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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue proteolytische Enzyme mit verbesserten
Eigenschaften zur Verwendung in Reinigungsmitteln. Diese Eigenschaften
umfassen verbesserte Fleckentfernungsfähigkeiten von Waschmittelzusammensetzungen,
verbesserte Stabilität
von Waschmitteln bei Lagerung und verbesserte Stabilität von aus
den Reinigungsmitteln hergestellten Seifenlaugen.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Verwendung enzymatischer Additive, vor allem proteolytischer Enzyme,
in Reinigungsmittelzusammensetzungen, um die Entfernung von Verschmutzungen
auf Eiweißbasis
zu ermöglichen,
wurde schon umfassend dokumentiert. Siehe beispielsweise die veröffentlichten
europäischen
Patentanmeldungen
EP-A-0.220.921 und
EP-A-0.232.269 ,
die
US-Patente Nr. 4.480.037 und
Re 30.602 und den Artikel "Production of Microbial
Enzymes", Microbial
Technology, Bd. 1, 281–311,
Academic Press (1979).
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Reinigungsmittelzusammensetzungen
können
in Pulver-, Flüssigkeits-
oder Pastenform vorliegen. Sie enthalten eine oder mehrere anionische,
nichtionische, kationische, zwitterionische oder amphotere Verbindungen
als aktives Reinigungsmittelmaterial. Solche Verbindungen wurde
in Schwartz, Perry und Berch, "Surface
Active Agents",
Bd. II, Interscience Publishers (1958), ausführlich beschrieben. Außerdem können sie Maskierungsmittel,
Stabilisierungsverbindungen, Aromaverbindungen und in manchen Fällen auch
Oxidationsmittel, die üblicherweise
als Bleichmittel bezeichnet werden, umfassen. Reinigungsmittelzusammensetzungen
werden zur Reinigung von harten Oberflächen, zur Reinigung von Toiletten,
zum Geschirrspülen
(entweder automatisch oder per Hand) und zur Reinigung von Wäsche verwendet.
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Waschmittel
werden im Allgemeinen in zwei Hauptgruppen unterteilt: Flüssigwaschmittel
und Pulver. Flüssigwaschmittel
weisen hohe Konzentrationen von Tensiden mit ei nem neutralen bis
mäßig basischen
pH auf und enthalten normalerweise keine Bleichmittel. Pulverwaschmittel
weisen meistens hohe Basizität
auf (Laugen-pH 9–11);
sie enthalten Maskierungsmittel, wie beispielsweise Natriumtripolyphosphat,
und je nach Waschgewohnheiten des jeweiligen Landes, in dem sie
verkauft werden, können
sie Bleichmittel enthalten oder auch nicht.
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Enzyme,
die derzeit in Reinigungsmittelzusammensetzungen verwendet werden,
werden in Form von flüssigen
Suspensionen, Solen oder Granulaten zugesetzt. In Pulverwaschmitteln
sind die proteolytischen Enzyme im Allgemeinen beispielsweise in
eingekapselter Form vorhanden, wie z. B. als Sprühkondensat („prill") (z. B. MAXATASE® und
MAXACAL®)
oder Granulate (z. B. SAVINASE® und ALCALASE®).
MAXATASE und MAXACAL werden von International Bio-Synthetics B.
V. (Rijswijk, Niederlande) vertrieben, SAVINASE und ALCALASE von
Novo Industri A/S (Bagsvaerd, Dänemark).
In Flüssigwaschmitteln
sind Enzyme meistens in gelöster
Form vorhanden.
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Proteolytische
Enzyme sind im Allgemeinen schwer mit Waschmittelzusammensetzungen
zu kombinieren. Sie müssen
während
der Anwendung stabil und aktiv sein, beispielsweise bei der Entfernung
von eiweißhaltigen
Flecken. auf Stoffen während
eines Waschvorgangs bei Temperaturen im Bereich von etwa 10°C bis über 60°C. Außerdem müssen sie
während
der Lagerung längere
Zeit im Waschmittel stabil bleiben. Folglich müssen Enzyme in Gegenwart von
Maskierungsmitteln, Tensiden, hoher Basizität, in machen Fällen Bleichmitteln
und hohen Temperaturen stabil und funktionsfähig sein. Da es weder universelle
Waschmittel noch universelle Waschbedingungen (pH, Temperatur, Laugenkonzentration,
Wasserhärte)
gibt, die überall
auf der Welt gleich sind, können
die Anforderungen an Enzyme je nach Art des Waschmittels, in dem
sie verwendet werden, und den Waschbedingungen variieren.
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Die
Bedingungen, welche die Stabilität
von Enzymen in Pulverwaschmitteln bestimmen, sind im Allgemeinen
nicht optimal. Beispielsweise wirken während der Lagerung von Enzympräparaten
in Pulverwaschmitteln trotz der scheinbaren physikalischen Tren nung
des Enzyms von der Reinigungsmatrix durch Einkapselung des Enzyms
Oxidationsmittel vom Waschmittel auf die Protease und verringern
ihre Aktivität.
Eine weitere Ursache für
die Instabilität
des Enzyms in Pulverwaschmitteln während der Lagerung ist Autolyse,
vor allem bei hoher relativer Feuchtigkeit.
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Darüber hinaus
bringen Oxidationsmittel, die oft in Pulverwaschmitteln vorkommen,
bei Verwendung als Waschmittel einen großen Nachteil in Bezug auf die
Fleckenentfernungseffizienz mit sich, da sie eiweißhaltige
Flecken auf dem Stoff fixieren. Außerdem verringern diese Oxidationsmittel
und andere Waschmittelkomponenten, wie beispielsweise Maskierungsmittel,
auch während
des Waschvorgangs die Wirksamkeit der Protease bei der Fleckenentfernung.
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Bei
Flüssigwaschmitteln
besteht ein bedeutendes Problem in der raschen Inaktivierung von
Enzymen, vor allem bei erhöhten
Temperaturen. Da die Enzyme in dem Waschmittelprodukt in gelöster Form
vorhanden sind, findet diese Inaktivierung schon bei normalen Lagerbedingungen
im Waschmittelprodukt statt und verringert so die Aktivität der Enzyme
schon beträchtlich,
bevor dieses eigentlich verwendet wird. Vor allem anionische Tenside,
wie beispielsweise Alkylsulfate, in Kombination mit Wasser und Buildern
tendieren dazu, das Enzym irreversibel zu denaturieren und es inaktiv
oder für
proteolytischen Abbau anfällig
zu machen.
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Teillösungen für Stabilitätsprobleme
in Zusammenhang mit Enzymen in Flüssigwaschmitteln sind in Anpassungen
der Flüssigwaschmittelformulierung
zu finden, wie beispielsweise die Verwendung von Stabilisatoren,
um die Inaktivierung der Enzyme zu reduzieren. Siehe
EP-A-0.126.505 und
EP-A-0.199.405 ,
US-Patent Nr. 4.318.818 und
UK-Patentanmeldung Nr. 2.178.055 A .
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Ein
weiterer Ansatz, um Stabilität
von Enzymen in Flüssigwaschmitteln
zu garantieren, ist in der
EP-A-0238216 beschrieben,
wobei durch Formulierungstechnik eine physikalische Trennung zwischen
den Enzymmolekülen
und der feindlichen Flüssigwaschmittel matrix
erreicht wird. Für
Pulverwaschmittel wurden alternative Einkapselungen vorgeschlagen,
siehe beispielsweise die
EP-A-0.170.360 .
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Weiter
oben wurden die Bedingungen zusammengefasst, die proteolytische
Waschmittelenzyme erfüllen
müssen,
um optimal zu funktionieren, sowie auch die Einschränkungen
der derzeit zur Verwendung in Waschmittelzusammensetzungen erhältlichen
Enzyme. Trotz der Anstrengungen, Enzymstabilität in Waschmittelzusammensetzungen
zu gewährleisten,
tritt unter normalen Lager- und Anwendungsbedingungen immer noch
wesentlicher Aktivitätsverlust
auf.
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Eine
Identifizierung und Isolierung neuer Enzyme für eine bestimmte Anwendung,
wie beispielsweise zur Verwendung in Reinigungsmitteln, kann auf
mehrere Weisen erfolgen. Ein Weg besteht darin, nach Organismen
oder Mikroorganismen zu suchen, welche die gewünschte enzymatische Aktivität aufweisen,
das Enzym aus dem (Mikro-)Organismus oder aus einem Kulturüberstand
des (Mikro-)Organismus zu isolieren und zu reinigen, seine biochemischen
Eigenschaften zu bestimmen und zu überprüfen, ob diese biochemischen Eigenschaften
den Anforderungen der Anwendung entsprechen. Wenn das identifizierte
Enzym nicht aus dem Organismus, der es auf natürliche Weise erzeugt, erhalten
werden kann, können
DNA-Rekombinationstechniken eingesetzt werden, um das für das Enzym
kodierende Gen zu isolieren, das Gen in einem anderen Organismus
zu exprimieren, das exprimierte Enzym zu isolieren und zu reinigen
und zu testen, ob es für
die gewünschte
Anwendung geeignet ist.
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Ein
weiterer Weg, neue Enzyme für
eine gewünschte
Anwendung zu erhalten, besteht in der Modifizierung von vorhandenen
Enzymen. Das kann unter anderem durch chemische Modifizierungsverfahren
erreicht werden (siehe I. Svendsen, Carlsberg Res. Commun. 44, 237–291 (1976)).
Im Allgemeinen sind diese Verfahren zu unspezifisch, dass sie alle
zugänglichen
Reste mit gewöhnlichen
Seitenketten modifizieren, oder sie hängen von der Gegenwart von
geeigneten zu modifizierenden Aminosäuren ab, und oft können die
schwer erreichbaren Aminosäuren
nicht modifiziert werden, wenn das En zymmolekül nicht entfaltet ist. Daher
wird angenommen, dass das Enzymmodifizierungsverfahren durch Mutagenese
des Kodierungsgens besser ist. Mutagenese kann entweder durch zufallsbestimmte
Mutagenese oder durch ortsgerichtete Mutagenese erzielt werden.
Zufallsbestimmte Mutagenese durch Behandlung eines ganzen Mikroorganismus
mit einem chemischen Mutagen oder mit mutagenisierender Strahlung
kann natürlich
zu modifizierten Enzymen führen.
