CN1036602A

CN1036602A - 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用

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Publication number: CN1036602A
Application number: CN89101995A
Authority: CN
Inventors: 维安·埃克恩; J·S·M·姆恩尔斯; C·维安·德兰; 奥恩·米斯特; 里尔卡A·奥彼尤斯; 杰汉·H·A·莱恩森夫
Original assignee: Coste Bucardes
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1988-02-11
Filing date: 1989-02-10
Publication date: 1989-10-25
Anticipated expiration: 2004-02-10
Also published as: LTIP1650A; CN1056187C; KR900700597A; EP0571049B1; DE68912359D1; EP0571049A1; EP0328229B2; ATE250669T1; WO1989007642A1; DE68912359T2; EP0328229A1; DK501289D0; ES2061929T5; ES2061929T3; DK175813B1; AU629814B2; KR970005249B1; LT3963B; DE68929484T2; DE68929484D1

Abstract

本发明提供了用于洗涤剂，尤其是洗衣剂中的具有改善之性质的新的蛋白水解酶。这些酶是通过表达编码一种蛋白水解酶的基因而得到的，该蛋白水解酶具有至少在一个氨基酸处不同于野生型酶的氨基酸顺序。优选的酶是由芽孢杆菌新种PB92的丝氨基酸蛋的酶得到的某些突变型。

Description

本发明涉及用于洗涤剂中的具有改进性能的新型蛋白水解酶。这些性能包括在洗衣用的洗涤组合物中具有改进的去除污斑的性能，在洗衣剂贮存时具有改进的稳定性，并在由该洗涤剂制得的肥皂水中具有改进的稳定性。

有关在洗涤组合物中使用酶添加剂，特别是蛋白水解酶以去除蛋白质基的污斑已有详细记载。例如参见已公开的欧洲专利申请（EP-A-）0220921和0232269，美国专利（US）4480037和Re30602，以及论文“微生物酶的生产”（Technology，Vol.1（1979）281-311，Academic Press）。

洗涤组合物可为粉末、液体或膏状形式的。它们含有一种或多种阴离子、非离子、阳离子、两性离子或两性化合物作为洗涤剂的活性材料。这些化合物已由Schwartz、Perrg and Berch（Interscience Publishers（1958））在“表面活性剂”第Ⅱ卷中已详细叙述。而且，它们可含有多价螯合物、稳定化合物、芳香化合物，并在某些情况下还含有氧化剂，通常称为漂白剂。这些洗涤组合物可用于硬质表面的清洗、卫生间的清洗、器皿的洗涤（自动或手洗）及衣服的清洗。

洗衣用的洗涤剂一般可分成两种主要类型，即液体和粉末。液体洗衣剂的表面活性剂浓度高，中和到合适的碱性PH，且一般不含有漂白剂。粉末洗涤剂大多碱性强（肥皂水的PH为9-11），它们含有多价螯合剂（如三聚磷酸钠），并且根据购买这些产品的国家的洗涤习惯，它们可含有或不含有漂白剂。

目前用于洗涤组合物中的酶是以悬浮液、溶胶或粒状形式加入的。例如，在粉末洗涤剂中，蛋白水解酶通常以一种胶囊包裹形式存在，如球状（如商品名为Maxatase^R和Maxacal^R的产品）或颗粒状（如商品名为Savinase^R和Alcalase^R的产品）。Maxatase和Maxaeal由International Bio-Synthetics B.V.公司（Rijswijk，The Netherlands）出售，Savinase和Alcalase由NOVO Industri A/S公司（Bagsvaerd，Denmark）出售。在液体洗衣剂中，酶大多以溶液形式存在。

蛋白水解酶一般很难与洗涤组合物结合。在使用期间，例如在约10℃至高于60℃的温度下洗涤时，为从织物上去除蛋白质污斑，它们必须是稳定的，并具有活性的。另外，在洗涤剂产品长期贮存过程中，它们也必须是稳定的。因此，在有多价螯合剂、表面活性剂及某些情况下有漂白剂存在时，在强碱和高温下，这些酶必须是稳定并能发挥作用的。因为没有世界各地普遍适用的洗衣剂，也没有统一的洗涤条件（PH、温度、肥皂水浓度、水硬度），对所用的酶的要求可根据他们所用的洗涤剂的类型及洗涤条件而异。

控制粉末洗涤剂中的酶的稳定性的条件一般不是最佳的。例如，在粉末洗涤剂中酶制剂的贮存过程中，尽管酶是通过包裹而显然是与洗涤剂基质物理分离的，但来自洗涤剂的氧化剂仍会影响该蛋白酶，并会减低其活性。在粉末洗涤剂贮存期间，导致酶不稳定的另一个原因是自身消化，尤其在高相对湿度的情况下。

而且，通常在粉末洗涤剂中存在氧化剂并用该洗涤剂清洗衣服时，由于蛋白质污斑固定在织物上，而对污斑去除效率极为不利。另外，这些氧化剂和其它洗涤剂组分（如多价螯合剂），在洗涤过程中，也会减低蛋白酶去除污斑的效率。

在液体洗涤剂中遇到的一个严重问题是这些酶很快失去活性，尤其在高温下。由于该洗涤剂产品中的酶以溶液形式存在，所以在正常贮存期间，就已经产生失活，并且在实际使用该产品以前便已大大降低酶的活性。特别是阴离子表面活性剂，如烷基硫酸盐，与水和助洗剂混合时，会使酶不可逆地变性并使其没有活性或对蛋白降解作用十分敏感。

已发现，合适的液体洗涤剂配方，例如使用稳定剂以减少酶的失活，可部分解决液体洗涤剂中酶的稳定性问题。参见EP-A-0126505和EP-A-0199405，美国专利US4318818以及英国专利申请2178055A。

确保酶在液体洗涤剂中稳定性的另一种方法，在EP-A-0238216中已作叙述，该方法通过配制技术达到酶分子和其相对的液体洗涤剂基质之间的物理分离。另外，已提出在粉末洗涤剂中采用胶囊包裹法以确保酶的稳定性，例如参见EP-A-0170360。

概括上述条件，蛋白水解性洗涤剂酶必须符合功能最佳条件，而且受目前市场上可买到的用于洗涤组合物中的酶的限制。尽管努力确保酶在洗涤组合物中的稳定性，但在普通的贮存和使用条件下仍会遭受显著的活性损失。

有某种指定用途，如用于洗涤剂中的新型酶的鉴定和分离可用几种方法进行。一种方法是筛选显示有所要酶活性的生物体或微生物，自微生物内或该微生物的培养物上清液中分离和纯化酶，测定其生物化学性质并检验这些生物化学性质是否符合使用要求。若这种经鉴定的酶不能由其天然产生的生物体得到，可用DNA重组技术分离编码该酶的基因，在别的生物体中表达该基因，分离和纯化已表达的酶，并检验其是否适合于预期的应用目的。

得到适于预期用途的新型酶的另一种方法是对现有酶进行修饰。这一目的是可以达到的，尤其是用化学修饰方法（见I.Svendsen，Carlsberg Res.Commun.44（1976），237-291）。一般说来这些方法不是很特异的，如它们可修饰所有易得到的具有共同侧链的残基，或它们要依赖于待修饰的合适的氨基酸的存在，且常常不能去修饰难以接近的氨基酸，除非该酶分子是伸展的。因此，通过编码基因的诱变而修饰酶的方法被认为是最好的方法。

