛋白酶溶解在蒸馏水中(100μL),至此用作变性蛋白的样品。
2)通过胰蛋白酶的有限蛋白水解
变性的蛋白样品 100μL
胰蛋白酶(1μg/mL,sigma) 100μL
1M Tris-HCl(pH7.5) 50μL
蒸馏水 750μL
在含有上述组分的溶液中,胰蛋白酶与1)中制备的变性蛋白在冰中反应3个小时。加入300μL SDS(0.08mg/mL)、100μL EDTA(200mM)和200μL的PMSF(100mM)后,在沸水中热处理3分钟终止有限的蛋白水解。
通过对乙酸铵(2mM)的透析,移去SDS、EDTA和PMSF,然后所述的溶液冷冻干燥。接着,冷冻干燥物溶解在蒸馏水中(100μL),至此用作SDS-PAGE的样品。
3)部分降解产物的重新获得
在2)中获得的样品用12% J型制备凝胶(Bio-Rad的产品)进行SDS-PAGE。蛋白泳带通过快速CBB染色溶液(Bio-Rad的产品)染色检测。含有蛋白泳带的凝胶用剃刀切下,然后将凝胶条在1.5mL离心压碎成碎片。用于SDS-PAGE的缓冲液(组分:甘氨酸14.4%(w/v)、Tris 3.03%、SDS(Bio-Rad的产品)10%),以5倍体积加入到压碎的凝胶中,在室温下搅拌该混合液,至此抽提蛋白泳带。抽提液对乙酸铵(2mM)透析。然后冷冻干燥。冷冻干燥过的样品用在476A型蛋白序列仪(应用生物系统公司的产品)上测定N-末端的序列。
所获得的N-末端序列在图7显示。
(3)PCR
合成了相应于所获得的N-末端序列+链和-链的5′末端20-30个核苷酸的引物。应用模板DNA(100ng)、引物(20pmol)和PwoDNA聚合酶(Boehringer Mannheim公司的产品),在100-μL反应体系中进行PCR反应。当进行反相PCR时,在50-μL反应系统中用ExpandTM长模板PCR体系(Boehringer Mannheim公司的产品)进行。用9860-N2和9860-25k-RV这些引物进行PCR,产生一条527bp的DNA片段。
(4)PCR产物的亚克隆
用高纯度PCR产物纯化试剂盒(Boehringer Mannheim公司的产品)纯化PCR产物,然后用连接试剂盒Ver.2(Takara公司的产品),16℃反应过夜使PCR产物插入到pUC18的Sma I位点。混合得到的重组质粒和感受态细胞大肠杆菌JM 109菌株(Takara公司的产品),将混合物进行热休克(42℃,45秒),然后转化到大肠杆菌JM109细胞中。往细胞中加入LB。在37℃维持1小时后,混合物涂到含有IPTG(0.1mM,Sigma)、X-gal〔0.004%(w/v),Sigma〕和氨苄青霉素(50μg/mL,Sigma)的LB平皿上。在37℃下培养过夜,选出生长的白色集落,即为具有重组质粒的转化体。
(5)核苷酸序列的测定
在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB中,转化体在37℃下培养过夜,然后通过离心法收集细胞。应用高纯度质粒分离试剂盒(Boehringer Mannheim公司的产品)获得重组的质粒。通过使用引物和DNA测序试剂盒(PERKIN ELMER公司的产品),在20μL反应体系中进行测序用PCR、所获得的重组质粒(1μg)被用作模板DNA。反应产物通过应用快速离心柱(Boehringer mannheim公司的产品)纯化,然后用离心蒸发机干燥。使用377型DNA测序仪(应用生物系统公司的产品)对上述处理过的样品进行分析。
通过PCR获得的该DNA片段拥有的氨基酸序列与KP-9860蛋白酶的N-末端序列相匹配,而观察过的序列与形成诸如枯草芽孢杆菌蛋白酶等碱性蛋白酶活性中心的3个氨基酸(Asp、His、Ser)中,近Asp和His的共同序列相匹配。因此,可以认为该DNA片段是KP-9860蛋白酶基因的一部分。
(6)DNA杂交
用EcoR I、Sac I、Kpn I、Hind III、BamH I、Xho I、Pst I和Bgl II处理KP9860的染色体。使用所获得的527bp DNA作探针进行DNA杂交,因此检测互补的区域。
结果,除了Kpn I处理的泳道外的各泳道中观察到杂交带。
(7)反向PCR
应用根据获得的527bp序列合成的引物(1-4(图9))进行反向PCR。使用限制性内切酶,即EcoRI、HindIII、PstI、和BglII完全消化KP-9860的染色体,然后使用连接试剂盒Ver.2(Takara公司的产品)处理每个样品以环化。每种产生的反应混合液用作反向PCR的模板DNA。应用上面所述的模板DNA(0.1μg)、引物1和4(分别为10pmol)和扩增长模板PCR体系试剂盒进行PCR反应(条件;(94℃-10秒、60℃-30秒、68℃-4分钟)×10个循环;(94℃-10秒、60℃-30秒、68℃-4分钟+20×循环数)×20个循环;68℃-7分钟和4℃-1分钟)。另外,使用来源于EcoRI消化的染色体的模板DNA(0.1μg)、引物2和3(分别为10pmol)和扩增长模板PCR体系试剂盒,进行PCR(条件如上面所描述)。所产生的扩增DNA片段通过用高纯度PCR产物纯化试剂盒纯化,然后用DNA钝化试剂盒(Takara公司的产品)把末端转变成钝端。每种获得的DNA片段与SmaI消化的pUC18混合,该混合液用连接试剂盒Ver.2处理。如上面所述,大肠杆菌JM109菌株被重组质粒转化,所获得的重组质粒用作测序用的模板DNA。由此,测定了所扩增的DNA片段的核苷酸序列。
(8)KP-9860蛋白酶基因的完整核苷酸序列的分析
序列测定的结果表明KP-9860蛋白酶基因含有编码1917bp、639个氨基酸残基的开读框(ORF),并且该OFR含有一个与纯化的KP9860蛋白酶的N-末端序列相匹配的区域(NDVARHIVKADVAQSSYGLY)。从N-末端序列判别,推导出KP9860蛋白酶基因的突变区为1302bp,编码434个氨基酸残基(序列数3,分子量4.5310Da)。ORF的上游,推断所观察到序列中拥有一个启动子区(-35区:ttgtgt,-10区:tacgat)和一个核糖体结合位点(SD序列:aggagt)。终止密码子(taa)的下游,有一个颠倒的重复区,具有自由能为-26.2kcal/mol,推断其为终止子。
重复实施例5的方法,由此分析KP-43蛋白酶和KP-1790蛋白酶的每个基因的完整核苷酸序列和氨基酸序列。结果在序列Nos.4和5中显示。
实施例6
清洗测验
根据JIS K 3371的方法进行洗涤测验。其组合物在表7显示的洗涤剂溶解在含有71.2mg CaCO3/L(4°DH)的水中,从调整浓度,往洗涤剂溶液中加入每种蛋白酶,根据Anson-Hemoglobin方法调整碱性蛋白酶的浓度至40mAPU/L(见表8)。
衬衫的领子(穿了3天)用作样品。作为比较,领子的布料剪成大约8cm×8cm的大小,使用Terg-O-Tometer(UeshimaSeisakusyo)添加酶或不添加酶的情况下,该布料在15℃和100rpm清洗10分钟。清洗和干燥后,比较成对的领子布料(15对)。并由视觉判别法评价。当污渍几乎完全被清洗掉时,设定评价值为5,而当污渍难以清洗掉时,设定评价值为1,然后计算15个样品的总分。清洁力指数以未加酶的洗涤剂组合物的清洁力作为100,每种组合物的分数值表示。结果在表8显示。表7