In diesem Fall müssen
starke Selektionsprotokolle verfügbar
sein, um nach den extrem seltenen Mutanten mit den gewünschten
Eigenschaften zu suchen. Eine höhere
Wahrscheinlichkeit, dass Enzym-Mutanten durch zufallsbestimmte Mutagenese
isoliert werden, kann erreicht werden, indem nach Klonierung des
Kodierungsgens dieses in vitro oder in vivo mutagenisiert und das
kodierte Enzym durch Reklonierung des mutierten Gens in eine geeignete
Wirtszelle exprimiert wird. Auch in diesem Fall müssen geeignete
biologische Selektionsprotokolle verfügbar sein, um die gewünschten
Enzym-Mutanten auswählen
zu können,
wie beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung
WO 87/05050 beschrieben
ist. Diese biologischen Selektionsprotokolle wählen nicht spezifisch Enzyme
zur Verwendung in Reinigungsmitteln aus.
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Die
spezifischste Weise zum Erhalt von modifizierten Enzymen ist ortsgerichtete
Mutagenese, welche eine spezifische Substitution von einer oder
mehreren Aminosäuren
durch eine beliebige andere Aminosäure ermöglicht. Die
EP-A-0130756 beschreibt beispielsweise
die Verwendung dieses Verfahrens zur Bildung von mutierten Protease-Genen, die exprimiert
werden können,
um modifizierte proteolytische Enzyme zu erhalten.
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Vor
kurzem wurde das Potenzial von Oligonucleotid-vermittelter ortsgerichteter
Mutagenese durch die Verwendung von mutagenen Oligonucleotiden demonstriert,
die so synthetisiert wurden, dass sie an verschiedenen Positionen
in einer Zielsequenz Gemische von Basen enthielten. So kann eine
Reihe von unterschiedlichen Mutationen an einer spezifischen Stelle
einer DNA-Sequenz eingeführt
werden, indem eine einzelne synthetische Oligonucleotidpräparation
verwendet wird, wie sie etwa von Hui et al., EMBO J. 3, 623–629 (1984),
Matteucci et al., Nucl. Acids Res. 11, 3113–3121 (1983), Murphy et al.,
Nucl. Acids Res. 11, 7695–7700 (1983),
Wells et al., Gene 34, 315–323
(1985), Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 710–714 (1986)
und F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987–1988, Greene
Publishers Association and Wiley, Interscience (1987), angeführt wurden.
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Stauffer
et al., J. Biol. Chem. 244, 5333–5338 (1969), hat schon herausgefunden,
dass das Methionin an Position 221 in Carlsberg-Subtilisin durch
H2O2 zu Methioninsulfoxid
oxidiert wird und für
einen dramatischen Aktivitätsabnahme
verantwortlich ist.
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Als
Ergebnis beider Verfahren, der zufallsbestimmten und der ortsgerichteten
Mutagenese, zur Bildung modifizierter Enzyme, wurden von Serin-Protease
von Bacillus amyloliquefaciens, auch "Subtilisin-BPN'" genannt,
abgeleitete Mutanten isoliert und charakterisiert. In der
WO 87/05050 ist eine Subtilisin-BPN'-Mutante mit erhöhter Thermostabilität offenbart.
In der
EP-A-0130756 ist
beschrieben, dass ortsgerichtete Mutagenese von Methionin an Position
222 in Subtilisin-BPN' durch
alle 19 möglichen
Aminosäuren,
unter Verwendung des so genannten "Kassettenmutagenese"-Verfahrens, zu Enzymen führen kann,
die gegenüber
Oxidation durch H
2O
2 resistent
sind. Im letzteren Fall weisen die meisten Mutanten jedoch geringe
proteolytische Aktivität
auf. Die besten Mutanten, die gefunden wurden, waren M222A und M222S,
welche im Vergleich zum nativen Subtilisin-BPN' eine spezifische Aktivität von 53%
bzw. 35% wie in Estell et al., J. Biol. Chem. 260, 6518–6521 (1985),
beschrieben wurde.
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Frühere Arbeiten über die
Bildung modifizierter Proteasen zeigen, dass Subtilisin-BPN'-Mutanten mit veränderten Stabilitätseigenschaften
und veränderten
kinetischen Eigenschaften erhalten werden können; siehe die oben genannte
Literatur und andere Literaturhinweise, beispielsweise Rao et al.,
Nature 328, 551–554 (1987),
Bryan et al., Proteins 1, 326–334
(1986), Cunningham und Wells, Protein Engineering 1, 319–325 (1987),
Russell et al., J. Mol. Biol. 193, 803–819 (1987), Katz und Kossiakoff,
J. Biol. Chem. 261, 15480–15485 (1986)
und die Übersichtsartikel
von Shaw, Biochem. J. 246, 1–17
(1987), und Gait et al., Protein Engineering 1, 267–274 (1987).
Keiner dieser Literaturhinweise hat jedoch zur industriellen Produktion
von proteolytischen Enzymen mit verbesserter Waschleistung und Stabilität in Waschmitteln
geführt.
Keine der modifizierten Proteasen war unter relevanten Anwendungsbedingungen
vom selben oder von höherem
kommerziellem Wert als derzeit verwendete Reinigungsmittelenzyme.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Protease-Mutante
zur Verwendung in Reinigungsmitteln, vor allem Waschmitteln, bereit.
Diese neue Enzym-Mutante weist zumindest 90%ige Homologie mit der
Aminosäuresequenz
von PB92-Serin-Protease mit folgender Aminosäuresequenz auf:
die sich
um zumindest eine Aminosäuresubstitution
an einer ausgewählten
Stelle, die Position 212 in der PB92-Serin-Protease entspricht,
von Asparagin zu Asparaginsäure
oder Glutaminsäure
unterscheidet; und die in Bezug auf PB92-Protease verbesserte Waschleistung
und/oder verbesserte Stabilität
aufweist.
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In
einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein neues
enzymatisches Reinigungsmittel bereit, das ein proteolytisches Enzymprodukt
umfasst, das zumindest eine dieser neuen proteolytischen Enzym-Mutanten
enthält.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Testsystem
bereit, das eine effiziente Auswahl von proteolytischen Enzym-Mutanten
mit verbesserten Eigenschaften zur Verwendung in Waschmitteln aus
Dutzenden von Enzymen ermöglicht.
Solche Enzyme werden durch Expression von mutagenisierten Protease-Genen
hergestellt.
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Im
der folgenden detaillierten Beschreibung werden diese und andere
Aspekte der Erfindung genauer erläutert.
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KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
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1A zeigt
den Aufbau des Mutationsvektors, der das PB92-Protease-Gen enthält.
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1B ist
eine schematische Darstellung des verwendeten Mutationsverfahrens.
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1C zeigt
den Aufbau eines Expressionsvektors, der eine PB92-Protease-Gen-Mutante
enthält.
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2A, 2B und 3 zeigen
die Waschleistung in Gegenüberstellung
zur spezifischen proteolytischen Aktivität von verschiedenen PB92-Protease-Mutanten
unter unterschiedlichen Waschbedingungen.
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4 zeigt
die Nucleotidsequenz des PB92-Protease-Gens und die Aminosäuresequenz
des kodierten Vorläuferenzyms.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Der
Begriff "mit verbesserten
Eigenschaften",
der in dieser Beschreibung in Zusammenhang mit "proteolytischen Enzym-Mutanten" verwendet wird,
bezeichnet proteolytische Enzyme mit verbesserter Waschleistung
oder verbesserter Stabilität
bei gleichbleibender Waschleistung in Bezug auf die entsprechende
Protease vom Wildtyp.
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Der
Begriff "Waschleistung" von proteolytischen
Enzym-Mutanten ist in dieser Beschreibung als Beitrag einer proteolytischen
Enzym-Mutante zur Reinigung von Wäsche zusätzlich zur Wirkung der Reinigungsmittelzusammensetzung
ohne Enzym unter relevanten Waschbedingungen definiert.
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Der
Begriff "relevante
Waschbedingungen" wird
verwendet, um die Bedingungen zu bezeichnen, die in Haushalten in
einem Waschmittel-Marktsegment wirklich vorherrschen, vor allem
die Waschtemperatur, Zeit, Waschtechnik, Laugenkonzentration, Waschmittelart
und Wasserhärte.
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Der
Begriff "verbesserte
Waschleistung" wird
verwendet, um anzugeben, dass bei der Fleckenentfernung unter "relevanten Waschbedingungen" ein besseres Endresultat
erzielt wird oder dass – bezogen
auf das Gewicht – weniger
der proteolytischen Enzym-Mutante
notwendig ist, um dasselbe Endresultat wie beim entsprechenden Enzym
vom Wildtyp zu erhalten.
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Der
Begriff "gleichbleibende
Waschleistung" wird
verwendet, um anzugeben, dass die Waschleistung einer proteolytischen
Enzym-Mutante unter "relevanten
Waschbedingungen" – bezogen
auf das Gewicht – zumindest
80% jener der entsprechenden Protease vom Wildtyp beträgt.
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Der
Begriff "verbesserte
Stabilität" wird verwendet,
um im Vergleich zum entsprechenden Enzym vom Wildtyp bessere Stabilität von proteolytischen
Enzym-Mutanten in Waschmitteln während
der Lagerung und/oder ihre Stabilität in der Lauge zu bezeichnen,
was Stabilität
gegenüber
Oxidationsmitteln, Maskierungsmitteln, Autolyse, Tensiden und hoher
Basizität
umfasst.
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Biochemische
Eigenschaften, die unter klar definierten Laborbedingungen bestimmt
werden, sind keine verlässlichen
Parameter zur Vorhersage der Leistung einer bestimmen Waschmittel-Protease
unter gewünschten
und spezifischen Anwendungsbedingungen. Diese Parameter umfassen
kinetische Daten, die auf klar definierten Substraten, wie beispielsweise
Proteinen, wie z. B. Casein, Dimethylcasein und Hämoglobin, oder
substituierten Oligopeptidsubstraten, wie z. B. sAAPFpNA (Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-propyl-L-phenylalanyl-p-nitroanilid),
gemessen werden. Scheinbar bestimmen andere Merkmale der Proteasen
ihre Wirksamkeit bei der Reinigung von Wäsche.