可用随机诱变或用定点诱变方法来完成诱变。当然，随机诱变（即用化学诱变剂或用致突变照射法处理整个微生物），可产生经修饰的酶。在此情况下，必须采用强选择方法以寻找这些极少有的突变体。克隆该编码基因以后，经体外或体内对其进行诱变处理，并在一个合适的寄主细胞中再克隆突变的基因以表达编码的酶，从而可能通过随机诱变分离出突变型酶。在此情况下，为了选择所要的突变型酶，也必须采用合适的生物学选择方法（参见国际专利申请WO87/05050）。但这些生物学选择方法不能特异地选择适用于洗涤剂中的酶。

得到修饰酶的最有效方法是通过定点诱变，用任何其它所要的氨基酸特异地取代一个或多个氨基酸。EP-A-0130756举例说明了这种用以产生能表达给定的经修饰的蛋白水解酶的突变型蛋白酶基因技术的用法。

近年来，已通过使用合成的诱变性低聚核苷酸使一个靶顺序内的几个位置上含有碱基混合物，证明了低聚核苷酸介导的定点诱变的潜在应用。这样能用一种单一合成的低聚核苷酸制剂在DNA顺序的特定部分引起许多不同的突变（如参见Hui et al.，EMBO J.3（1984）623-629;Matteucci et al.，Nucl.Acids Res.11（1983）3113-3121;Murphy et al.，Nucl.Acids Res.11（1983）7695-7700;Wells et al.，Gene 34（1985）315-323;Hutchinson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83（1986）710-714 and F.M.Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988，Greene Publishers Association and Wiley，lnter-science，1987）。

Stauffer等人（J.Biol.Chem.224（1969）5333-5338）已发现卡尔斯伯奇枯草杆菌蛋白酶的221位中的蛋氨酸可被H₂O₂氧化成蛋氨酸亚砜，这是导致活性明显降低的主要原因。

用随机诱变和定点诱变这两种生成修饰的酶的方法，结果分离并定性了由淀粉液化芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶得到的突变体，其也称为“枯草杆菌蛋白酶BPN”。在WO87/05050中公开了一种具有高度热稳定性的突变型枯草杆菌蛋白酶BPN。EP-A-0130756叙述了用所谓的“盒式诱变”方法，对枯草杆菌蛋白酶中222位上的蛋氨酸由所有19个可能存在的氨基酸定向诱变，能生成抗H₂O₂之氧化作用的酶。但是，在后一种情况下，多数突变体都具有低的蛋白水解活性。已发现最好的突变体是M222A和M222S，与天然的枯草杆菌蛋白酶BPN相比，它们的比活性分别是53%和35%（参见Estell et al.，J.Biol.Chem.260（1985）6518-6521）。

涉及生成修饰的蛋白酶的先前工作表明，可以得到具有可变稳定性和可变动力学性质的枯草杆菌蛋白酶BPN突变体;参见上述及其它的参考文献，例如Rao et al.，Nature 328（1987）551-554;Bryan et al.，Proteins 1（1986）326-334;Cunningman and Wells，Protein Engineering 1（1987）319-325，Russell et al.，J.Mol.Boil.193（1987）803-819;Katz and Kossiakoff，J.Boil.Chem.261（1986）15480-15485;以及Shaw的综述，Biochem.J.246（1987）1-17和Gait et al.，Protein Engineering 1（1987）267-274。但是，这些参考文献都没有提到洗衣剂中具有改进洗涤性能的蛋白水解酶的工业生产。至今这些经修饰的蛋白酶中没有一个是具有商业价值的且在合适的使用条件下优于目前所用的洗涤剂酶的。

图1A显示含PB92蛋白酶基因的突变载体的构建。

图1B图解显示所用的突变方法。

图1C显示含有突变型PB92蛋白酶基因的表达载体的构建。

图2A，2B和3显示在不同的洗涤条件下，洗涤性能对各种PB92蛋白酶突变体的特异性蛋白水解活性的关系。

图4给出了PB92蛋白酶基因的核苷酸顺序和已编码的前体酶的氨基酸顺序。

一方面，本发明提供了新型的突变型蛋白水解酶，它是通过表达编码该酶的基因而得到的，所说的酶具有氨基酸顺序，它至少有一个氨基酸不同于相应的野生型酶。这些突变型酶用于洗涤剂，特别是洗衣剂时，表现有改良的性能。本发明的最佳实施方案是由PB92丝氨酸蛋白酶的突变体完成的。

另一方面，本发明提供了新型的酶促洗涤剂，它含有一种蛋白水解酶产品，该产品至少含有一种新的突变型蛋白水解酶。

再一方面，本发明提供了一种检验系统，它能有效地选择用于洗衣剂中的具有改善了的性能的突变型蛋白水解酶，而不是许多其他酶。

这些酶是通过表达经诱变处理的蛋白酶基因产生的。

在下文的详细说明中将对本发明的上述方面和其它方面作进一步叙述。

在本说明书中所用的，与“突变型蛋白水解酶”相关联的术语：“具有改善了的性质”，意思是指相对于有关的野生型蛋白酶来说，蛋白水解酶具有改善的洗涤性能或在保持良好洗涤性能情况下有改善了的稳定性。

本说明书中限定的突变型水解酶的“洗涤性能”这一术语是指在相关洗涤条件下，一种突变型蛋白水解酶对于没有酶的洗涤组合物在清洗衣服时外加作用的贡献。

“相关洗涤条件”这一术语是用来表示各种条件，特别是洗涤温度、时间、洗衣机、肥皂水浓度、洗涤剂类型和水的硬度、家里实际使用的洗涤剂等。

“改善的洗涤性能”这一术语是用来表示在相关洗涤条件下，在去除污斑时可得到更好的效果或表示相对于野生型酶来说，只需少量的突变型蛋白水解酶即可得到相同的效果。

术语“保持不变的洗涤性能”是指在相关的洗涤条件下，相对于野生型蛋白酶来说，突变型蛋白水解酶的洗涤性能至少为80%。

术语“改善的稳定性”是指在洗衣剂贮存过程中和/或在肥皂水中，突变型蛋白水解酶相对于野生型酶来说，有更好的稳定性，这包括对氧化剂、多价螯合剂、自体溶解、表面活性剂和强碱性条件的稳定性。

在确定的实验室条件下测得的生物化学性质，对于预测一种特定的洗涤剂蛋白酶在所需特定的使用条件下的性能并不是可靠的参数。这些参数包括在确定的底物上测得的动力学数据，这些底物如酪蛋白、二甲基酪蛋白和血红蛋白等蛋白质，或如SAAPFPNA（琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯基-丙氨酰-对位硝基苯胺）等取代的寡肽底物。显然该蛋白酶的其它性能决定它们在清洗衣服时的效率。

本发明是基于如下研究结果，即虽然已有多种方法将氨基酸引入蛋白质中，使其生物化学性质产生很大的变化，但仍然很难预料，或甚至不可能预料在实际使用条件下产生的特定突变作用。

经广泛研究和试验以后，按照本发明现已发现了的一种将突变型蛋白酶的制备与对这些蛋白酶之性能的有效选择方法相结合的方法。令人惊奇的是用这种方法，可基于性质有效地筛选许多酶。

按本发明的检验系统是基于如下事实，即在模拟相关洗涤条件的洗涤计量器或振荡式洗涤仪（测去污力）中，可从小块测试样品上除去酶敏感性污斑。合适的小块测试样品是，例如购自EMPA公司（Eidgeneossische Material Pruefungs und Versuch Anstalt，St.Gallen，Switzerland）的小块布样，其带有人为污染的蛋白质污斑。用于蛋白酶试验的小块样品上的适当的污斑包括血斑、草色斑、巧克力斑以及其它蛋白质污斑。