(重量%)
化合物(%) | 洗涤剂A | 洗涤剂B | 洗涤剂C |
LASASAEAEPAES脂肪酸盐沸石碳酸钠碳酸钾非晶型硅酸盐晶型硅酸盐亚硫酸钠硫酸钠AA-MA柠檬酸PEG单乙醇胺乙醇水 | 23.04.05.03.022.015.03.07.04.02.02.05.02.03.0 | 4.05.020.02.50.58.05.0balance | 20.02.020.07.02.023.010.02.07.0 |
形式 | G* | L** | G* |
使用浓度 | 20g/30L | 20g/30L | 40g/30L |
清洗后pH | 10.7 | 9.2 | 8.0 |
*)G代表颗粒。
**)L代表液体。
LAS:烷基苯磺酸线性钠(自由酸掺入到液体洗涤剂中)
AS:烷基硫酸盐
AE:聚氧乙烯月桂醚(平均EO添加4摩尔)
AEP:聚氧乙烯聚氧化丙烯月桂醚(平均EO添加8摩尔,平均PO
添加3摩尔)
AES:烷基硫酸醚(平均EO添加2.5摩尔)
脂肪酸:棕榈油衍生的脂肪酸钠盐
沸石:沸石4A,平均颗粒体积3μm
碳酸钠:致密灰
非晶型硅酸盐:JIS2号硅酸钠
晶型硅酸盐:粉末SKS-6(Hoechst Tokuyama公司的产品),
平均颗粒体积15μm
AA-MA:Sokalan CP5,丙烯酸-马来酸共聚物(BASF产品)
PEG:聚乙二醇,平均分子量8,000表8
蛋白酶 | 清洁力指数 | |
洗涤剂A | ||
发明1的洗涤剂 | 杆菌sp.KSM-KP43(样品2) | 106 |
发明2的洗涤剂 | 杆菌sp.KSM-KP1790(样品3) | 106 |
发明3的洗涤剂 | 杆菌sp.KSM-KP9860(样品3) | 105 |
比较洗涤剂1 | Savinase 120T type White(Novo Nordisk) | 103.5 |
比较洗涤剂2 | Durazym 6.0T(Novo Nordisk) | 103.5 |
比较洗涤剂3 | 无 | 100 |
表8说明,甚至在相同的活性条件下,与含有常规蛋白酶的洗涤剂相比较,含有本发明的酶的洗涤剂组合物(洗涤剂A)表现为更超级的清洁力。洗涤剂B和C也表现为本发明的优异清洁力。
实施例7
根据日本专利申请公开(kokai)62-257990所披露的方法,使用纯化的本发明蛋白酶样品制备颗粒产品,该蛋白酶样品来源于Bacillussp.KSM-KP43、KSM-KP1790、或KSM-KP9860并且在实施例2或3中制备。该颗粒产品(6APU/g)(按重量计为1份)掺入到每种具有在表9中显示组合物的洗涤剂中(按重量计为100份),由此获得本发明的洗涤剂组合物。当该洗涤剂为颗粒型时,由游离组分的颗粒洗涤剂基本原料即酶、PC、AC-1和AC-2与颗粒化酶、颗粒化PC、颗粒化AC-1和颗粒化AC-2混合而制备上述洗涤剂。每种洗涤剂以使用浓度溶于含有71.2mg CaCO3/L(4°DH)的水中,然后按实施例6所描述的方法清洗衣领。在此产生的洗涤剂表现为优异的清洗能力,用作衣用洗涤剂。表9
组分(%) | 本发明的洗涤剂 | |||||||||
4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | |
LAS-2 | 20 | 20.5 | 12 | 5 | 10 | |||||
LAS-3 | 15 | |||||||||
AS-2 | 5 | 10 | 20 | |||||||
SAS | 3 | |||||||||
AOS | 3 | |||||||||
SFE | 8 | |||||||||
脂肪酸盐 | 2 | 6 | 4 | 10 | 3 | 3 | 2 | 1.5 | ||
AES-2 | 20 | |||||||||
AE-3 | 3 | 10 | ||||||||
AE-4 | 3 | 3 | 15 | 15 | 3 | 15 | ||||
AE-5 | 2 | 20 | 20 | 25 | ||||||
AG | 5 | 7 | ||||||||
沸石 | 30 | 18 | 15 | 15 | 10 | 20 | ||||
吸附油的载体 | 10 | 12 | ||||||||
晶型硅酸盐 | 20 | |||||||||
非晶型硅酸盐 | 12 | 1 | 8 | 10 | 5 | |||||
STPP | 25.5 | 20 | ||||||||
碳酸钠 | 10 | 27 | 25 | 10 | 10 | 15 | 17.5 | 0.1 | ||
碳酸钾 | 3 | 2 | 5 | |||||||
亚硫酸钠 | 2 | 2 | 1 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | ||||
硫酸钠 | 4.5 | 1.5 | 1 | 11 | 8 | 10 | ||||
柠檬酸钠 | 4 | 2 | 5 | 1.5 | 1 | 1 | ||||
NTA | 2 | |||||||||
单乙醇胺 | 4 | 5 | 6 | |||||||
PAA | 1 | 1.5 | 3 | |||||||
AA-MA | 3 | 3 | 5 | |||||||
CMC | 2 |
组分(%) | 本发明的洗涤剂 | |||||||||
4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | |
PEG | 5 | 2 | 2 | 2 | 2 | 1.5 | ||||
PVP | 2 | |||||||||
荧光染料 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
香水 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
水 | 4 | 5 | 3 | 0.5 | 6 | 1 | 5 | 43.7 | 38.2 | 30.2 |
乙醇 | 5 | 5 | 5 | |||||||
丙二醇 | 2 | 5 | 5 | |||||||
酶 | 2 | 2 | 2 | 3 | 3 | 2 | 2 | 0.1 | 0.2 | 0.2 |
PC | 3 | 3 | 10 | 3 | ||||||
AC-1 | 2 | |||||||||
AC-2 | 1 | |||||||||
总计 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
形式 | G* | G* | G* | G* | G* | G* | G* | L** | L** | L** |
使用浓度 | 20g/30L | 20g/30L | 20g/30L | 20g/30L | 20g/30L | 20g/30L | 20g/30L | 20mL/30L | 20mL/30L | 20mL/30L |