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass, obwohl Verfahren
zur Einführung
von Aminosäureveränderung
in Proteine vorhanden sind, die zu bedeutenden Veränderungen
ihrer biochemischen Merkmale führen
können,
eine Vorhersage der Wirkung spezifischer Mutationen unter tatsächlichen
Anwendungsbedingungen noch immer sehr ungenau oder sogar unmöglich ist.
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Gemäß vorliegender
Erfindung wurde nun durch umfassende Forschung und Versuche ein
Verfahren entwickelt, das die Herstellung von Protease-Mutanten
mit einem effektiven Selektionsverfahren der Leistung dieser Proteasen
kombiniert. Überraschenderweise
kann auf diese Art eine relativ große Anzahl an Enzymen effizient
auf ihre Leistung gescreent werden.
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Das
Testsystem gemäß vorliegender
Erfindung basiert auf der Entfernung von Protease-empfindlichen Flecken
aus Stoffproben in einem Launderometer oder Tergotometer, die relevante
Waschbedingungen imitieren. Geeignete Teststoffproben sind beispielsweise
die im Handel erhältlichen
EMPA-(Eidgenössische
Materialprüfungs-
und Versuchsanstalt, St. Gallen, Schweiz)Stoffproben, die künstlich
mit eiweißhaltigen
Flecken verun reinigt wurden. Relevante Flecken auf Stoffproben zum
Testen von Proteasen umfassen Blut-, Gras-, Schokolade- und andere
eiweißhaltige
Flecken.
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Außerdem können in
diesem Testsystem andere relevante Faktoren, wie beispielsweise
die Waschmittelzusammensetzung, Laugenkonzentration, Wasserhärte, Waschtechnik,
Zeit, der pH und die Temperatur, so geregelt werden, dass für Haushaltsanwendungen
in einem bestimmten Marktsegment typische Bedingungen imitiert werden
können.
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Die
Waschleistung von Proteasen wird am besten durch ihre Fähigkeit,
bestimmte repräsentative
Flecken unter geeigneten Testbedingungen zu entfernen, gemessen.
Diese Fähigkeit
kann durch Reflexionsmessungen auf den Teststoffen bestimmt werden,
nachdem dieser mit und ohne Enzyme in einem Launderometer oder Tergotometer
gewaschen wurde. Das Labor-Anwendungstestsystem gemäß vorliegender
Erfindung ist repräsentativ
für Haushaltsanwendungen,
wenn es für
proteolytische Enzyme, die durch DNA-Mutagenese modifiziert wurden,
angewandt wird.
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Demgemäß ermöglicht die
Erfindung das Testen von großen
Mengen unterschiedlicher Enzyme und die Auswahl jener Enzyme, die
besonders für
eine spezifische Art von Waschmittelanwendung geeignet sind. Auf
diese Art können
leicht "maßgeschneiderte" Enzyme für spezifische
Anwendungsbedingungen ausgewählt werden.
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Einige
bakterielle Serin-Proteasen werden als Subtilisine bezeichnet. Subtilisine
umfassen die Serin-Proteasen des Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens
("Subtilisin BPN'") und Bacillus licheniformis ("Subtilisin Carlsberg"). Siehe die Übersichtsartikel
von Markland und Smith in "The
Enzymes', Boyer,
Hrsg., Bd. 3, 561–608,
Academic Press, New York (1971). Bacillus-Stämme, wie beispielsweise alkalophile
Bacillus-Stämme,
produzieren andere Proteasen. Beispiele für die letztere Kategorie sind
die Serin-Proteasen
in MAXACAL®,
hierin im Folgenden auch als PB92-Protease bezeichnet (von Bacillus
nov. spec. PB92), und in SAVINASE®, die
schon weiter oben erwähnt
wurden.
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Die
Aminosäuresequenz
der PB92-Protease ist in
4 dargestellt. Die reife Protease
besteht aus 269 Aminosäuren,
die ein Molekulargewicht von etwa 27.000 D ausmachen, und weist
einen isoelektrischen Punkt im hohen basischen Bereich auf. Die
Aktivität
der PB92-Protease auf ein Proteinsubstrat wird in Alkaline Delft
Units (ADU) angegeben. Die Aktivität in ADU wird nach dem Verfahren
bestimmt, das in der
britischen Patentbeschreibung
Nr. 1.353.317 beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass der
pH von 8,5 auf 10,0 geändert wurde.
Gereinigte PB92-Protease weist eine Aktivität von 21.000 ADU pro mg auf.
Der auf Casein gemessene Umsatz (k
cat) beträgt 90 s
–1mol
–1.
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Die
spezifische Aktivität
von gereinigten Präparaten
aus Subtilisin Carlsberg (Delange und Smith, J. Biol. Chem. 243,
2184 (1968)) beträgt
10.000 ADU/mg und die von Subtilisin BPN' (Matsubara et al., J. Biol. Chem. 240,
1125 (1965)) 7.000 ADU/mg. Außer
in den oben genannten Parametern, wie beispielsweise spezifische
Aktivität
und Umsatz (kcat), unterscheidet sich PB92-Protease
von Proteasen, wie beispielsweise Carlsberg-Subtilisin, Subtilisin BPN' und anderen Proteasen,
die in Waschmitteln formuliert werden (z. B. MAXATASE® und
ALCALASE®),
dadurch, dass sie eine hohe positive Ladung besitzt, die durch Gelelektrophorese des
nativen Proteins sichtbar gemacht werden kann, wie weiter unten
im experimentellen Teil, Abschnitt 4, beschrieben ist.
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Da
die PB92-Protease bei basischen pH-Werten aktiv zur Fleckenentfernung
beiträgt,
wird sie im Allgemeinen als Waschmitteladditiv verwendet, zusammen
mit Waschmittelbestandteilen, wie beispielsweise Tensiden, Buildern
und Oxidationsmitteln. Letztere Bestandteile werden meistens in
Pulverform verwendet. PB92-Protease weist im Vergleich zu anderen
Proteasen, wie beispielsweise den oben erwähnten Subtilisinen, eine hohe
Fleckenentfernungseffizienz auf. Das bedeutet, dass weniger PB92-Protease
erforderlich ist, um dieselbe Waschleistung zu erbringen. Empfindlichkeit
gegenüber
Oxidation ist ein bedeutender Nachteil der PB92-Protease und aller
anderen bekannten Serin-Proteasen,
die in Waschmitteln verwendet werden (siehe auch Stauffer et al.,
J. Biol. Chem. 244, 5333–5338
(1969); Estell et al., J. Biol. Chem. 263, 6518–6521 (1985)). Die Oxidation
der PB92-Protease durch entweder H2O2 oder Persäuren, die durch die Akti vatorsysteme
gebildet werden, die Perborattetrahydrat und TAED enthalten, schafft
im Vergleich zu nicht oxidierter PB92-Protease ein Enzym mit einer
spezifischen Aktivität
von 50% bzw. 10%, in ADU/mg (siehe experimenteller Teil, Abschnitt
7, und Beispiel 1).
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Das
Verfahren gemäß vorliegender
Erfindung ist äußerst gut
geeignet für
die Herstellung, das Screenen und die Auswahl von proteolytischen
Enzym-Mutanten, die von natürlich
produzierten bakteriellen Serin-Proteasen stammen. Solche Mutanten
sind beispielsweise jene, für
die ein Gen kodiert, das von einem Wildtyp-Gen eines alkalophilen
Bacillus-Stammes stammt, und vorzugsweise PB92. Auch Mutanten die
von der alkalophilen Bacillus-Serin-Protease Savinase stammen, sind
geeignet. Das Verfahren ist außerdem
vorteilhaft für
die Auswahl von modifizierten Proteasen, die von anderen Proteasen
stammen als die Serin-Proteasen von alkalophilen Bacillus-Stämmen PB92.
Bekannt sind beispielsweise die Gene, die für die Serin-Proteasen von Bacillus
subtilis, Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus licheniformis
kodieren, und diese können als
Ziel für
Mutagenese verwendet werden. Natürlich
kann entweder Oligonucleotid-gestützte ortsgerichtete Mutagenese
oder regionsgerichtete zufallsbestimmte Mutagenese sowie jedes andere
geeignete Verfahren zur effizienten Herbeiführung von Mutationen im Proteasen-Gen
eingesetzt werden.
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Das
Verfahren zur Auswahl von proteolytischen Enzym-Mutanten gemäß vorliegender
Erfindung (welches ihre Herstellung und ihr Screenen umfasst) weist
die folgenden Schritte auf: Mutagenisierung eines klonierten Gens,
das für
ein proteolytisches Enzym von Interesse oder für ein Fragment davon kodiert;
Isolierung der erhaltenen Mutanten des Proteasen-Gens oder der Proteasen-Gene;
Einführung
der besagten Mutante(n) eines Proteasen-Gens oder von Proteasen-Genen,
vorzugsweise auf einem geeigneten Vektor, in einen geeigneten Wirtsstamm
zur Expression und Produktion; Gewinnen des produzierten Protease-Mutante;
und Identifizierung der Protease-Mutanten mit verbesserten Eigenschaften
zur Anwendung in Waschmitteln.
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Geeignete
Wirtsstämme
zur Herstellung von Protease-Mutanten umfassen transformierbare
Mikroorganismen, in denen die Expression der Protease erzielt werden
kann. Vor allem Wirtsstämme
derselben Spezies oder Art, von der die Protease abstammt, sind
geeignet, wie beispielsweise ein Bacillus-Stamm, vorzugsweise ein
alkalophiler Bacillus-Stamm,
insbesondere Bacillus nov. spec. PB92 oder eine Mutante davon mit
im Wesentlichen denselben Eigenschaften. Auch B.-subtilis-, B.-licheniformis-
und B.-amyloliquefaciens-Stämme gehören zu den
bevorzugten Stämmen.
Andere geeignete und bevorzugte Wirtsstämme umfassen jene Stämme, die
im Wesentlichen zur Produktion extrazellulärer proteolytischer Enzyme
vor der Transformation mit einer Gen-Mutante unfähig sind. Von besonderem Interesse
sind Protease-defiziente Bacillus-Wirtsstäme, wie beispielsweise ein
Protease-defizientes Derivat von Bacillus nov. spec. PB92. Die Proteasen
können
exprimiert werden, indem Expressionssignale verwendet werden, die
im gewählten
Wirtsorganismus funktionieren. Expressionssignale umfassen Sequenzen
von DNA, die die Transkription und Translation der Proteasen-Gene regulieren.