另外，通过模拟确定的销售区中家庭使用的典型洗涤条件，以这种方法控制该检验系统中的其它有关因素，如洗涤剂组分、肥皂水浓度、水硬度、洗涤机器、时间、PH和温度。

在合适的测试条件下，可通过测定蛋白酶去除某些典型污斑的能力来方便地测定其洗涤性能。在洗涤计量器或振荡式洗涤仪中加酶和不加酶洗涤后，通过测定试验布样上的反差，能测得这种去污力。当采用由DNA诱变而修饰的蛋白水解酶时，按本发明的实验室检验系统是能代表家庭实用情况的。

因此，本发明能检验许多不同的酶，并能选择特别适用于特定类型的洗涤剂的那些酶。这样便能很容易地选择符合特定使用条件的“定作的”（“tailor made”）酶。

某些细菌丝氨酸蛋白酶被称为枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶含有枯草杆菌、淀粉液化芽孢杆菌（“枯草杆菌蛋白酶BPN′”）和地衣形芽孢杆菌（“卡尔斯伯奇枯草杆菌蛋白酶”）的丝氨酸蛋白酶。参见Markland和Smith（1971）的综述，〔“The Enzymes”（Boyer，ed.）Vol.3，561-608，Academic Press，New York〕。芽孢杆菌菌株，如嗜碱芽孢杆菌菌株可产生其它的蛋白酶。后一类的例子是商标为Maxacal的丝氨酸蛋白酶〔下文也称其为PB92蛋白酶（来自芽孢杆菌新种PB92）〕，和上述的商品名为Savinase的产品。

PB92蛋白酶的氨基酸顺序如图4所示。成熟的蛋白酶含有269个氨基酸，其分子量约为27，000D，并在强碱范围内有一等电点。PB92蛋白酶在蛋白质底物上的活性用Alkaline Delft单位（ADU）表示。以ADU表示的活性是按英国专利说明书GB1353317中所述的方法测定的，不同的是PH的变化范围为8.5-10.0。纯化的PB92蛋白酶的活性为21000ADU/mg。在酪蛋白中测得的转换数（Kcat）为90秒^-1。

经纯化处理的卡尔斯伯奇枯草杆菌蛋白酶（Delange and Smith，J.Biol.Chem.243（1968）2184）的比活性等于10，000ADU/mg，枯草杆菌蛋白酶BPN′（Matsubara et al.，J.Biol.Chem.240（1965）1125）的比活性为7，000ADU/mg。除上述参数，如比活性和转换数（Kcat）以外，PB92蛋白酶本身与卡尔斯伯奇枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶BPN′以及加在洗涤剂中的其它蛋白酶（如，Maxatase和Alcalase）的差别在于它具有高的正电荷，此能通过如下文实验部分4中所述的对天然蛋白质的凝胶电泳分析看出。

由于PB92蛋白酶在碱性PH值时有去污活性，所以通常用作洗涤剂的添加剂，与洗涤剂成分，如表面活性剂、助洗剂和氧化剂混合在一起使用。氧化剂大多用于粉末洗涤剂中。与其它蛋白酶，如上述的枯草杆菌蛋白酶相比，PB92蛋白酶具有较高的去污效率。这意味着只需少量的PB92蛋白酶就能得到相同的洗涤效果。

对氧化作用敏感性是PB92蛋白酶及所有其它已知的用于洗涤剂中的丝氨酸蛋白酶的一个严重缺点（也参见Stauffer et al.，J.Biol.Chem.244（1969）5333-5338;Estell et al.，J.Biol.Chem.263（1985）6518-6521）。与非氧化的PB92蛋白酶相比，用H₂O₂或由含过硼酸盐四水合物和TAED的活化体系产生的过酸对PB92蛋白酶进行氧化可使酶的比活性分别为50%和10%（ADU/mg）（见实验部分7和实例1）。

本发明的方法非常适用于生产、筛选和选择PB92的突变体，而且还能方便地用于选择由嗜碱芽孢杆菌菌株PB92的丝氨酸蛋白酶以外的蛋白酶得到的经过修饰的蛋白酶。例如，编码枯草杆菌、淀粉液化芽孢杆菌和地衣形芽孢杆菌之丝氨酸蛋白酶的基因是已知的，能用作诱变靶。这也适用于编码任何其他合适的蛋白酶，尤其是嗜碱芽孢杆菌之丝氨酸蛋白酶的基因。

显然，可使用有助于定点诱变或区域定向随机诱变的低聚核苷酸或任何其它合适的方法在蛋白酶基因中有效地产生突变。

可产生突变型蛋白酶的合适的宿主菌株包括能完成蛋白酶之表达的可转化的微生物。能从中得到蛋白酶的同种或同属的特定宿主菌株是适用的，如芽孢杆菌属菌株，特别是嗜碱芽孢杆菌菌株，最好是芽孢杆菌新种PB92或其实质上具有相同性能的突变体。枯草芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌和淀粉液化芽孢杆菌的菌株也是优选的菌株。其它合适的和优选的宿主菌株包括用一种突变型基因转化前实质上不能产生细胞外蛋白水解酶的那些菌株。特别有用的是缺乏蛋白酶的芽孢杆菌寄主菌株，如芽孢杆菌新种PB92的缺乏蛋白酶的衍生菌。蛋白酶的表达是使用在选择的宿主生物体中有功能的表达信号获得的。表达信号包括调节蛋白酶基因之转录和转译的DNA顺序。适用的载体能在选择的宿主菌株中以足够高的拷贝数进行复制，或者能通过染色体整合作用在宿主菌株中稳定地保留蛋白酶基因。

最好使表达的蛋白酶分泌到培养基中，或在使用革兰氏阴性细菌宿主菌株的情况下，使产物进入周质间隙中。为了分泌，可使用一个合适的氨基端信号顺序，若该顺序在选择的宿主菌株中有作用的话，该信号顺序最好是由原始基因编码的。

根据本发明的一个方面，能建立一种合适的洗涤性能试验，它代表了市场中遇到的任何相关的家庭洗衣条件。例如，已建立了对任务繁重的欧洲粉末洗涤剂市场进行检验适用的试验方法，其中在肥皂水浓度为1-10克洗涤剂/升，所用的水硬度为10-20°GH（德国硬度）、温度为25-80℃时，所用的粉末状复配洗涤剂可含有或不含有漂白剂。更具体地说，所用的粉末状复配洗涤剂为肥皂水浓度为4或7克洗涤剂/升、15°GH、40℃时含有TAED过硼酸盐者。

还提供了能代表液体洗涤剂中洗涤情况的试验方法。通常在肥皂水浓度为1.5-5克洗涤剂/升、5-15°GH、温度为15-40℃时使用这些洗涤剂。更具体地说，在肥皂水浓度为1.5克洗涤剂/升，5°GH，及25℃-40℃代表的美国液体洗涤剂使用条件下，并在肥皂水浓度为5克洗涤剂/升，15°GH、40℃代表的欧洲液体洗涤剂条件下，均采用不含漂白剂的液体洗涤剂组合物。

对适应市场要求的其它条件，可进行特定的性能测定。可用带有蛋白酶敏感性污斑的小块测试样品，特别是染有血斑，草色斑，巧克力污斑和其它蛋白质污斑的小块样品，特别是可用EMPA小块测试样品116和117进行典型的洗涤性能的试验。

根据本发明的一个方面，发现在取代芽孢杆菌PB92丝氨酸蛋白酶（例如M216）的氧化作用敏感性氨基酸以后对于在已克隆的基因上采用“定点诱变”的其它氨基酸，能产生抗漂白剂的酶。还意外的发现，有一种经选择的氧化作用抗性酶具有与天然PB92蛋白酶相类似的洗涤性能，尽管与野生型PB92蛋白酶相比，其比活性明显地低（对于突变体M2165和M216Q，分别为40%和38%）。