*)G代表颗粒
**)L代表液体
LSA-2:用48%NaOH中和的烷基苯磺酸(C10-C14烷基链)
LSA-3:用50%NaOH中和的烷基苯磺酸(C10-C14烷基链)
AS-2:Dovanol 25硫酸钠盐(C12-C15硫酸盐)
SAS:C13-C18烷烃磺酸钠
AOS:α-烯属磺酸酯钠盐
SFE:棕榈油磺基脂肪酸甲酯钠盐
脂肪酸盐:棕榈酸钠
AES-2:聚氧乙烯烷基(C12-C15)醚硫酸钠(平均EO添加
2摩尔)
AE-3:C12-C13乙醇的EO加合物(平均3摩尔)
AE-4:C12-C15乙醇的EO加合物(平均7.2摩尔)
AE-5:C12-C15次级乙醇的EO加合物(平均7摩尔)
AG:烷基(衍生于棕榈油)葡糖苷(平均聚合化程度为1.5)
吸收油载体:非晶型硅铝酸钠,油吸收率为235mL/100g
晶型硅酸盐:SKS-6(δ-Na2Si2O5,晶型成层硅酸盐,平均颗粒
大小20μM)
非晶型硅酸盐:JIS No.1硅酸钠
STPP:三聚磷酸钠
NTA:次氮基三乙酸酯钠
PAA:聚(丙烯酸)钠盐,平均分子量为12,000
AA-MA:丙烯酸/马来酸共聚物
CMC:羧甲基纤维素钠
PEG:聚乙二醇,平均分子量6,000
PVA:聚乙烯吡咯烷酮,平均分子量为40,000,K值为26-35
荧光染料:Tinopal CBS和Whitex SA(1∶1(重量)),仅
Cinopeanl掺入到液体洗涤剂中
香水:一种在日本专利申请公开(kokai)No.8-239700披露的
香水组合物
酶:Lipolase 100T、Termamyl 60T和KAC 500(Kao联合
公司的产品)1∶1∶1(以重量计)
PC:过碳酸钠,平均颗粒大小400μm,用偏硼酸钠包被
AC-1:四乙酰乙二胺
AC-2:月桂酰氧基苯磺酸钠
实施例8
在表10显示的组分中,用搅拌法混和过碳酸钠和碳酸钠(致密灰)往混合物中加入聚丙烯酸钠和线性烷基苯磺酸钠(或非离子表面活性剂或月桂酰羟苯磺酸钠)的40%水溶液。接着,来源于Bacillus sp.KSM-KP43并在实施例7中制备的碱性蛋白酶颗粒产物被加到混合物中。所得到的混合物均匀搅拌,由此制备漂白剂。衣领浸入到每种漂白剂的0.5%水溶液中20℃30分钟,然后在Terg-O-Tometer中用洗涤剂A(实施例6)以20℃ 100rpm清洗10分钟。所得到的漂白剂具有优异的漂白能力,被用作衣用漂白剂。表10
(重量%)
组分 | 本发明的漂白剂 | |||
14 | 15 | 16 | 17 | |
过碳酸钠1)碳酸钠(致密灰)离子表面活性剂2)非离子表面活性剂3)聚丙烯酸钠4)月桂酰基氧基苯磺酸钠 | 80.016.02.0-1.0- | 80.012.02.0-1.04.0 | 80.016.0-2.01.0- | 80.012.0-2.01.04.0 |
Bacillus sp.KSM-KP43的碱性蛋白酶(实施例7) | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
1)颗粒大小:500-700μm
2)烷基苯磺酸线性钠(C12-C14)
3)聚氧乙烯烷基醚(C12-C14烷基,平均EO添加12摩尔)
4)平均分子量8,000
实施例9
重复实施例8的方法,由此制备用于自动洗碗机具有在表11中显示组合物的洗涤剂组合物。在下列条件下测定所获得组合物的清洗能力。所获得的洗涤剂拥有优异的清洁能力,并用于自动洗碗机的洗涤剂。表11
(重量%)
组分 | 本发明的洗涤剂 | |||
18 | 19 | 20 | 21 | |
Pluronic L-611)Softanol EP-70852)柠檬酸三钠EDTA三聚磷酸钠过碳酸钠碳酸钠(致密灰)非晶型硅酸盐3)AA-MA4)硫酸钠脂肪水解酶100T(Novo Nordisk)Termamyl 60T(Novo Nordisk) | 4-30--2020104100.51 | -430--2020104100.51 | 4--30-2020104100.51 | 4---302020104100.51 |
Bacillus sp.KSM-KP43碱性蛋白酶(实施例7) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
1)聚氧乙烯聚氧化丙烯共聚物(平均分子量为2,000)
2)C12-C14仲乙醇的环氧乙烷(7摩尔)和1,2-环氧丙烷
(8.5摩尔)加合物
3)JIN No.2硅酸钠
4)丙烯酸-马来酸共聚物
(1)污渍盘的制备
卵黄(2.5g)均匀刷到具有直径25cm的一只瓷盘上。将该盘在干燥箱中115℃干燥60分钟。
(2)洗涤条件
所用的洗碗机;全自动洗碗机(NP-810,Matsushita电子工业有限公司的产品)
洗涤类型;标准过程
洗涤用水;硬度62.3mg CaCO3/L(3.5°DH)
洗涤剂的浓度;0.2wt%
(3)评价方法
在上述条件下使用实施例9的洗涤剂组合物,在洗碗机中洗涤5只有污渍的盘。清洗过的盘用1%赤藓红溶液染色,由此显色残留的蛋白。蛋白污渍的程度用肉眼判断。
实施例10
根据表12显示的组分得到用于洗碗机的洗涤剂组合物。通过与实施例9相似的测定方法,评价这些组合物的清洁能力。这些组合物提供优异的清洗效果。表12
(重量%)
组分 | 本发明的洗涤剂组合物 | |||||
22 | 23 | 24 | 25 | 26 | ||
(a) | 碳酸钠碳酸氢钠 | 30 | 25 | 30 | 25 | 50 |
(b) | Sokalan CP51) | 5 | 6 | 5 | 5 | 5 |
(c) | 过碳酸氢钠 | 5 | 6 | |||
(d) | 萜二烯Softanol EP70452) | 2 | 2 | 2 | 11 | 11 |
(c) | 非晶型硅铝酸钠(Synth.Ex.1)3)非晶型硅铝酸钠(Synth.Ex.2)4) | 2 | 2 | 2 | 11 | 3 |
脂肪水解酶100T(Novo Nordisk) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |
Termamyl 60T(Novo Nordisk) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
Bacillus sp.KSM-KP43的碱性蛋白酶(实施例7) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |
苹果酸钠 | 10 | 5 | ||||
柠檬酸钠 | 15 | 10 | 4 | 8 | ||
硫酸钠 | 39 | 53 | 43 | 55 | 30 |
1)丙烯酸/马来酸共聚物(BASF的产品)
2)C12-C14仲乙醇的环氧乙烷(7摩尔)和1,2-环氧丙烷
(4.5摩尔)加合物
3)、4)在日本专利申请公报(kokai)No.6-179899所披露的