Geeignete Vektoren können
sich in ausreichend hoher Zahl in einem Wirtsstamm nach Wahl replizieren
oder eine stabile Aufrechterhaltung des Protease-Gens im Wirtsstamm
durch chromosomale Integration ermöglichen.
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Die
proteolytischen Enzym-Mutanten gemäß vorliegender Erfindung werden
durch Kultivierung eines transformierten Wirtsstamms, der die gewünschte(n)
Mutante(n) des/der proteolytischen Gens oder Gene umfasst, unter
geeigneten Fermentationsbedingungen und Gewinnung der produzierten
Enzyme hergestellt.
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Vorzugsweise
werden die zu exprimierenden Proteasen in das Kulturmedium, was
ihre Gewinnung erleichtert, oder im Fall von gramnegativen bakteriellen
Wirtsstämmen
in den periplasmatischen Raum sekretiert. Zur Sekretion wird eine
geeignete aminoterminale Signalsequenz eingesetzt, vorzugsweise
die Signalsequenz, für
die das ursprüngliche
Gen kodiert, wenn dieses im gewählten
Wirtsstamm funktionsfähig
ist.
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung können geeignete Waschleistungstests
entwickelt werden, die für
Waschbedingungen in jedem beliebigen Haushalt des Marktes repräsentativ
sind. Beispielsweise wurde ein geeigneter Test für den europäischen Hochleistungs-Pulverwaschmittelmarkt
entwickelt, bei dem Pulverwaschmittel, die Bleichmittel enthalten
können
oder auch nicht, bei Laugenkonzentrationen von 1–10 g Waschmittel/l bei 10–20°d (Deutscher
Härte)
und bei Temperaturen von 25–80°C verwendet
werden. Genauer gesagt wurde ein Pulverwaschmittel, das TAED und
Perborat enthielt, bei einer Laugenkonzentration von 4, 7 oder 10
g Waschmittel/l bei 15°d
bei 40°C
verwendet.
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Außerdem wurden
Tests bereitgestellt, die für
Waschvorgänge
mit Flüssigwaschmitteln
repräsentativ sind.
Diese Waschmittel werden im Allgemeinen bei Laugenkonzentrationen
von 1,5–5
g Waschmittel/l bei 5–15°d bei Temperaturen
zwischen 15 und 40°C
eingesetzt. Genauer gesagt wurden nichtbleichende Flüssigwaschmittelzusammensetzungen
bei einer Laugenkonzentration von 1,5 g Waschmittel/l, 5°d, bei 25°C und 40°C, was die
Flüssigwaschmittelbedingungen
der USA repräsentiert,
sowie bei einer Laugenkonzentration von 5 g Waschmittel/l, 15°d, bei 40°C, was europäische Flüssigwaschmittelbedingungen
repräsentiert,
verwendet.
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Geeignete
Leistungstests können
auch für
andere Bedingungen, die auf dem Markt vorkommen, entwickelt werden.
Stoffproben, die mit proteaseempfindlichen Flecken beschmutzt wurden,
insbesondere Stoffproben mit Blut-, Gras-, Schokolade- oder anderen
eiweißhaltigen
Flecken, genauer gesagt die EMPA-Stoffproben 116 und 117, werden
in repräsentativen
Waschleistungstests verwendet.
-
Die
Eigenschaften der natürlich
vorkommenden oder natürlich
mutierten Waschmittel-Proteasen
können
verbessert werden, indem eine Reihe von Mutationen in das Enzym
eingeführt
werden. Größtenteils
sind die Mutationen Substitutionen, entweder konservative oder nichtkonservative,
aber auch Deletionen und Insertionen sind geeignet.
-
Für konservative
Substitutionen kann die folgende Tabelle verwendet werden:
-
Aliphatisch
-
neutral
-
- nicht polar G, A P, L, I, V
- polar C, M, S, T, N, Q
-
geladen
-
- anionisch D, E
- kationisch K, R
-
Aromatisch F, H, W, Y
-
worin
jede Aminosäure
durch eine andere Aminosäure
in derselben Kategorie, insbesondere auf derselben Linie, substituiert
werden kann. Außerdem
können
die polaren Aminosäuren
N, Q die geladenen Aminosäuren
substituieren oder durch sie substituiert werden. Zum Zweck der
vorliegenden Erfindung sind vor allem Substitutionen von Interesse,
die zu einem erhöhen
anionischen Charakter der Protease führen, insbesondere an Stellen,
die nicht direkt mit der aktiven Stelle zusammenhängen.
-
Regionen
von besonderem Interesse in Bezug auf Mutationen sind jene Aminosäuren innerhalb
einer Entfernung von 4 Å vom
Hemmmolekül
Eglin C, wenn Eglin C an die aktive Stelle gebunden ist.
-
Die
folgende Nummerierung basiert auf einer PB92-Protease, aber die Überlegungen
sind auch für
andere Serin-Proteasen mit einer im Wesentlichen homologen Struktur
von Interesse, vor allem für
jene mit einer Homologie von über
etwa 90%.
-
Diese
Positionen sind 32, 33, 48–54,
58–62,
94–107,
116, 123–133,
150, 152–156,
158–161,
164, 169, 175–186,
197, 198, 203–216,
wobei die meisten dieser Positionen für direkte Wechselwirkung mit
einem proteinhaltigen Substrat verfügbar sind. Normalerweise werden
die Positionen 32, 62, 153 und 215 nicht substituiert, da Mutationen
an diesen Stellen meist die Waschleistung verschlechtern.
-
Positionen
für Substitutionen,
die von besonderem Interesse sind, umfassen 60, 94, 97–102, 105,
116, 123–128,
150, 152, 160, 183, 203, 211, 212, 213, 214 und 216. An manchen
Positionen wird versucht, eine instabile Aminosäure, beispielsweise Methionin,
in eine oxidativ stabilere Aminosäure, beispielsweise Threonin,
zu verwandeln, während
gleichzeitig die allgemeine Struktur und das Volumen der Aminosäure an dieser Stelle
beibehalten werden. In anderen Situationen zeigte sich, dass durch
den Ersatz der natürlichen
Aminosäure
durch fast jede andere Aminosäure
bessere Ergebnisse erzielt werden können, vor allem durch den Ersatz
der hydroxylierten Aminosäuren,
S, T, durch eine polare oder nicht-polare Aminosäure oder sogar eine aromatische
Aminosäure.
-
Substitutionen
von besonderem Interesse umfassen:
G116 | I,
V, L |
S126 | beliebige
Aminosäure |
P127 | beliebige
Aminosäure |
S128 | beliebige
Aminosäure |
S160 | anionisch
oder neutral aliphatisch oder R |
A166 | geladen,
insbesondere anionisch |
M169 | neutral
aliphatisch, insbesondere apolar |
N212 | anionisch |
M216 | aliphatisch
polar, insbesondere S, T, N, Q |
-
Überraschenderweise
ist, obwohl die meisten Mutationen zu geringerer spezifischer Aktivität der Protease
mit herkömmlichen
Substraten führen,
die Waschleistung mit dem natürlichen
Enzym vergleichbar oder sogar besser als diese, und in vielen Fällen ist
auch die Lagerstabilität
besser.
-
Die
Waschleistung einiger der PB92-Protease-Mutanten nimmt, wenn sie
als Inverse der relativen Menge eines Enzyms, die zur Erreichung
derselben Wirkung wie mit nativen Proteasen × 100% erforderlich ist, exprimiert
werden, auf mehr als 120%, in bestimmten Fällen sogar auf mehr als 180%,
zu.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden PB92-Protease-Mutanten
bereitgestellt, die bessere Lagerstabilität in einer Bleichmittel enthaltenden
Pulverwaschmittelzusammensetzung aufweisen als die native PB92-Protease
und gleichzeitig ihre Waschleistung beibehalten. Beispiele für solche Mutanten
sind M216S und M216Q sowie Mutanten mit zumindest einer dieser Mutationen
neben anderen Mutationen an anderen Stellen.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise
herausgefunden, dass ein einer Flüssigwaschmittelzusammensetzung
(die keine Oxidationsmittel enthält)
die PB92-Protease-Mutanten M216S, M216Q, S160D und N212D ihre Aktivität besser
aufrecht erhalten können
als eine PB92-Protease. Von diesen Mutanten weisen M216S und M216Q
gleichbleibende Waschleistung und S160D und N212D verbesserte Waschleistung
auf. Die Verbesserung der Lagerstabilität bei den getesteten Flüssigwaschmitteln
ist bei den Mutanten S160D und M216Q am stärksten ausgeprägt.
-
Es
ist auch möglich,
verschiedene Mutationen zu kombinieren, welche die Stabilität einer
Protease in Waschmittelzusammensetzungen erhöhen. Verschiedene Mutationen,
welche die Waschleistung desselben Proteins positiv beeinflussen,
können
zu einer einzelnen Protease-Gen-Mutante kombiniert werden, welche die
Produktion von möglicherweise
noch besseren Proteasen ermöglicht,
beispielsweise [S126M, P127A, S128G, S160D] und [G116V, S126N, P127S,
S128A, S160D]. Neue Protease-Mutanten können gebildet werden, indem
die guten Waschleistungseigenschaften von beispielsweise N212D und
S160D mit den Stabilitätseigenschaften
von beispielsweise M216S oder M216Q kombiniert werden. Die [S160D,
M216S]-Mutante weist beispielsweise verbesserte Waschleistung und
bessere Lagerstabilität
auf.
-
Nützliche
Mutanten können
auch hergestellt werden, indem beliebige Mutationen oder Mutationsgruppen,
die in dieser Beschreibung angeführt
wurden, kombiniert werden. Außerdem
ist es möglich,
hierin offenbarte nützliche
Mutationen mit Mutationen an anderen Stellen zu kombinieren, die
zu einer wesentlichen Veränderung
der Eigenschaften des Enzyms führen
können
oder auch nicht.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung sind die folgenden PB92-Protease-Mutanten:
[N212D] und [S160G, N212D].
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Um
die Bedeutung des Ansatzes dieser Erfindung zur Erhaltung neuer
Proteasen, die zur Anwendung in Waschmitteln geeignet sind, aufzuzeigen,
d. h. durch repräsentative
Anwendungstests für
Wäsche
als primäres
Auswahlkriterium, wurden die Ergebnisse der Waschleistungstests
der PB92-Protease-Mutanten mit biochemischen Parametern verglichen,
die üblicherweise
in biochemischer und enzymologischer Proteinforschung bestimmt werden.