某些PB92突变蛋白酶的洗涤性能（当用达到天然蛋白酶相同效果所需的酶的相对量的倒数×100%表示时）可增加到120%以上，在某些情况下甚至可高于180%。

根据本发明的另一方面提供的PB92蛋白酶突变体，与天然的PB92蛋白酶相比，在含有漂白剂的一种粉末洗涤剂组合物中具有较好的贮存稳定性，而且保持了其洗涤性能。这些突变体的例子是M216S和M216Q以及除在其它位点上突变以外至少还有一个突变的突变体。

按本发明的再一个方面，已意外的发现，在液体洗衣剂组合物（不含氧化剂）中，突变型PB92-蛋白酶M216S、M216Q、S160D和N212D保留有较PB92蛋白酶更好的活性。这些突变体中，M216S和M216Q具有保持不变的洗涤性能，S160D和N212D则具有改善了的洗涤性能。对于S160D和M216Q突变体来说，在被检验的液体洗涤剂中，其贮存稳定性的改善是最明显的。

也可使几种突变相结合以增加蛋白酶在洗涤剂组合物中的稳定性。可将对同一蛋白酶产生积极影响的几种突变结合到一个单一的突变型蛋白酶基因中，甚至能进一步改良蛋白酶，例如〔S126M、P127A、S128G、S160D〕和〔G116V、S126N、P127S、S128A、S160D〕。如将N212D和S160D等的良好洗涤性能与M216S或M216Q等的稳定性质相结合，即可产生新的蛋白酶突变体。这种〔S160D、M216S〕突变体，例如，可见有改善的洗涤性能和更好的贮存稳定性。

也有可能使说明书中所述的任何突变或一组突变相结合以制成有用的突变体。此外，可将本文中已公开的有用的突变与其它位点上的突变相结合，这对酶的性质可引起或不会引起实质性的变化。

本发明的最佳实施例涉及下列PB92蛋白酶突变体：

〔N212D〕;〔S160D〕;〔S160G，N212D〕;〔S160D，M216S〕;〔A166D，M169I〕;〔G116V，S126V，P127E，S128K〕;〔G116V，S126G，P127Q，S128I〕;〔G116V，S126L，P127N，S128V〕;〔G116V，S126L，P127Q，S128A〕;〔G116V，S126V，P127M〕;〔G116V，S126H，P127Y〕;〔G116V，S126R，P127S，S128P〕;〔G116V，S126F，P127Q〕;〔G116V，S126F，P127L，S128T〕;〔S126M，P127A，S128G〕;〔S126M，P127A，S128G，S160D〕;以及〔G116V，S126N，P127S，S128A，S160D〕。

为了阐明本发明得到适用于洗衣剂的新型蛋白酶所用方法的重要性，即使用有代表性的洗衣应用检测作为最初的选择标准的重要性，而将突变型PB92蛋白酶之洗涤性能试验的结果与通常在蛋白质生物化学和酶学研究中测得的生物化学参数相比较。由这些结果能得到这样的结论，即测定时对限定之底物亲合力的参数与蛋白水解反应的动力学以及洗涤性能之间没有任何关系（见实例1的表1）。

因此，也可在一种酶产品中或在相同的洗涤方法中结合使用二个或多个有不同性质的突变体。这样的结合可以有或没有协同作用。

最后显然可用缺失或插入方法改变多肽中的氨基酸编号。但应明瞭的是同源的位置将落在本申请权利要求的范围内。

提供下列实施例是为了说明本发明，而不是限制本发明。

实验部分

材料和方法

PB92蛋白酶突变体的构建

开始诱变工作的基本构建物被称为PM58，在EP-A-0283075中已有详细叙述。

下述方法包括三个阶段：

a.诱变载体M13M1的构建

b.突变程序

c.构建PM58δEco及在该载体中再克隆突变的DNA片段。

1.a.诱变载体M13M1的构建

用限制性内切酶HpaⅠ和BalⅠ消化基本构建物PM58。在低熔点琼脂糖上纯化含PB92蛋白酶基因的14006P片段（Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1982）。用SmaⅠ消化载体M13MP11（Messing et al.，Nucl.Acid Res.9，（1981）303-321）。将上述1400bp DNA片段连接到该载体中，并按Cohen等人（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69，（1972）2110-2114）所述的方法转染到大肠杆菌JM101内。

在大肠杆菌JM101中繁殖噬菌体后，分离SSDNA（Hei，decker et al.，Gene 10，（1980）69-73）。用Sanger（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74（1977）6463）所述的方法经DNA顺序测定检查插入段及其定向。

得到适用于诱变的载体并定名为M13M1。上述方法图解显示于图1A中。

1.b.突变程序

用该载体的SSDNA和M13mp19的ds DNA对M13M1进行诱变（Messing et al.，Nucleic Acids Res.9（1988）303-321）。其中后一种载体是用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ消化，接着在低熔点琼脂糖中纯化大的片段。

按Kramer等人（Nucleic Acids Res.12（1984）9441-9456）所述的方法（其改进在于用大肠杆菌JM105代替大肠杆菌WK30-3）进行诱变用于选择突变体。

用于产生特异性突变的低聚核苷酸的长度为22个核苷酸，用以在特定DNA顺序中同时产生几处突变的区域特异性突变是使用含有在相应待突变氨基酸位点中随机掺入的所有4种核苷酸的长度为40核苷酸的低聚核苷酸制剂进行的。

诱变后，用上述Sanger的二脱氧方法，通过顺序分析检验在相关的突变过程中可能存在的突变体。测定整个单链缺口（见图1B）的核苷酸顺序以检验二级突变的缺乏。该程序如图1B中图解所示。

所述的操作程序可用于产生在蛋白酶基因（氨基酸154-269）的3′部分中有突变的DNA片段。

对本领域的技术人员显而易见的是，为了产生芽孢杆菌载体中蛋白酶基因的5′部分有突变的DNA片段，可以使用另外的限制性内切酶，并能用类似于图1A的方法构建修饰的PB92蛋白酶基因。

1.C.PM58δEco的构建及在该载体中再克隆包含突变的DNA断片（图1C）

为构建PM58δEco，用限制性内切酶EcoRⅠ消化PM58，并在稀释情况下用T₄连接酶连接之。按Spizizen等人（J.Bacteriol.81（1961）741-746）的方法，用连接混合物转化枯草杆菌1-A40（Bacillus Genetic Stock Centre，Ohio）。

将来自转化混合物中的细胞铺敷在含20μg/ml新霉素的基本培养皿上（如EP-A-0283075的实施例1中所述）。

按Birnboim和Doly（Nucleic Acid Res.7（1979）1513-1523）所述的方法分离转化体的质粒DNA，并通过限制性酶切分析进行定性。这样即可分离到pB58δEco（见图1C）。

为生产突变酶，将按1.b中所述方法产生的包含所需突变的M13M1的DNA片段再克隆到PM58δEco中。用EcoRⅠ消化M13M1的ds DNA（如上所述）并连接到PM58δEco的EcoRⅠ位点上。用上述Spizizen等人的方法用连接混合物转化枯草杆菌DB104（Doi，J.Bacteriol.（1984）160，442-444）。

将来自转化混合物中的细胞铺敷在含20μg/ml新霉素和0.4%酪蛋白的基本培养皿上（EP-A-0283075）。按上述Birnboim和Doly的方法分离产生转化体的蛋白酶的DNA，并通过限制性酶切分析进行定性。

2.突变型蛋白酶的产生

将DB104的转化体（经测定它含有携带突变之蛋白酶基因的载体）接种在含有20μg/ml新霉素的10ml胰蛋白胨大豆汁培养液（TSB）中并于37℃下保温24小时。将培养物的样品（0.1ml）接种在500ml振荡烧瓶中，该烧瓶中含有100ml蛋白酶生产培养基：12.5g/l酵母提取液（Difco），0.97g/l CaCl₂·6H₂O，2.25g/l MgCl₂·6H₂O，20mg/l MnSO₄·4H₂O，1mg/l COCl₂·6H₂O，0.5g/l柠檬酸盐，0.5ml/l消泡剂5693，6%W/V麦芽糖，0.2M磷酸盐缓冲液（PH6.8）和20mg/ml新霉素。