合成实例
实施例11
将酶加到上述洗涤剂A(实施例6)中,所加的量在下列表13中显示。白衬衫领子部分用实施例6相似的方法清洗。表13
(重量%)
酶 | 本发明的洗涤剂 | ||||||
27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | |
本发明的蛋白酶1) | - | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
普通蛋白酶2) | - | - | 0.6 | - | - | 0.6 | 0.6 |
纤维素酶3) | - | - | - | 0.7 | - | 0.7 | 0.7 |
脂酶4) | - | - | - | - | 0.5 | - | 0.5 |
1)通过日本专利申请公开(kokai)No.62-257990披露的方法,使用来源于Bacillus sp.KSM-KP43菌株并在实施例2制备的本发明蛋白酶纯化样品(6APU/g)制备的颗粒产品
2)在日本专利申请公开(kokai)No.5-25492披露的蛋白酶K-16,该酶通过日本专利申请公开(kokai)No.62-257990披露的方法修饰,具有5APU/g
3)KAC-500(纤维素酶,500U/g,Kao联合公司的产品)
4)脂肪水解酶100T(Novo Nordisk的产品)
这些结果清楚地表明,本发明的蛋白酶和普通蛋白酶、纤维素酶或脂酶联合使用增强清洗效果。
工业可应用性
本发明的碱性蛋白酶对各种表面活性剂优异的稳定性;对脂肪酸抗性;以及对氧化剂的高度稳定性,因此可用于自动洗碗机的洗涤剂和衣用洗涤剂的酶,该两种洗涤剂含有漂白组分。
序列表<110>KAO联合公司<120>碱性蛋白酶<130>FP-KS-0498<150>JP 09-274570<151>1997-10-07<160>5<210>1<211>639<212>PRT<213>Bacillus sp.<220><221>misc_特征<222>23,29,32,46,47,53,70,74,89,102,105,128,130,131,132,133,146,
148,160,165,172,183,187,188,189,194,286,306,324,369,131,501,
531,541,584,591,592,594,595,596,611,632<223>Xaa=任意氨基酸<400>Met Arg Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala Ile1 5 10 15Leu Ser Thr Val Ala Leu Xaa Asn Pro Ser Ala Gly Xaa Ala Arg Xaa
20 25 30Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Xaa Xaa Gly
35 40 45Phe Ser Lys Gln Xaa Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu Ser
50 55 60Glu Asn Val Lys Leu Xaa Lys Gly Leu Xaa Lys Lys Leu Glu Thr Val65 70 75 80Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Xaa Gln Phe Asn Gly Pro Ile Leu
85 90 95Glu Glu Thr Lys Gln Xaa Leu Glu Xaa Thr Gly Ala Lys Ile Leu Asp
100 105 110Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val Xaa
115 120 125Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr Leu
130 135 140Pro Xaa Tyr Xaa Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser Xaa145 150 155 160Leu Val Lys Ala Xaa Ala Leu Asp Thr Lys Gln Xaa Ash Lys Glu Val
165 170 175Gln Leu Arg Gly Ile Glu Xaa Ile Ala Gln Xaa Xaa Xaa Ser Asn Asp
180 185 190Val Xaa Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp Val
195 200 205Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly Leu
210 215 220Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp Thr225 230 235 240Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile Thr
245 250 255Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn Gly
260 265 270His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly Xaa Thr Asn
275 280 285Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met Asp
290 295 300Ser Xaa Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu Phe305 310 315 320Ser Gln Ala Xaa Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp Gly
325 330 335Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp Asp
340 345 350Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn Glu
355 360 365Xaa Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn Ala
370 375 380Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser Tyr385 390 395 400Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr
405 410 415Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Xaa Ile
420 425 430Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala Asn
435 440 445His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro
450 455 460Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys Asn465 470 475 480Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile Ala
485 490 495Gly Ala Ala Asp Xaa Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly Trp
500 505 510Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn Glu
515 520 525Ser Ser Xaa Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Xaa Phe Thr Ala
530 535 540Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala Pro545 550 555 560Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu Val
565 570 575Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Xaa Tyr Val Gly Asn Asp Phe Xaa Xaa
580 585 590Pro Xaa Xaa Xaa Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val Phe
595 600 605Ile Asn Xaa Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala Tyr
610 615 620Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Xaa Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn625 630 635<210>2<211>640<212>PRT<213>Bacillus sp,<220><221>misc_特征<222>3,24,30,33,47,48,54,71,75,90,103,106,129,131,132,133,134,147,
149,161,166,173,184,188,189,190,195,287,307,325,370,432,502,
532,542,585,592,593,595,596,597,612.633<223>Xaa=任意氨基酸<400>Met Arg Xaa Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala1 5 10 15Ile Leu Ser Thr Val Ala Leu Xaa Asn Pro Ser Ala Gly Xaa Ala Arg
20 25 30Xaa Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Xaa Xaa
35 40 45Gly Phe Ser Lys Gln Xaa Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu
50 55 60Ser Glu Asn Val Lys Leu Xaa Lys Gly Leu Xaa Lys Lys Leu Glu Thr65 70 75 80Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Xaa Gln Phe Asn Gly Pro Ile
85 90 95Leu Glu Glu Thr Lys Gln Xaa Leu Glu Xaa Thr Gly Ala Lys Ile Leu
100 105 110Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val
115 120 125Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr
130 135 140Leu Pro Xaa Tyr Xaa Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser145 150 155 160Xaa Leu Val Lys Ala Xaa Ala Leu Asp Thr Lys Gln Xaa Asn Lys Glu
165 170 175Val Gln Leu Arg Gly Ile Glu Xaa Ile Ala Gln Xaa Xaa Xaa Ser Asn
180 185 190Asp Val Xaa Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp
195 200 205Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly
210 215 220Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp225 230 235 240Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile
245 250 255Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn
260 265 270Gly His Gly Thr His VaL Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly Xaa Thr
275 280 285Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met
290 295 300Asp Ser Xaa Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu305 310 315 320Phe Ser Gln Ala Xaa Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp
325 330 335Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp
340 345 350Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn
355 360 365Glu Xaa Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn
370 375 380Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser385 390 395 400Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro
405 410 415Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Xaa
420 425 430Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala
435 440 445Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr
450 455 460Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys465 470 475 480Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile
485 490 495Ala Gly Ala Ala Asp Xaa Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly
500 505 510Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn
515 520 525Glu Ser Ser Xaa Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Xaa Phe Thr
530 535 540Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala545 550 555 560Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu
565 570 575Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Xaa Tyr Val Gly Asn Asp Phe Xaa
580 585 590Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val
595 600 605Phe Ile Asn Xaa Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala
610 615 620Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Xaa Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn625 630 635 640<210>3<211>1920<212>DNA<213>Bacillus sp.<400>atg aga aag aag aag gtg ttt tta tct gtt tta tca gct gca gcg att 48Met Arg Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala Ile1 5 10 15ctg tcg act gtt gca tta aac aat ccc tcg gct ggt gat gca agg act 96Leu Ser Thr Val Ala Leu Asn Asn Pro Ser Ala Gly Asp Ala Arg Thr
20 25 30ttt gat ctg gat ttt aaa gga att caa aca aca acc gat gtc agt ggt 144Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Val Ser Gly
35 40 45ttc tcc aaa cag cga caa aca ggt gcg gct gca ttt ctg gtg gag tct 192Phe Ser Lys Gln Arg Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu Ser
50 55 60gaa aat gtg aaa ctt ctt aaa gga ttg cta aag aaa ctt gaa aca gta 240Glu Asn Val Lys Leu Leu Lys Gly Leu Leu Lys Lys Leu Glu Thr Val65 70 75 80ccg gca aat aat aaa ctc cat att gtc caa ttc aat ggc ccc att tta 288Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Val Gln Phe Asn Gly Pro Ile Leu
85 90 95gaa gaa aca aaa cag aag cta gag aca act gga gca aag att ctc gac 336Glu Glu Thr Lys Gln Lys Leu Glu Thr Thr Gly Ala Lys Ile Leu Asp
100 105 110tac atc cct gat tat gca tat att gtc gag tat gag ggg gat gtt cag 384Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val Gln
115 120 125tca aaa gtc cgc tcc att gaa cac gtg gaa tca gtg gag cca tac ttg 432Ser Lys Val Arg Ser Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr Leu
130 135 140ccg aaa tac aaa ata gat ccc cag ctt ttc aca aaa ggc gca tcg acg 480Pro Lys Tyr Lys Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser Thr145 150 155 160ctg gtg aaa gcg ttg gcg ctt gat acg aag cag aac aat aaa gaa gtg 528Leu Val Lys Ala Leu Ala Leu Asp Thr Lys Gln Asn Asn Lys Glu Val