Diese Ergebnisse führen
zu der Schlussfolgerung, dass jede Beziehung zwischen Parametern,
die Affinität
zu definierten Substrate bestimmten, und der Kinetik der proteolytischen
Reaktion und Waschleistung fehlt (siehe Tabelle 1 von Beispiel 1).
-
Daher
ist es natürlich
auch möglich,
zwei oder mehr Mutanten mit unterschiedlichen Eigenschaften in einem
Enzym-Produkt oder im selben Waschvorgang zu kombinieren. Solch
eine Kombination kann synergistische Wirkung haben oder auch nicht.
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Die
Erfindung umfasst außerdem
die Verwendung einer oder mehrerer proteolytischer Enzym-Mutanten,
wie sie hierin weiter oben definiert wurden, in einer Waschmittelzusammensetzungen
oder ein einem Waschvorgang.
-
Schließlich ist
offensichtlich, dass sich durch Deletionen oder Insertionen von
Aminosäuren
in der Protease-Polypeptidkette, die entweder künstlich durch Mutagenese geschaffen
wurde oder natürlich
in zur PB92-Protease homologen Proteasen vorkommt, die Nummerierung
der Aminosäuren
verändern
kann. Es versteht sich jedoch, dass Positionen, die homolog zu Aminosäurepositionen
einer PB92-Protease sind, innerhalb des Schutzumfangs der Ansprüche liegen.
-
Die
folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung.
-
EXPERIMENTELLER TEIL
-
Materialien und Verfahren
-
Herstellung von PB92-Protease-Mutanten
-
Das
Grundkonstrukt, von dem die Mutagenesearbeit ausgeht, wird als pM58
bezeichnet und ist in der
EP-A-0283075 im
Detail beschrieben.
-
Die
Strategie umfasst folgende drei Phasen:
- a)
Bildung eines Mutagenese-Vektors M13M1
- b) Mutationsvorgang
- c) Bildung von pM58δEco
und Subklonierung der DNA-Fragmentmutante in diesen Vektor.
-
1.a) Bildung eines Mutagenese-Vektors
M13M1
-
Das
Grundkonstrukt pM58 wurde mit den Restriktionsenzymen HpaI und BalI
verdaut. Das 1.400 bp lange Fragment, welches das PB92-Protease-Gen
enthielt, wurde auf niedrigschmelzender Agarose (Maniatis, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA (1982)) gereinigt.
-
Ein
Vektor M13MP11 (Messing et al., Nucl. Acids Res. 9, 303–321 (1981))
wurde mit SmaI verdaut. Das betreffende 1.400 bp lange Fragment
wurde in diesen Vektor ligiert und nach den von Cohen et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 69, 2110–2114
(1972), beschriebenen Verfahren in E. coli JM101 transfiziert.
-
Nach
einer Phagenvermehrung in E. coli JM101 wurde ssDNA isoliert (Heidecker
et al., Gene 10, 69–73
(1980), und das Insert und seine Ausrichtung wurden durch DNA-Sequenzierung
unter Verwendung des von Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,
6463 (1977), beschriebenen Verfahrens überprüft.
-
Der
für eine
Mutagenese geeignete Vektor wurde erhalten und M13M1 benannt. Das
oben beschriebene Verfahren ist in 1A schematisch
dargestellt.
-
1.b) Mutationsverfahren
-
Eine
Mutagenese wurde unter Verwendung von ssDNA dieses Vektors und dsDNA
von M13mp19 an M13M1 durchgeführt
(Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 303–321 (1988)), wobei letzterer
Vektor mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HINDIII verdaut wurde,
wonach das große
Fragment auf niedrigschmelzender Agarose gereinigt wurde.
-
Eine
Mutagenese wurde wie von Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441–9456 (1984),
beschrieben, jedoch mit der Modifikation, dass E. coli JM105 anstelle
von E. coli WK30-3 zur Auswahl von Mutanten verwendet wurde, durchgeführt.
-
Die
Länge der
Oligonucleotide, die zur Schaffung der spezifischen Mutationen verwendet
wurden, war 22 Nucleotide. Eine regionsspezifische Mutation, die
zur Schaffung verschiedener Mutationen in einer spezifischen DNA-Sequenz
zu dem Zeitpunkt verwendet wurde, wurde unter Einsatz eines Oligonucleotid-Präparats mit
einer Länge
von 40 Nucleotiden, wobei alle vier Nucleotide zufällig in
die Stellen aufgenommen wurden, die der/den zu mutierenden Aminosäure(n) entsprachen,
durchgeführt.
-
Nach
der Mutagenese wurden potentielle Mutanden durch Seqenzanalyse unter
Verwendung des Dideoxy-Verfahrens von Sanger, s. o., auf die relevante
Mutation untersucht. Die gesamte Einzelstrangspalte (siehe 1B)
wurde sequenziert, um das Fehlen von sekundären Mutationen zu bestätigen. Das
Verfahren ist in 1B schematisch dargestellt.
-
Das
beschriebene Verfahren ist zur Schaffung von DNA-Fragmenten mit
Mutationen in 3'-Teil
des Proteasen-Gens (Aminosäuren
154–269)
geeignet.
-
Fachleute
auf dem Gebiet der Erfindung werden erkennen, dass zur Bildung von
DNA-Fragmenten mit Mutationen
im 5'-Teil des Protease-Gens
in einem Bacillus-Vektor auch andere Restriktionsenzyme verwendet werden
können
und modifizierte PB92-Protease-Gene
analog zum Verfahren von 1A gebildet
werden können.
-
1.c) Bildung von pM58δEco und Subklonierung von DNA-Fragmenten,
welche die Mutationen in diesem Vektor enthalten (1C)
-
Um
pM58δEco
herzustellen, wurde mP58 mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut
und mit T4-Ligase unter verdünnten
Bedingungen ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um B.
subtilis 1-A40 (Bacillus Genetic Stock Centre, Ohio, USA) gemäß dem Verfahren
von Spizizen et al., J. Bacteriol. 81, 741–746 (1961), zu transformieren.
-
Zellen
aus dem Transformationsgemisch wurden auf Minimalplatten, die 20 μg/ml Neomycin
enthielten, plattiert, wie es in Beispiel 1 der
EP-A-0283075 beschrieben
ist.
-
Plasmid-DNA
von Transformanten wurde gemäß dem Verfahren
nach Birnboim und Doly, Nucleic Acids Res. 7, 1513–1523 (1979),
isoliert und durch Restriktionsenzym-Analyse charakterisiert. Auf
diese Weise wurde pM58δEco
isoliert (siehe 1C).
-
Um
eine Enzym-Mutante herzustellen, wurden die DNA-Fragmente von M13M1,
welche die gewünschten
Mutationen aufwiesen und wie in Abschnitt 1.b. beschrieben gebildet
wurden, in pM58δEco
subkloniert. dsDNA von M13M1 (siehe oben) wurde mit EcoRI verdaut
und in die EcoRI-Stelle von pM58δEco
ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um B. subtilis DB104
zu transformieren, Dio, J. Bacteriol. 160, 442–444 (1984), wobei das Verfahren
nach Spizizen et al., s. o., verwendet wurde.
-
Zellen
aus dem Transformationsgemisch wurden auf Minimalplatten, die 20 μg/ml Neocym
und 0,4% Casein enthielten, plattiert (
EP-A-0283075 ). DNA von Transformanten
produzierender Protease wurde nach dem von Birnboim und Doly, s.
o., beschriebenen Verfahren isoliert und durch Restriktionsenzymanalyse
charakterisiert.
-
2. Herstellung von Protease-Mutanten
-
Transformanten
von DB104, die erwiesenerweise den Vektor mit der Protease-Gen-Mutante
enthielten, wurden in 10 ml Trypton-Soja-Kulturlösung (TSB), das 10 μg/ml Neomycin
enthielt, inokuliert und 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Proben der Kultur
(0,1 ml) wurden in 500 ml fassende Schüttelkolben inokuliert, die
100 ml Proteaseproduktionsmedium enthielten: 12,5 g/l Hefeextrakt
(Difco), 0,97 g/l CaCl2·6H2O,
2,25 g/l MgCl2·6H2O,
20 mg/l MnSO4·4H2O,
1 mg/l CoCl2·6H2O,
0,5 g/l Citrat, 0,5 ml/l Schaumverhütungsmittel 5693, 6% (Gew./Vol.)
Maltose, 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,8 und 20 μg/ml Neomycin.
-
Nach
65-stündiger
Inkubation unter konstanter Belüftung
wurde die Proteasenaktivität
der Kulturen unter Verwendung von Dimethylcasein als Substrat und
mithilfe des von Lin et al., J. Biol. Chem. 244, 789–793 (1969),
beschriebenen Verfahrens getestet. Um größere repräsentative Menge von PB92 vom
Wildtyp und PB92-Protease-Mutanten herzustellen, wurden diese Stämme auch
bei 37°C
in belüfteten
Fermentern mit einem Volumen von 10 l oder mehr gezüchtet, wobei
im Wesentlichen dasselbe Produktionsmedium verwendet wurde wie für die Schüttelkolben.
-
Die
erhaltenen Kulturlösungen
wurden zur Proteasen-Reinigung verwendet.
-
3. Reinigung und Konzentration einer PB92-Protease
vom Wildtyp und ihrer Mutanten
-
Die
PB92-Protease vom Wildtyp und ihre Mutante, die in Schüttelkolben
oder 10 l fassenden Fermentern aus Bacillus subtilis DB104 hergestellt
wurden, wurden durch Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung
von Zeta-Prep®-Scheiben
oder -Patronen (PS-Typ, LKB) gereinigt. Die Fermentations-Kulturlösung wurde
zentrifugiert (3.000 × g,
10 min), und der Überstand
wurde 10fach mit 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 5,5 verdünnt und
dann auf den Kationenaustauscher aufgebracht. Nach dem Waschen mit
mehreren Patronenvolumen Phosphatpuffer wurde die Protease eluiert,
indem 0,4 M NaCl in den Phosphatpuffer gegeben wurden. Fraktionen,
welche Proteasenaktivität
aufwiesen, wurden gepoolt und durch Ultrafiltration mithilfe einer
Amicon-Rührzelle,
die mit einem PM-10-Filter ausgestattet war, konzentriert. Die NaCl-Konzentration wurde
durch Verdünnen
und Konzentrieren der Proteaselösung
mit Phosphatpuffer auf etwa 50 mM verringert, wonach sie bei –80°C bei einer
Proteinkonzentration von 1–10
mg/ml gelagert wurde.