在恒定通气条件下保温65小时以后，按Lin等人（J.Biol.Chem.244（1969）789-793）所述的方法，用二甲基酪蛋白作底物分析培养物的蛋白酶活性。为了产生大量野生型PB92和突变型PB92蛋白酶，也可于37℃下，在体积为10升或更大的充气发酵罐中，用与振荡烧瓶中基本相同的生产培养基来培养这些菌株。

将得到的培养液用于蛋白酶纯化。

3.野生型PB92蛋白酶及其突变体的纯化和浓缩

用Zetaprep^R圆盘或柱（PS-type，LKB），以阴离子交换层析法纯化在振荡瓶或10升发酵罐中由枯草杆菌DB104产生的突变型和野生型PB92蛋白酶。离心（3000×g，10分钟）发酵液并用10mM磷酸钠缓冲液（PH5.5）将上清液稀释10倍，然后加在阳离子交换柱中。用磷酸盐缓冲液（几倍于柱床体积）洗涤后，用含0.4M Nacl的磷酸盐缓冲液洗脱蛋白酶。合并含蛋白酶活性的各部分，用装有PM-10滤膜的Amicon搅拌槽通过超滤作用进行浓缩。用磷酸盐缓冲液稀释并浓缩蛋白酶溶液使NaCl浓度降至大约50mM，然后保存在-80℃，其中蛋白质浓度为1-10mg/ml。

另一方面，为了从大规模发酵的培养液中回收PB92蛋白酶突变型，可加入CaCl₂和乙酮（最多30%W/W）。过滤以除去细胞团块后，加入0.2-2%（W/W）的CaSO₄·2H₂O，并再加入乙酮到终浓度＞60%W/W。以从所得到的滤液中沉淀出蛋白酶。经过滤分离沉淀物，喷洒乙酮，然后干燥之，以得到一种粗制的酶粉末（CEP）。

4.检验已纯化之蛋白酶纯度的分析技术

若分别用电泳和高效凝胶电泳法（HPLE）测定时，只发现一个带或一个峰，则认为蛋白酶是纯的。

在十二烷基硫酸钠（SDS）存在下，按Laemmli（Nature，227（1970）680-685）所述的方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析。但是，为了防止自身降解，在于100℃用SDS使蛋白质样品变性前必须先使活性蛋白酶失活。这可通过与苯基甲基磺酰氟（PMSF）保温（1mM，30分钟，室温）或用三氯乙酸沉淀（TCA，8%，30分钟，在冰浴中）作到。在PH为7.45〔凝胶缓冲液含有20mM组氨酸（His）和50mM3-〔N-吗啉代〕丙磺酸（MOPS）〕时，在5%聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺与二丙烯酰胺的比率为20∶1）中进行纯粹的PAGE。将蛋白质样品加在板状凝胶的顶部，并使之向阴极方向泳动。用相同的His/MOPS缓冲液作电泳（槽）缓冲液，但所用PH为6.3。以350V电泳1 1/2 -2小时后，在8%的乙酸中浸渍凝胶以使蛋白质固定于凝胶中，然后用考马斯亮兰R250染色，并按标准方法进行脱色。

用阳离子交换柱（Monos-Pharmacia Fine Chemicals）和凝胶过滤柱（TSK2000W-LKB）经HPLC检验纯度。使前者在PH为5.5的10mM磷酸盐缓冲液中泳动并用PH为5.5的10-30mM磷酸盐线性梯度洗脱，得到结合的蛋白酶，凝胶过滤柱用PH为5.5的0.25M乙酸钠洗脱。

5.蛋白酶浓度的测定

为测定经纯化的蛋白酶溶液中的蛋白质浓度，可采用：

Ⅰ）用计算得到的消光系数（∈M）在280nm进行消光测定，

Ⅱ）活性位点滴定。

根据每个酶分子中色氨酸的数目（∈M＝5600M^-1·Cm^-1）和酪氨酸的数目（∈M＝1330M^-1·Cm^-1）计算280nm处的消光系数。对于PB92蛋白酶来说，使用的∈M为26100M^-1·Cm^-1（3个Trp，7个Tyr残基），相当于在280nm处测得的E^1% _1Cm＝9.7（Mr＝26729D_a）。对于改变了Trp和Tyr数的突变体，可进行相应的校正。

用活性位点滴定可得到活性酶分子的估计数目。由于普通使用的N-反肉桂酰咪唑法（M.L.Bender et al.，J.Am.Chem.Soc.88，（1966）5890-5931）对PB92蛋白酶来说不能提供令人满意的结果，所以我们建立了使用PMSF的方法。该方法中，将已估计了浓度的蛋白酶（根据280nm吸光率）分别与0.25、0.50、0.75、1.00和1.25当量的PMSF混合，使之在室温下，在10mM磷酸钠（PH6.5）中反应1小时。酶浓度至少应为50μM。

用琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯基-丙氨酰-对位硝基苯胺（SAAPF_PNA）作底物（见下文），用分光光度法测定残余活性。用NMR-光谱仪测定PMSF的纯度（及浓度），并在异丙醇中配制储备液。已发现活性位点滴定的结果与HPLC检测纯度的结果相符合。

6.野生型和突变型蛋白酶动力学参数的测定

.按英国专利说明书GB1353317中所述的方法，在PH10.0条件下测定对蛋白质底物（酪蛋白）的活性（以ADU＝Alkaline Delft单位表示）。

.在固定的PH下，用酪蛋白作底物测定。这种PH固定的反应容器（Radiometer Copenhagen）含有10ml0.1M KCl以及50mg酪蛋白（Hammerstein Merck）用10mM NaOH使PH保持在10.0，在40℃及有氮气流的情况下滴定因PB92蛋白酶水解酪蛋白而释放出的质子。

.用SAAPF_PNA测定对合成肽的活性。在410nm：∈M＝8480M^-1·Cm^-1，用分光光度法测定所生成的黄色PNA（Paranitronanilide），（E.G.Delmar et al.，Anal.Biochem.94（1979）316-320）。所用的UVIKON860（KONTRON）分光光度计上装有一个恒温的六位置小室变换器。根据在不同的底物浓度（PB92蛋白酶为0.1-6.0mM）测定最初速率可得到动力学参数Kcat和Km，用多元交叉迭代方法，以非线性回归法使该数据符合双曲线函数。算出特异性常数Kcat/Km。在25℃，终体积为1ml（含有0.1M TRIS-HCl+0.1M NaCl，PH8.6）时进行测定。必须含有NaCl，因为缺少它时PB92蛋白酶显示非线性Lineweaver-Burk曲线，而这种情况可能是因底物抑制作用引起的。先将底物溶解在DMSO中，使其浓度达200mM，然后用PH8.6的0.1M TRIS-HCl稀释，得到20mM的储备溶液（用分光光度法在315nm进行测定，∈M＝14000M^-1·Cm^-1）。不必因改变DMSO的浓度（0.05-3.0%V/V）进行校正。

7.PB92蛋白酶的氧化

按Estell等人（J.Biol.Chem.260（1985）6518-6521）所述的方法试验PB92蛋白酶对H₂O₂氧化作用的敏感性，不同的是：Ⅰ）用20mM H₂O₂代替100mM H₂O₂;Ⅱ）将20mM过硼酸钠与10mM TAED相混合以用作辅助氧化剂。