165 170 175caa tta aga ggc atc gag gaa atc gct cag tac gta gca agc aat gac 576Gln Leu Arg Gly Ile Glu Glu Ile Ala Gln Tyr Val Ala Ser Asn Asp
180 185 190gtc cat tat att acg gca aag cct gaa tat aag gtg atg aat gat gtg 624Val His Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp Val
195 200 205gcc aga ggt att gtc aaa gcg gat gtg gca cag agc agc tac ggt ttg 672Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly Leu
210 215 220tat gga caa ggc cag att gtc gca gtt gcc gat act gga ttg gat aca 720Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp Thr225 230 235 240gga aga aac gac agt tcg atg cat gaa gcc ttc cgc ggt aaa ata aca 768Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile Thr
245 250 255gca cta tat gca ctg ggt cgg acg aat aat gcg aat gat acg aac ggt 816Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn Gly
260 265 270cat ggt acc cat gtg gca ggt tcg gta tta gga aat ggc gca acg aat 864His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly Ala Thr Asn
275 280 285aaa gga atg gca cct caa gcg aat ctg gtt ttt caa tcc atc atg gat 912Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met Asp
290 295 300agc agt ggt ggg ctt gga ggc ttg cct tcc aat ctg caa acc tta ttc 960Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu Phe305 310 315 320agc caa gca ttc agt gca ggt gcc aga att cat aca aac tcc tgg ggg 1008Ser Gln Ala Phe Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp Gly
325 330 335gca gcg gtg aat ggg gcc tac acg aca gat tcc aga aat gtg gat gac 1056Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp Asp
340 345 350tat gta agg aaa aat gat atg acg att ctt ttc gcg gct ggg aat gaa 1104Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn Glu
355 360 365agg ccg aac ggc ggt acc atc agt gca cct ggt acg gct aaa aac gcc 1152Arg Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn Ala
370 375 380ata aca gtc ggc gca acc gaa aac ctg cgt cca agc ttc ggt tcc tat 1200Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser Tyr385 390 395 400gca gat aat att aac cac gtt gca cag ttc tct tcc cgt ggc ccg aca 1248Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr
405 410 415aaa gat ggg cga atc gag cct gat gtc atg gcg cca ggg aca tac att 1296Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Tyr Ile
420 425 430tta tca gca aga tct tct ctt gca ccc gat tcc tcc ttc tgg gcg aat 1344Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala Asn
435 440 445cat gac agc aaa tat gcc tat atg ggt gga acg tcc atg gca aca ccg 1392His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro
450 455 460att gtt gcg ggg aat gtt gca cag ctc cgt gag cat ttt gtg aaa aat 1440Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys Asn465 470 475 480aga gga atc act cct aag cct tcc cta ttg aaa gca gct ttg att gca 1488Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile Ala
485 490 495ggt gct gct gat gtt gga ttg ggt tat ccg aac gga aac caa gga tgg 1536Gly Ala Ala Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Ash Gly Asn Gln Gly Trp