-
Alternativ
dazu wurden zum Erhalt der PB92-Protease-Mutanten aus den Kulturlösungen von
Fermentationen in größerem Umfang
CaCl2 (1 Gew.-%) und Aceton (30 Gew.-%)
zugesetzt. Nachdem die Zellmasse abfiltriert worden war, wurde die
Protease aus dem erhaltenen Filtrat ausgefällt, indem 0,2–2 Gew.-% CaSO4·2H2O und weiteres Aceton bis zu einer Endkonzentration
von > 60 Gew.-% zugesetzt
wurden. Der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Aceton besprüht, gefolgt
von einer Trocknung, wodurch rohes Enzympulver (CEP) erhalten wurde.
-
4. Analysetechniken zur Überprüfung der
Reinheit von gereinigten Proteasen
-
Proteasen
wurden als rein bezeichnet, wenn durch Elektrophorese und Hochleistungs-Gelelektrophorese
(HPLC) eine einzelne Bande bzw. ein einzelner Peak gefunden wurde.
-
Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
(PAGE) in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde nach Laemmli,
Nature 227, 680–685
(1970), durchgeführt.
Einer Denaturierung der Proteinproben durch SDS bei 100°C muss jedoch
eine Inaktivierung der Proteasenaktivität vorausgehen, um eine Autodegradation
zu vermeiden. Das kann durch Inkubation mit Phenylmethylsulfonylfluorid
(PMSF) (1 mM, 30 min, Raumtemperatur) oder Fällung mit Trichloressigsäure (TCA,
8%, 30 min, auf Eis) erreicht werden. Native PAGE wurde bei pH 7,45
(Gelpuffer aus 20 mM Histidin (His) und 50 mM 3-[N-Morpholin]propansulfonsäure (MOPS))
in 5% Polyacrylamidgelen (Verhältnis
zwischen Acrylamid und Bisacrylamid 20:1) durchgeführt. Proteinproben
wurden auf Slab-Gele aufgetragen und in Richtung der Kathode elektrophoresiert.
Derselbe His/MOPS-Puffer wurde als Elektrophorese-(Tank-)Puffer
verwendet, jedoch bei pH 6,3. Nach der Elektrophorese (1½ bis 2
Std. bei 350 V) wurde das Gel mit 8% Essigsäure durchtränkt, um die Proteine im Gel
zu fixieren, und dann mit Coomassie-Brillantblau R250 eingefärbt und
laut Standardverfahren entfärbt.
-
Die
Reinheitsüberprüfung durch
HPLC wurde mithilfe einer Kationenaustauschsäule (MonoS-Pharmacia Fine Chemicals)
und einer Gelfiltrationssäule
(TSK 2000 SW-LKB) durchgeführt.
Erstere wurde in einem 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 5,5 betrieben,
und eine Elution der gebundenen Protease wurde unter Verwendung
eines linearen Gradienten von 10–300 mM Natriumphosphat pH
5,5 erhalten. Die Gelfiltrationssäule wurde in 0,25 M Natriumacetat
pH 5,5 laufen gelassen.
-
5. Bestimmung der Proteasekonzentration
-
Zur
Bestimmung der Proteinkonzentration in einer gereinigten Proteaselösung wurden
- i) Extinktionsmessungen bei 280 nm unter Verwendung
des berechneten Extinktionskoeffizienten (εM) und
- ii) Wirkstellen-Titration eingesetzt.
-
Der
Extinktionskoeffizient bei 280 nm wurde aus der Anzahl von Tryptophanen
(εM = 5.600 M–1·cm–1) und
Tyrosinen (εM = 1.330 M–1·cm–1)
pro Enzymmolekül
berechnet. Für die
PB92-Protease wurde εM = 26.100 M–1·cm–1 (3
Trp-, 7 Tyr-Reste), was E1 1 % cm = 9,7 (Mr = 26.729 Da), gemessen bei 280 nm, entsprach,
verwendet. Im Falle von Mutanten mit einer veränderten Anzahl von Trp und
Tyr wurden entsprechende Korrekturen vorgenommen.
-
Eine
Schätzung
der Anzahl an aktiven Enzymmolekülen
wurde mithilfe einer Wirkstellen-Titration erhalten. Da das weit
verbreitete Verfahren mit N-Transcinnamoylimidazol (M. L. Bender
et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 5890–5931 (1966)) für PB92-Protease
nicht zufrieden stellend funktionierte, entwickelten die Erfinder stattdessen
ein Verfahren mit PMSF. Dazu wurde eine Proteaselösung mit
einer geschätzten
Enzymkonzentration (von der 280-nm-Absorption) mit 0,25, 0,50, 0,75,
1,00 und 1,25 Äquivalenten
von PMSF gemischt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 10
mM Natriumphosphat pH 6,5 reagieren gelassen. Die Enzymkonzentration
muss zumindest 50 μM
betragen.
-
Restaktivität wurde
spektralphotometrisch unter Verwendung von Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-p-nitroanilid
(sAAPFpNA) als Substrat gemessen (siehe unten). Die Reinheit (und
damit die Konzentration) von PMSF wurde durch NMR-Spektroskopie
bestimmt, und Stammlösungen
wurden in Isopropanol hergestellt. Die Ergebnisse der Wirkstellen-Titration
stimmten mit den Ergebnissen der Reinheitsüberprüfung durch HPLC überein.
-
6. Bestimmung von kinetischen
Parametern von Proteasen vom Wildtyp und Protease-Mutanten
-
- 1°.
Die Aktivität
auf Proteinsubstraten (Casein) wurde, wie in der britischen Patentbeschreibung 1.353.317 beschrieben,
bei pH 10,0 gemessen (ausgedrückt
in ADU = Alkaline Delft Units).
- 2°.
Der Umsatz mit Casein als Substrat wurde in einem pH-Stat gemessen.
Die Reaktionskammer des pH-Stats (Radiometer, Kopenhagen) enthielt
10 ml 0,1 M KCl mit 50 mg Casein (Hammerstein, Merck). Protonen,
die durch eine Hydrolyse von Casein durch PB92-Protease freigesetzt
wurden, wurden mit 10 mM NaOH titriert, während der pH bei 10,0 gehalten
wurde (bei 40°C
und unter einem Stickstoffgasstrom).
- 3°.
Die Aktivität
auf synthetischen Peptiden wurde unter Verwendung von sAAPFpNA gemessen.
Das gebildete (gelbe) Paranitroanilid (pNA) wurde spektralphotometrisch
bei 410 nm gemessen: εM = 8.480 M–1·cm-1 (E. G. Delmar et al., Anal. Biochem. 94,
316–320
(1979), mit einem Spektrometer UVIKON 860 (KONTRON), das mit einem
Thermostat-kontrollierten
Zellentauscher mit sechs Positionen ausgerüstet war. Die kinetischen Parameter
kcat und Km wurden
aus den anfänglichen
Verhältnismessungen
bei verschiedenen Substratkonzentrationen (für PB92-Protease von 0,1–6,0 mM)
und Einpassen der Daten in eine Hyperbelfunktion durch nichtlineare
Regression unter Verwendung des multivariaten Sekanteniterationsverfahrens
erhalten. Die Spezifitätskonstante
kcat/Km wurde dann
berechnet. Messungen wurden bei 25°C in einem Endvolumen von 1
ml, das 0,1 M TRIS-HCl + 0,1 M NaCl pH 8,6 enthielt, durchgeführt. Das
Natriumchlorid war notwendig, weil in seiner Abwesenheit PB92-Protease
keine nichtlineare Lineweaver-Burk-Diagramme aufwies, was durch Substrathemmung
verursacht hätte
sein können.
Das Substrat wurde zuerst in DMSO auf eine Konzentration von 200
mM gelöst
und dann mit 0,1 M TRIS-HCl pH 8,6 verdünnt, was eine Stammlösung von
20 mM ergab (spektralphotometrisch bei 315 nm bestimmt; εM = 14.000
M–1·cm–1).
Für die
variierenden Konzentrationen von DMSO (0,05–3,0 Vol.-%) wurden keine Korrekturen
vorgenommen.
-
7. Oxidation von PB92-Proteasen
-
Die
Empfindlichkeit von PB92-Proteasen gegenüber Oxidation durch H2O2 wurde laut dem
von Estell et al., J. Biol. Chem. 260, 6518–6521 (1985), beschriebenen
Verfahren getestet, mit der Ausnahme, dass:
- i)
20 mM H2O2 anstelle
von 100 mM verwendet wurden und
- ii) 20 mM mit 10 mM TAED vereinigtes Natriumperborat als zusätzliches
Oxidationsmittel eingesetzt wurden.
-
8. Waschleistungstest
-
PB92-Protease-Mutanten
wurden in einem speziell entwickelten Waschtest untersucht, bei
dem Baumwolle- und Polyester/Baumwolle-Stoffproben (5,0 × 5,0 cm,
von EMPA, St. Gallen, Schweiz, Nr. 116 und 117), die mit Milch,
Blut und Tinte beschmutzt waren, verwendet wurden.
-
Die
Waschtests wurden in einem Atlas-Launderometer LEF-FC durchgeführt, das
mit Edelstahl-Testbehältern
ausgestattet war, die jeweils eine definierte Waschmittelzusammensetzungen
plus der zu testenden Protease (PB92-Protease-Mutanten oder PB92-Protease)
enthielten. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Tests 30 Minuten
lang bei einer gewünschten
Temperatur durchgeführt.
Nach dem Waschen wurden die Stoffproben luftgetrocknet, und das
Reflexionsvermögen
der Stoffproben wurde bei 680 nm mit einem Photovolt-Photometer
(Modell 577), das mit einem grünen
Filter ausgestattet war, gemessen. Reflexionsdaten, die auf den
mit Waschmitteln, welche die jeweiligen PB92-Protease-Mutanten enthielten, gewaschenen
Stoffproben gemessen wurden, wurden mit Reflexionsdaten einer vergleichbaren
Messreihe mit Waschmitteln, die PB92-Protease enthielten, verglichen.