8.洗涤性能试验

用染有牛奶，血迹和墨水迹的棉布和聚酯/棉花小块布样（5.0×5.0Cm，得自EMPA公司，St.Gallen，Switzerland，编号为116和117），在一个特制的洗涤试验中检测PB92蛋白酶突变体。

在装有不锈钢测试容器〔每个容器内含有一种确定的洗涤剂组合物，再加上待测定的蛋白酶（PB92蛋白酶突变体或PB92蛋白酶）〕的Atlas洗涤计量仪LEF-FC中进行洗涤试验。该试验在预定的温度下进行30分钟（另有规定者除外）。洗涤后，在空气中干燥小块试样，用装有绿色滤光片的光电分光仪在680nm处测定试验布样的反射率。将用含有PB92蛋白酶突变体的洗涤剂洗涤过的小块试样上测得反射率数据与一组可比较的反射率数据（用含PB92蛋白酶的洗涤剂）相比较。将PB92蛋白酶的蛋白质总量（mg）除以达到相同反射率所需要的突变型蛋白酶的蛋白质总量（mg）×100%计算出突变型蛋白酶的洗涤性能数据。

实施例1

A.按上述方法测定欧洲粉末洗涤剂中各种PB92蛋白酶突变体的洗涤性能。

在各含有溶于250ml15°GH水中的规定量之粉末洗涤剂IEC的不锈钢测试容器中加入二小块棉布试样和二小块聚脂/棉布试样。粉末洗涤剂IEC的组成如下：

成分重量%

直链烷基苯磺酸钠 6.4

（烷烃链的平均链长为C11.5）

乙氧化的脂醇（14EO） 2.3

钠皂 2.8

三聚磷酸钠（STPP） 35.0

硅酸钠 6.0

硅酸镁 1.5

羧甲基纤维素 1.0

硫酸钠 16.8

过硼酸钠四水合物 18.5

TAED 1.5

杂色+水加至100

向每个容器中加入选定的经纯化的PB92蛋白酶突变体，其浓度变化范围为0-1.74mg纯化的蛋白酶/升肥皂水。用一个容器按同样方法测定PB92蛋白酶用作比较。在40℃进行洗涤试验。结果如表1所示。

B.于25℃，用含有某些PB92蛋白酶突变体的相同洗涤剂重复洗涤性能试验。再次用PB92蛋白酶作对照。其它测试条件与上述相同。结果如表2所示。

表2

于25℃在含STPP粉末洗涤剂中

PB92蛋白酶突变体相对于PB92

蛋白酶的洗涤性质（%）

C.还于25℃和40℃，在洗涤计量器中，含有非磷酸盐漂白剂的欧洲粉末洗涤剂中测定了这些蛋白酶的洗涤性能。再次用PB92蛋白酶作参照，其它试验条件与上述相同。结果如表3所示。

表3

于25℃和40℃，在含有非磷酸盐漂白剂的

欧洲粉末洗涤剂中，PB92蛋白酶突变体相

对于PB92蛋白酶的洗涤性能（%）

实施例2

检测PB92蛋白酶突变体M216S在实施例1所述的粉末洗涤剂IEC中的贮存稳定性。于30℃和80%相对湿度（RH）条件下研究贮存稳定性，为进行这一实验，按如下方法包裹蛋白酶：

制成含下列成分的一种混合物（W/W）：2%纯化的蛋白酶、50%具有50-80E.O.单位的非离子乙氧化C₁₄-C₁₈醇、5%TiO₂、3-10%CaSO₄·2H₂O，其余为Na₂SO₄。将该混合物加热到65-90℃，冷却至室温。将得到的固化混合物研磨成颗粒。筛选出直径为0.5-1mm的颗粒，用于洗涤剂贮存试验。

将3.5克含有突变型M216S（浓度为每克洗涤剂6140ADC）的粉末洗涤剂IEC贮存在18ml玻璃瓶中。为进行比较，将PB92蛋白酶贮存在相同的条件下。经2、4、5和6周以后，测定蛋白酶的残留活性。结果如表4所示。

表4

于30℃和80%RH下，在粉末洗涤剂贮存

（数周）以后，PB92蛋白酶及其突变体

M216S的残留活性

残留活性（%）

蛋白酶 0周 2周 4周 5周 6周

PB92蛋白酶 100 25 5 3 2

M216S 100 68 31 20 11

实施例3

检测PB92蛋白酶和各种PB92蛋白酶突变体在粉末洗涤剂中贮存稳定性。在贮存稳定性试验中，使用包裹形式的蛋白酶。

于80℃混合下列成分以制成蛋白酶产品：

成分重量%

AE^＊50

TiO₂2

蛋白酶（CEP） 7

PVP^＊＊1.5

BHT^＊＊＊1

Na₂SO₄余量

^＊AE＝C₁₄-C₁₈醇的多乙氧基化物。该醇已用50-80环氧乙烷（EO）乙氧基化的

^＊＊PVP＝聚乙烯吡咯烷酮K17

^＊＊＊BHT＝2，6-双（叔丁基）-4-甲基苯酚

基本上按英国专利说明书GB1603640所述方法，通过造粒包裹该混合物。用粒径为0.3-0.8mm的颗粒来测定蛋白酶的贮存稳定性。将包裹的蛋白酶（140mg）与ALL^R碱（6.4g）和过硼酸钠四水合物（0.6g）相混合（ALL是Unilever N.Y公司的注册商标）。所用的ALL碱粉末并不含有酶或漂白剂。

于30℃和80%RH下，保温酶/洗涤剂/过硼酸钠四水合物的混合物。表5中给出了贮存指定时间后的残留活性。

表5

于30℃和80%RH下，在一种含漂白剂的粉末

洗涤剂中贮存几周以后，PH92蛋白酶及其某突

变体的残留活性

残留活性（%）

蛋白酶 0周 1周 3周 5周

PB92蛋白酶 100 51 25 15

M216Q 100 94 84 52

M216S 100 89 83 50

S160D 100 47 20 9

N212D 100 59 31 19

实施例4

按实施例3所述的方法包裹PB92蛋白酶和各种PB92蛋白酶突变体。但在本实施例中，将70mg粒径为0.3-0.9mm包裹的蛋白酶与3.2克ALL和0.3克过硼酸钠四水合物相混合。样品于30℃、18ml玻璃瓶内，贮存在真空干燥器中。在贮存期的最初三天中加真空（25mmHg）。

通过施加真空，可增加水蒸气的传送速度，从而使该体系在80%RH下，比不加真空的体系能更快地达到平衡。80%的RH是由溴化钾的饱和溶液造成的。

表6中给出了经一定时间（几周）贮存后的残留活性。

表6

在30℃和80%RH下，在含一种漂白剂中贮

存后，PB92蛋白酶和其某些突变体的残留活性

实施例5

制备如下的液体洗涤剂组合物：

成分重量%

C₁₀-C₁₃直链烷基苯磺酸 12

C₁₃醇的多乙氧基化物，8EO 13

月桂酸 8

油酸 4

三乙醇胺 6

1，2丙二醇 6

乙醇 5

柠檬酸钠 4

二亚乙基三胺-五乙酸 0.3

甲酸钙 0.12

甲酸钠 1

硼砂 1.9

NaOH，25%W/W溶液调至PH11.2

水补足余量

在该组合物中加入一定量的PB92蛋白酶和各种PB92蛋白酶突变体以使蛋白酶的初始浓度为0.13%W/W。含蛋白酶的组合物于37℃贮存指定天数后，测定蛋白酶的稳定性（以残留活性的%表示）。结果如表7所示。