500 505 510ggc cga gtg acc ctg gat aaa tcg ttg aac gtt gcc tat gtg aac gaa 1584Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn Glu
515 520 525tcc agt gcc cta tca act agc caa aaa gcg aca tat acc ttt act gca 1632Ser Ser Ala Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Thr Phe Thr Ala
530 535 540acg gcg ggc aag cca ttg aaa atc tcc ctg gta tgg tcg gat gcc cct 1680Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala Pro545 550 555 560gca agc act act gct tct gta acc ctg gtc aat gat ttg gat ttg gtc 1728Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu Val
565 570 575att aca gca cca aac gga aca aga tat gtc ggg aat gac ttc tca gca 1776Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Arg Tyr Val Gly Asn Asp Phe Ser Ala
580 585 590cca ttt gac aat aac tgg gat ggc cgc aat aac gta gaa aat gta ttt 1824Pro Phe Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val Phe
595 600 605att aat tcg ccc caa agt gga aca tat acc att gag gtg caa gca tat 1872Ile Asn Ser Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala Tyr
610 615 620aat gtg ccg gtt gga cca caa aac ttc tcg ttg gca att gtg aac taa 1920Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Asn Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn625 630 635<210>4<211>1923<212>DNA<213>Bacillus sp.<400>atg aga aag aag aaa aag gtg ttt tta tct gtt tta tca gct gca gcg 48Met Arg Lys Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala1 5 10 15att ttg tcg act gtt gcg tta agt aat cca tct gca ggt ggt gca agg 96Ile Leu Ser Thr Val Ala Leu Ser Asn Pro Ser Ala Gly Gly Ala Arg
20 25 30aat ttt gat ctg gat ttc aaa gga att cag aca aca act gat gct aaa 144Asn Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Ala Lys
35 40 45ggt ttc tcc aag cag ggg cag act ggt gct gct gct ttt ctg gtg gaa 192Gly Phe Ser Lys Gln Gly Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu
50 55 60tct gaa aat gtg aaa ctc cca aaa ggt ttg cag aag aag ctt gaa aca 240Ser Glu Asn Val Lys Leu Pro Lys Gly Leu Gln Lys Lys Leu Glu Thr65 70 75 80gtc ccg gca aat aat aaa ctc cat att atc caa ttc aat gga cca att 288Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Ile Gln Phe Asn Gly Pro Ile
85 90 95tta gaa gaa aca aaa cag cag ctg gaa aaa aca ggg gca aag att ctc 336Leu Glu Glu Thr Lys Gln Gln Leu Glu Lys Thr Gly Ala Lys Ile Leu
100 105 110gac tac ata cct gat tat gct tac att gtc gag tat gag ggc gat gtt 384Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val
115 120 125aag tca gca aca agc acc att gag cac gtg gaa tcc gtg gag cct tat 432Lys Ser Ala Thr Ser Thr Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr
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Claims (3)
1.一种由芽孢杆菌属的菌株KSM-KP43、KSM-KP1790和KSM-KP9860产生的碱性蛋白酶,该碱性蛋白酶具有下列物理化学特性:
(i)起作用的pH范围
在4-13的大范围的pH内起作用,并且在pH 6-12时表现出的活性为最适pH时活性的80%-100%;
(ii)稳定性pH范围
当在40℃处理30分钟时,在pH为6-11的范围内稳定;
(iii)等电点
等电点为8.9-9.1;和
(iv)脂肪酸的影响
酪蛋白降解活性不被油酸抑制。
2.一种根据权利要求1的碱性蛋白酶,该酶通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定的估测分子量为43,000Da。
3.一种具有由序列号1或2显示的氨基酸序列的蛋白酶。
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