Die Waschleistungswerte der Protease-Mutanten wurden berechnet,
indem die Proteinmenge von PB92-Protease (mg) durch die Proteinmenge
einer Protease-Mutante (mg), die zum Erreichen desselben Reflexionsvermögens erforderlich
war, dividiert wurde, ×100%.
-
BEISPIEL 1
-
- A. Die Waschleistung verschiedener PB92-Protease-Mutanten
in europäischen
Pulverwaschmitteln wurden laut dem oben beschriebenen Verfahren
bestimmt.
-
Edelstahl-Testbehälter, die
jeweils eine gegebene Menge Pulverwaschmittel IEC enthielt, das
in 250 ml Wasser mit 15°d
gelöst
war, wurden jeweils mit zwei Baumwolle- und zwei Polyester/Baumwolle-Stoffproben
beladen. Die Zusammensetzung des Pulverwaschmittels IEC war wie
folgt:
Komponente | Gew.-% |
Unverzweigtes
Natriumalkylbenzolsulfonat (mittlere Kettenlänge der Alkankette C11,5) | 6,4 |
Ethoxylierter
Talgalkohol (14 EO) | 2,3 |
Kernseife | 2,8 |
Natriumtripolyphosphat
(STPP) | 35,0 |
Natriumsilicat | 6,0 |
Magnesiumsilicat | 1,5 |
Carboxylmethylcellulose | 1,0 |
Natriumsulfat | 16,8 |
Natriumperborattetrahydrat | 18,5 |
TAED | 1,5 |
Verschiedenes
+ Wasser | auf
100 |
-
Zu
jedem Behälter
wurde eine ausgewählte
gereinigte PB92-Protease-Mutante in einer Konzentration von 0 bis
1,74 mg (gereinigter) Protease pro Liter Lauge zugesetzt. Ein Behälter wurde
zum Testen von PB92-Protease auf dieselbe Weise als Vergleich verwendet.
Die Waschtests wurden bei 40°C
durchgeführt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
- B. Der Waschleistungstest wurde bei 25°C mit demselben
Waschmittel, das einige der PB92-Protease-Mutanten enthielt, wiederholt.
Die PB92-Protease wurde wieder als Bezug verwendet. Sonstige Testbedingungen
waren wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2 Waschleistung von PB92-Protease-Mutanten
bei 25°C
in Pulverwaschmittel enthaltendem STPP, bezogen auf PB92-Protease
(%) Protease | Waschleistung
(%)
Waschmittelkonzentration in der Lauge |
4
g/l | 7
g/l |
M216S | 90 | 80 |
M216Q | 95 | 80 |
N212D | 250 | 135 |
S160D | 185 | 120 |
- C. Die Waschleistung der Proteasen
wurden auch in einem europäischen
Pulverwaschmittel mit Nicht-Phosphatbleichmittel in einem Launderometer
bei 25°C
und 40°C
bestimmt. Eine PB92-Protease wurde wieder als Bezug verwendet. Sonstige
Testbedingungen waren wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3 Waschleistung von PB92-Protease-Mutanten
bei 25°C
und 40°C
in einem europäischen
Pulverwaschmittel mit Nicht-Phosphatbleichmittel, bezogen auf PB92-Protease (%) Protease | Waschleistung
(%)
Waschmittelkonzentration in der Lauge |
4
g/l | 7
g/l | 4
g/l | 7
g/l |
Temperatur
25°C | Temperatur
40°C |
M216S | 80 | 85 | 100 | 90 |
M216Q | 80 | 80 | 120 | 100 |
N212D | 170 | 105 | 200 | 75 |
S160D | 170 | 105 | 230 | 165 |
-
BEISPIEL 2
-
Die
PB92-Protease-Mutante M216S wurde auf ihre Lagerstabilität im in
Beispiel 1 beschriebenen Pulverwaschmittel IEC getestet. Die Lagerstabilität wurde
in Klima-Boards bei 30°C
und 80 relativer Feuchte (r. F.) untersucht. Die Protease für diesen
Versuch wurde wie folgt eingekapselt:
Ein Gemisch aus folgenden
Bestandteilen wurde hergestellt (in Gew.-%): 2% gereinigte Protease,
50% nichtionisches Tensid (ethoxylierter C14-C18-Alkohol mit 50–80 EO-Einheiten), 5% TiO2, 3–10%
CaSO4·2H2O und Na2SO4 auf 100%. Das Gemisch wurde auf 65–90°C erhitzt
und auf Raumtemperatur abgekühlt.
Das erhaltene verfestigte Gemisch wurde zu Körnchen gemahlen. Körnchen mit
einem Durchmesser von 0,5 bis 1 mm wurden herausgesiebt und für Lagerungstests
in Waschmitteln verwendet.
-
3,5
g des Pulverwaschmittels IEC, das eine M216S-Mutante in einer Konzentration
von 6140 ADU/g Waschmittel enthielt, wurde in 18 ml fassenden Phiolen
gelagert. Zum Vergleich wurde PB92-Protease unter denselben Bedingungen
gelagert. Nach 2, 4, 5 und 6 Wochen wurde die Restaktivität der Proteasen
gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4 Restaktivität von PB92-Protease und ihrer
Mutante M216S nach Lagerung (in Wochen) bei 30°C und 80% r. F. in einem Pulverwaschmittel
Protease | Restaktivität (%) |
0
W | 2
W | 4
W | 5
W | 6
W |
PB92-Protease | 100 | 25 | 5 | 3 | 2 |
M216S | 100 | 68 | 31 | 20 | 11 |
-
BEISPIEL 3
-
Eine
PB92-Protease und verschiedene PB92-Protease-Mutanten wurden auf
ihre Lagerstabilität
in Pulverwaschmittel getestet. Beim Lagerstabilitätstest wurden
die Proteasen in eingekapselter Form verwendet.
-
Die
Protease-Produkte wurden durch Vermischen der folgenden Komponenten
bei 80°C
hergestellt:
Komponente | Gew.-% |
AE* | 50 |
TiO2 | 2 |
Protease
(CEP) | 7 |
PVP** | 1,5 |
BHT*** | 1 |
Na2SO4 | Rest |
- *AE = C14-C18-Alkoholpolyethoxylat. Der Alkohol wurde
mit 50–80
Ethylenoxid-(EO-)Gruppen ethoxyliert.
- **PVP = Polyvinylpyrrolidon K17
- ***BHT = 2,6-Bis(t-butyl)-4-methylphenol.
-
Dieses
Gemisch wurde durch Sprühkristallisation
eingekapselt, wie sie im Wesentlichen in der
britischen Patentbeschreibung Nr. 1.603.640 beschrieben
ist. Der Körnchenanteil
mit einer Teilchengröße von 0,3 bis
0,8 mm wurde verwendet, um die Lagerstabilität der Proteasen zu bestimmen.
Die verkapselte Protease (140 mg) wurde mit ALL
®-Base
(6,4 g) und Natriumperborattetrahydrat (0,6 g) vermischt. [ALL ist
ein eingetragenes Warenzeichen von Unilever N. V.] Das verwendete
ALL-Basenpulver enthielt keine Enzyme oder Bleichmittel.
-
Das
Enzym/Waschmittel/Natriumperborattetrahydrat-Gemisch wurde bei 30°C und 80%
r. F. inkubiert. In Tabelle 5 ist die Restaktivität nach einer
Lagerung für
den angegebenen Zeitraum angegeben. Tabelle 5 Restaktivität von PB92-Protease und einigen
ihrer Mutanten nach Lagerung (in Wochen) bei 30°C und 80% r. F. in einem Bleichmittel
enthaltendem Pulverwaschmittel
Protease | Restaktivität (%) |
0
W | 1
W | 3
W | 5
W |
PB92-Protease | 100 | 51 | 25 | 15 |
M216Q | 100 | 94 | 84 | 52 |
M216S | 100 | 89 | 83 | 50 |
S160D | 100 | 47 | 20 | 9 |
N212D | 100 | 59 | 31 | 19 |
-
BEISPIEL 4
-
Eine
PB92-Protease und verschiedene PB92-Protease-Mutanten wurden durch
das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren eingekapselt. In diesem
Beispiel wurden jedoch 70 mg eingekapselte Protease mit einer Korngröße von 0,3
bis 0,9 mm mit 3,2 g ALL und 0,3 g Natriumperborattetrahydrat vermischt.
Die Proben wurden bei 30°C
in 18 ml fassenden Phiolen in einem Vakuumexsikkator gelagert. Während der
ersten drei Tage der Lagerungsperiode wurde Vakuum angelegt (25
mmHg).
-
Durch
Anlegen von Vakuum wurde die Wasserdampf-Transportgeschwindigkeit
erhöht,
so dass das System sein Gleichgewicht bei 80% r. F. schneller erreichte
als in Systemen ohne Vakuum. Die r. F. von 80% wurde durch eine
gesättigte
Lösung
von Kaliumbromid hergestellt.
-
In
Tabelle 6 sind die Restaktivitäten
nach der angegebenen Lagerungsperiode (in Wochen) angegeben. Tabelle 6 Restaktivität einer PB92-Protease und einiger
ihrer Mutanten nach Lagerung bei 30°C und 80% in einem Bleichmittel
enthaltendem Waschmittel
Protease | Restaktivität (%) |
0
W | 1
W | 2
W | 3
W |
PB92-Protease | 100 | 27 | 22 | 14 |
M216Q | 100 | 63 | 53 | 44 |
M216S | 100 | 55 | 49 | 31 |
S160D | 100 | 2 | 18 | 13 |
-
BEISPIEL 5
-
Die
folgende Flüssigwaschmittelzusammensetzung
wurde hergestellt:
Komponente | Gew.-% |
unverzweigte
C10-C13-Alkylbenzolsulfonsäure | 12 |
C13-Alkoholpolyethoxylat, 8 EO | 13 |
Laurinsäure | 8 |
Ölsäure | 4 |
Triethanolamin | 6 |
1,2-Propandiol | 6 |
Ethanol | 5 |
Natriumcitrat | 4 |
Diethylentriaminpentaessigsäure | 0,3 |
Calciumformiat | 0,12 |
Natriumformiat | 1 |
Borax | 1,9 |
NaOH,
25 Gew.-% Lösung | auf
pH 11,2 |
Wasser | Rest |
-
Eine
PB92-Protease und verschiedene PB92-Protease-Mutanten wurden zu
dieser Zusammensetzung in einer Menge zugesetzt, um eine anfängliche
Proteasenkonzentration von 0,13 Gew.-% bereitzustellen.