表7

PB92蛋白酶和其某些突变体于37℃在-

液体洗涤剂组合物中贮存以后的残留活性

实施例6

按下述方法配制PB92蛋白酶和它的一些突变体。对于各种蛋白酶均制备含有下列成分的混合物：

成分重量%

淀粉胶CLS 45

蔗糖 23

山梨糖醇 17

甘油 4

石腊油 3

NaH₂PO₄0.5

蛋白酶（CEP） 5.0

PVP K17 1.5

TiO₂1

除下列之点以外基本上按美国专利US4242219实施例5中所述的方法将这些混合物制成颗粒：1°用上述混合物代替该实施例中所述的混合物;2°所用的管口的直径为0.7mm，而不是1.0mm;3°颗粒不涂层。

将这些颗粒（140mg）与ALL碱（6.4克）和过硼酸钠四水合物（0.6g）相混合，放在36ml的玻璃瓶中。

在30℃和80%RH下，将玻璃瓶贮存指定时间（几周）后，测定蛋白酶的稳定性（以残留活性的%表示）。结果如表8所示。

表8

在30℃和80%RH下，在洗涤剂中贮存后

PB92蛋白酶和它的一些突变体的颗粒的剩余活性

实施例7

制成PB92蛋白酶和其某些突变体的粒状产品，并按实施例3所述方法与洗涤剂和漂白剂混合。

于30℃和60/80%RH下测定这些样品的贮存活性（以残留活性的%表示）（60%RH下12小时与80%RH下12小时交替进行）。结果如表9所示。

表9

PB92蛋白酶和其某些突变体的粒状产品于30℃

和60/80%RH下贮存后的剩余活性

实施例8

制成含有PB92蛋白酶和其某些突变体的颗粒，并按实施例6所述方法与洗涤剂和漂合剂混合。

在30℃和一定的RH下保温规定时间（60%RH下保持12小时和80%RH下保持12小时，交替进行），然后测定这些样品的贮存稳定性（以残留活性的%表示）。结果如表10所示。

表10

于30℃和60/80%RH下贮存后PB92和

其某些突变体颗粒的残留活性

实施例9

测定PB92蛋白酶和其某些突变体在30℃和80%RH下，在含漂白剂的粉末洗涤剂中的贮存稳定性。这种试验中所用的蛋白酶均按下述方法包裹：

在80℃下制备含下列成分的混合物：

成分重量%

非离子成分^＊45

TiO₂2

蛋白酶（CEP） 10

Na₂SO₄补足余量

^＊非离子成分＝C₁₄～C₁₈醇多乙氧基化物（50-80EO基团）

将上述混合物冷却至室温。将固化的混合物研磨成小颗粒。筛选出0.3-0.8mm的颗粒，用于贮存实验。

为进行贮存实验，将140mg已包裹的蛋白酶与6.4g ALL碱性粉末洗涤剂和0.6g过硼酸钠四水合物相混合。ALL碱性粉末既不含酶也不含过硼酸钠。在30℃和80%RH下保温该ALL碱/蛋白酶/过硼酸钠四水合物混合物。

贮存0、1、2或4周后，测定各种蛋白酶的贮存稳定性（以残留活性的%表示）。结果示于表11中。

表11

PB92蛋白酶和其某些突变体于30℃和80%

RH下，在一种含有漂白剂的粉末洗涤剂中贮存以

后的残留活性

实施例10

在洗涤试验中测定PB92蛋白酶突变体，试验条件基本与实施例1所述的条件相同，不同的是将0.375克含下列成分的液体洗涤剂加到洗涤计量器容器中的250ml水（5°GH）内。

成分重量%

月桂酸 8

油酸 4

C₁₀～C₁₃直链烷基苯磺酸 12

C₁₃醇多乙氧基化物，8EO 13

三乙醇胺 6

1，2丙二醇 6

乙醇 5

氢氧化钠，45%W/W 4

柠檬酸钠 4

水加至100

（肥皂水PH为7.2）

于25℃，在洗涤计量器中测定该液体洗涤剂中各种蛋白酶的洗涤性能，测定时间为3分钟。洗涤后按实施例1所述方法检测试验布样的反射率。按实施例1所述方法测定突变型蛋白酶的洗涤性能。结果如表12所示。

表12

PB92蛋白酶突变体于25℃在液体洗涤剂中的

洗涤性能

蛋白酶洗涤性能相对于PB92蛋白酶的比活性（%）

212D + 100

160D + 73

S160G，N212D + 76

M216S 0 40

M216Q 0 37

0：相对于PB92蛋白酶来说，洗涤性能为100%±20%（保留的洗涤性能）

+：相对于PB92蛋白酶来说，洗涤性能＞120%。

-：相对于PB92蛋白酶来说，洗涤性能＜80%。

测定存在于商品液体洗涤剂（商品名为Tide^R、Wisk^R和Ariel^R）中的各种蛋白酶的洗涤性能。不锈钢容器内分别含有0.375g Tide（在250ml5°GH水中）、0.375g Wisk（在250ml5°GH水中）或1.25g Ariel（在250ml15°GH水中）。在25℃或40℃测定洗涤性能。其它条件与实施例1相同。结果如表13所示。

表13

PB92蛋白酶突变体于25℃和40℃，在Tide、

Wisk和Ariel中PB92的洗涤性能

蛋白酶 Tide Wisk Ariel

25℃ 40℃ 25℃ 40℃ 40℃

N212D + + + + 0

S160D + + + + +

M216Q 0 + 0 + +

M216S ND 0 0 0 0

S160Q - - - - -

S160N - - - - 0

S160K - - - - -

S160A - - - - -

S160D，M216Q + + + + +

S160D，M216S 0 - + + 0

M117L，M216Q ND - ND - 0

M117L，M216S ND - ND - -

ND＝未测

0：相对于PB92蛋白酶来说，洗涤性能为100±20%

+：相对于PB92蛋白酶来说，洗涤性能＞120%

-：相对于PB92蛋白酶来说，洗涤性能＜80%

实施例11

在模拟真实规模的洗涤机中用TNO（Delft，the Netherland，清洗技术研究所）的测试方法测定PB92蛋白酶突变体的洗涤性能。将这些突变体的洗涤性能与PB92蛋白酶相比较。

所有蛋白酶在IEC洗涤剂中的剂量均以蛋白质重量为基础的（0.007%W/W）。这些剂量所产生的活性分别为：

PB92蛋白酶 1460ADU/克洗涤剂

M216S 679ADU/克洗涤剂

M216Q 479ADU/克洗涤剂

S160D 1080ADU/克洗涤剂

N212D 1455ADU/克洗涤剂

对于每种洗涤剂蛋白酶组合物，均于40℃，在相同的AEG Turnamat twinup洗涤机中进行8次洗涤试验。在各洗涤机中均使用170g洗涤剂。试验期间，对于被研究的各粉末洗涤剂，在各洗涤机中的洗涤转数均相同。

试验期间使用由Delft城供应的有下列平均规格的普通自来水：

碱性（M）：2.2mmol/L

硬度（H）：1.6mmol/L（9°GH）

温度：20℃

从试验布样上去除污斑和杂色

每次试验中将6块带有三种污迹的EMPA小块布样（编号为111、116和117）与脏衣服一起洗涤。

然后通过在测试布样上传出的三色蓝光垂直线束估计人为污染的测试布样上污迹去除情况。测定从测试布样中以45°角再发射的光量。根据IEC出版物456号，氧化镁的减少值固定为100。对于特定种类的污染来说，该减少值越大，去污力越好。

洗衣机的荷载

放入洗衣机中的荷载为4.75千克，包括测试的布样和一般家用的已弄脏的衣物。

待洗物包括：

6块炊巾

4件旧衣服

4条床单

4个枕套

必要时，可再加入一些干净的床单和枕套以达到所要的荷载量。

每次洗涤过程中，要精心选择要洗的衣物。在一个洗衣机中选用的每块布样，在其它洗衣机中洗涤时也应有同样脏的对应物。这样，在每次洗涤过程中，污物荷重都是相等的。

洗涤过程的参数

洗涤条件 40℃

主洗水量 19升

最高温度洗涤时间 15分钟

最高温度 43℃

洗涤时间 45分钟

加入水量 7升

稀释肥皂水后的温度 30℃

排水量 17升

每次用17升冷水漂洗5次

8次洗涤试验后测定减少（V）和比率（R）的平均值。结果如表14所示。

表14

通过Student氏t-试验法检测P-值，以确定测得的差别是否是真实或仅仅是偶然发现的。P-值为0.05或更小意思是指偶然发现所测得的差别或更大差异的机会为5%或更少。P-值为0.05-0.10是指所发现的差别在统计学上来说是差不多有意义的：偶然发现该差别或更大差别的机会为5%-10%。

实施例12

图2A或2B表示按实施例1所述的试验方法，4g IEC/升中各种PB92蛋白酶突变体相对于天然PB92蛋白酶的洗涤性能（作为其比活性的函数）。该示意图涉及下列突变型蛋白酶：

1 PB92 蛋白酶 11 M216P

2 M216A 12 M216T

3 M216C 13 M216W

4 M216S 14 M216I

5 M216L 15 M216G

6 M216E 16 M117L，H118D

7 M216K 17 M117L，M216Q

8 M216H 18 M117L，H118D，M216Q

9 M216N 19 M117L，M216S

10 M216Q 20 M117L，H118D，M216S

21 M169S 31 S259K

22 M216Y 32 W235R

23 M169I，M216S 33 H243R

24 M216^-OX34 H243R，S259K

25 N212S 35 D175N

26 N212D 36 E134K

27 S160G，N212D 37 W235R，S259K

28 L211Y 38 W235R，H243R

29 L211Y，N212S 39 S259K

30 A166D，M169I 40 T207K

41 S160N 51 S160I

42 S160G 52 S160G，M216S

43 S160P 53 S160G，M216Q

44 S160T 54 S160L

45 S160C 55 S160Y

46 S160Q 56 S160D，M216S

47 S160D 57 G116V，S126V，P127E，S128K

48 S160K 58 G116V，S126L，P127N，S128V

49 S160R 59 G116V，S126I，P127Q，S128A

50 S160A 60 G116V，S126V，P127M

61 S126M，P127A，S128G

62 G116V，S126Y，P127G，S128L

63 G116V，S126N，P127H，S128I

64 G116V，S126H，P127Y

65 G116V，S126R，P127S，S128P

66 G116V，S126F，P127Q

67 G116V，S126G，P127Q，S128I

68 G116V，S126F，P127L，S128T

69 G116V，S126Q，P127D

图3显示了按实施例1中所述的试验在7克IEC/升中相对于天然PB92蛋白酶来说，各种PB92蛋白酶突变体的洗涤性能与其比活性的函数关系。该图中涉及的突变型蛋白酶与图2A和2B中相同。

本说明书中所提及的所有出版物（包括专利说明书）均表明与本发明有关的本领域技术人员的技术水平。本文中所列的所有出版物均有其具体的参考范围，而且明确指出所列出的参考文献。

通过附图和实施例，对上述发明已作了较详细的描述以达到清楚理解的目的，显然对本技术领域的一个普通技术人员来说，在不背离待批权利要求的精神或范围的情况下可作许多变更和修改。

Claims

1、一种含有突变型蛋白水解酶的酶产品，它是通过表达编码该酶的基因而得到的，该酶具有至少在一个氨基酸处不同于野生型酶的氨基酸顺序，这种突变型酶的特征在于用于洗涤剂中时显示出改善了的性质。

2、根据权利要求1的酶产品，其中所说的突变型蛋白水解酶在洗衣剂中显示出改善了的洗涤性能。

3、根据权利要求1的酶产品，其中所说的突变型蛋白水解酶在洗衣剂贮存过程中具有改善了的稳定性和保持不变的洗涤性能。

4、根据权利要求3的酶产品，其中所说的突变型蛋白水解酶具有改善了的稳定性，包括对氧化剂的稳定性。

5、根据权利要求1～4之任一项的酶产品，其中所说的突变型蛋白水解酶是由一种天然产生的细菌丝氨酸蛋白酶衍生的。

6、根据权利要求1～5之任一项的酶产品，其中所说的基因是由一种嗜碱杆菌菌株的野生型基因得到的。

7、根据权利要求1-5之任一项的酶产品，其中所说的基因是由选自枯草芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌和淀粉液化芽孢杆菌的一种菌株的野生型基因衍生的。

8、根据权利要求6的酶产品，其中野生型基因编码与PB92丝氨酸蛋白酶的氨基酸顺序至少有70%同源性的氨基酸顺序。

9、根据权利要求6的酶产品，其中所说的野生型基因实质上编码下列氨基酸顺序：

H₂N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH。

10、根据权利要求9的酶产品，其中所说的野生型基因是由芽孢杆菌新种PB92得到的。

11、一种根据权利要求1～10之任一项的突变型蛋白水解酶，其为选自下列一组PB92丝氨酸蛋白酶突变型者：〔N212D〕;〔S160D〕;〔S160G，N212D〕;〔S160D，M216S〕;〔A166D，M169I〕;〔G116V，S126V，P127E，S128K〕;〔G116V，S126G，P127Q，S128I〕;〔G116V，S126L，P127N，S128V〕;〔G116V，S126L，P127Q，S128A〕;〔G116V，S126V，P127M〕;〔G116V，S126H，P127Y〕;〔G116V，S126R，P127S，S128P〕;〔G116V，S126F，P127Q〕;〔G116V，S126F，P127L，S128T〕;〔S126M，P127A，S128G〕;〔S126M，P127A，S128G，S160D〕;以及〔G116V，S126N，P127S，S128A，S160D〕。

12、一种选择用于洗涤剂中具有改善性能的蛋白水解酶的方法，其包括如下步骤：

对编码所需之蛋白水解酶的已克隆的基因或其片段进行诱变;

分离所得到的突变型蛋白酶基因;

将所说的突变型蛋白酶基因引入适于表达和生产的合适的宿主菌株中;

回收所产生的突变型蛋白酶;并鉴定用于洗涤剂中时具有改善之性质的那些突变型蛋白酶。

13、编码权利要求1～11之任一项中限定的突变型蛋白水解酶的突变型基因。

14、含有权利要求13的突变型基因的表达载体。

15、用权利要求14的表达载体转化的原核宿主菌株。

16、根据权利要求15的已转化的原核宿主菌株，其为另一种芽孢杆菌。

17、根据权利要求16的一种转化的原核寄主菌株，其为一种嗜碱芽孢杆菌。

18、根据权利要求17的转化的原核宿主菌株，其为芽孢杆菌新种。PB92或它的突变体。

19、根据权利要求16的转化的原核宿主菌株，其为选自枯草芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌和淀粉液化芽孢杆菌者。

20、根据权利要求15～19之任一项的转化的原核宿主菌株，其为在所说的转化前实质上不能产生细胞外蛋白水解酶的。

21、一种在权利要求1～11之任一项中限定的突变型蛋白水解酶的制备方法，该方法包括在合适的发酵条件下培养一种用含有突变型蛋白水解基因的表达载体转化的宿主菌株，并回收所说的已产生的酶。

22、含有一种或多种根据权利要求1～11之任一项的酶产品的洗涤剂组合物。

23、根据权利要求1～11之任一项的一种或多种酶产品在洗涤组合物中的应用。

24、根据权利要求1～11之任一项的一种或多种酶产品在洗涤过程中的应用。