-
Die
Proteasenstabilität
(in % der Restaktivität)
wurde nach Lagerung der Protease enthaltenden Zusammensetzung bei
37°C für die angegebene
Anzahl von Tagen bestimmt.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst. Tabelle 7 Restaktivität einer PB92-Protease und einigen
ihrer Mutanten nach Lagerung bei 37°C in einer Flüssigwaschmittelzusammensetzung
Protease | Restaktivität (%) |
0
T | 5
T | 11
T | 15
T | 21
T |
PB92-Protease | 100 | 23 | 10 | 5 | 3 |
S160D | 100 | 57 | 30 | 14 | 8 |
M216Q | 100 | 59 | 32 | 18 | 9 |
M216S | 100 | 45 | 18 | 10 | 5 |
N212D | 100 | 38 | 14 | 9 | 4 |
-
BEISPIEL 6
-
PB92-Protease
und einige ihrer Mutanten wurden wie folgt formuliert. Mit jeder
Protease wurde ein Gemisch aus den folgenden Komponenten hergestellt:
Komponente | Gew.-% |
Amylogum
CLS | 45 |
Saccharose | 23 |
Sorbitol | 17 |
Glycerin | 4 |
Paraffinöl | 3 |
NaH2PO4 | 0,5 |
Protease
(CEP) | 5,0 |
PVP
K17 | 1,5 |
TiO2 | 1 |
-
Aus
diesen Gemischen wurden Granulate hergestellt, im Wesentlichen nach
dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren laut dem
US-Patent Nr. 4.242.219 , mit den folgen den
Ausnahmen: 1. Das in diesem Beispiel beschriebene Gemisch wurde
durch das oben genannte Gemisch ersetzt; 2. Öffnungen mit einem Durchmesser
von 0,7 mm anstelle von 1,0 mm wurden verwendet; 3. die Körnchen wurden
nicht beschichtet.
-
Diese
Granalien (140 mg) wurden mit ALL-Base (6,4 g) und Natriumperborattetrahydrat
(0,6 g) vermischt und in 36 ml fassende Phiolen gegeben.
-
Die
Proteasenstabilität
(in % der Restaktivität)
wurde nach Lagerung der Protease enthaltenden Zusammensetzung bei
30°C und
80% r. F. für
die angegebene Anzahl von Wochen bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 8 zusammengefasst. Tabelle 8 Restaktivität von Granulaten einer PB92-Protease
und einigen ihrer Mutanten nach Lagerung bei 30°C und 80% r. F. in einem Waschmittel
Protease | Restaktivität (%) |
0
W | 1
W | 3
W | 5
W |
PB92-Protease | 100 | 45 | 29 | 17 |
M216Q | 100 | 93 | 66 | 45 |
M216S | 100 | 90 | 70 | 41 |
-
BEISPIEL 7
-
Sprühkristallisationsprodukte
aus PB92-Protease und einigen ihrer Mutanten wurden hergestellt
und mit Waschmittel und Bleichmittel wie in Beispiel 3 beschrieben
vermischt.
-
Die
Lagerstabilität
dieser Proben (in % der Restaktivität) wurde bei 30°C und 60/80
r. F. (abwechselnd 12 Stunden lang 50% r. F. und 12 Stunden lang
80% r. F.) bestimmt.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefasst. Tabelle 9 Restaktivität von Sprühkristallisationsprodukten
aus PB92-Protease und einigen ihrer Mutanten nach Lagerung bei 30°C und 60/80%
r. F.
Protease | Restaktivität (%) |
0
W | 1
W | 3
W | 5
S |
PB92-Protease | 100 | 70 | 34 | 15 |
M216Q | 100 | 98 | 88 | 67 |
M216S | 100 | 93 | 87 | 48 |
S160D | 100 | 67 | 35 | 10 |
N212D | 100 | 75 | 53 | 26 |
-
BEISPIEL 8
-
Granalien,
die PB92-Protease und einige ihrer Mutanten enthielten, wurden hergestellt
und mit Waschmittel und Bleichmittel wie in Beispiel 6 beschrieben
vermischt.
-
Die
Lagerstabilität
dieser Proben (in % der Restaktivität) wurde nach Inkubation für den angegebenen Zeitraum
bei 30°C
und einer r. F., die abwechselnd 12 Stunden lang 50 r. F. und 12
Stunden lang 80% r. F. gehalten wurde, bestimmt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 10 zusammengefasst. Tabelle 10 Restaktivität von Sprühkristallisationsprodukten
aus PB92-Protease und einigen ihrer Mutanten nach Lagerung bei 30°C und 60/80%
r. F.
Protease | Restaktivität (%) |
0
W | 1
W | 3
W | 5
W |
PB92-Protease | 100 | 54 | 39 | 28 |
M216Q | 100 | 93 | 81 | 67 |
M216S | 100 | 99 | 87 | 72 |
-
BEISPIEL 9
-
PB92-Protease
und einige ihrer Mutanten wurden auf ihre Lagerstabilität in einem
Bleichmittel enthaltendem Pulverwaschmittel bei 30°C und 80%
r. F. getestet. Für
diesen Versuch wurden die Proteasen in eingekapselter Form verwendet.
Jede Protease wurde wie folgt eingekapselt:
Bei 80°C wurde ein
Gemisch der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
Komponente | Gew.-% |
Nichtionisches
Tensid* | 45 |
TiO2 | 2 |
Protease
(CEP) | 10 |
Na2SO4 | Rest |
- *Nichtionisches Tensid = C14-C18-Alkoholpolyethoxylat
(50–80
EO-Gruppen)
-
Das
oben genannte Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.
Das verfestigte Gemisch wurde zu kleineren Körnchen gemahlen. Körnchen mit
einem Durchmesser von 0,3 bis 0,8 mm wurden herausgesiebt und für den Lagerungsversuch
verwendet.
-
Für den Lagerungsversuch
wurden 140 mg jeder verkapselten Protease mit 6,4 g ALL-Basen-Pulverwaschmittel
und 0,6 g Natriumperborattetrahydrat vermischt. Das ALL-Basenpulver
enthielt weder Enzyme noch Natriumperborat. Die ALL-Base/Protease/Natriumperborattetrahydrat-Gemische
wurden bei 30°C
und 80% r. F. inkubiert.
-
Nach
Lagerung für
0, 1, 2 oder 4 Wochen wurde die Proteasenstabilität, als %
der Restaktivität,
für jede
Protease bestimmte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefasst. Tabelle 11 Restaktivität einer PB92-Protease und einiger
ihrer Mutanten nach Lagerung bei 30°C und 80% r. F. in einem Bleichmittel
enthaltendem Pulverwaschmittel
Protease | Restaktivität (%) |
0
W | 1
W | 2
W | 4
W |
PB92-Protease | 100 | 61 | 36 | 12 |
[S160D,
M216Q] | 100 | 78 | 58 | 35 |
[S160D,
M216S] | 100 | 86 | 68 | 39 |
-
BEISPIEL 10
-
PB92-Protease-Mutanten
wurden in einem Waschtest unter im Wesentlichen denselben Bedingungen getestet,
wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind, mit der Ausnahme, dass im
Launderometer-Behälter
0,357 g Flüssigwaschmittel
der folgenden Zusammensetzung zu 250 ml Wasser mit 5°d zugesetzt
wurden:
Komponente | Gew.-% |
Laurinsäure | 8 |
Ölsäure | 4 |
unverzweigte
C10C13-Alkylbenzolsulfonsäure | 12 |
C13-Alkoholpolyethoxyat, 8 EO | 13 |
Triethanolamin | 6 |
1,2-Propandiol | 6 |
Ethanol | 5 |
Natriumhydroxid,
45 Gew.-% | 4 |
Natriumcitrat | 4 |
Wasser | bis
100 |
(pH
der Lauge 7,2) | |
-
Die
Waschleistung der verschiedenen Proteasen in diesem Flüssigwaschmittel
wurde in einem Launderometer bei 25°C 30 Minuten lang getestet.
Nach dem Waschen wurde das Reflexionsvermögen der Stoffproben wie in
Beispiel 1 beschrieben gemessen. Die Waschleistung der Protease-Mutanten
wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefasst. Tabelle 12 Waschleistung von PB92-Protease-Mutanten
bei 25°C
in einem Flüssigwaschmittel
Protease | Waschleistung | Spezifische
Aktivität,
bezogen auf PB92-Protease (%) |
212D | + | 100 |
160D | + | 73 |
S160G,
N212D | + | 76 |
M216S | 0 | 40 |
M216Q | 0 | 37 |
- 0: 100% ± 20% Waschleistung, bezogen
auf PB92-Protease (gleichbleibende Waschleistung).
- +: > 120% Waschleistung,
bezogen auf PB92-Protease.
- < 80% Waschleistung,
bezogen auf PB92-Protease.
-
Die
Waschleistung der verschiedenen Proteasen wurde in den im Handel
erhältlichen
Flüssigwaschmitteln
TIDE
®,
WISK
® und
ARIEL
® bestimmt.
Die Edelstahlbehälter
enthielten entweder 0,375 g TIDE in 250 ml Wasser mit 5°d, 0,375
g WISK in 250 ml Wasser mit 5°d
oder 1,25 g ARIEL in 250 ml Wasser mit 15°d. Die Waschleistung wurde bei
25°C oder
40°C bestimmt.
Sonstige Bedingungen waren dieselben wie in Beispiel 1. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 13 zusammengefasst. Tabelle 13 Waschleistung von PB92-Protease-Mutanten
in TIDE, WISK und ARIEL bei 25°C
und 40°C
Protease | TIDE | WISK | ARIEL |
25°C | 40°C | 25°C | 40°C | 40°C |
N212D | + | + | + | + | 0 |
S160D | + | + | + | + | + |
M216Q | 0 | + | 0 | + | + |
M216S | NB | 0 | 0 | 0 | 0 |
S160Q | - | - | - | - | - |
S160N | - | - | - | - | 0 |
S160K | - | - | - | - | - |
S160A | - | - | - | - | - |
S160D,
M216Q | + | + | + | + | + |
S160D,
M216S | 0 | - | + | + | 0 |
M117L,
M216Q | NB | - | NB | - | 0 |
M117L,
M216S | NB | - | NB | - | - |
-
- NB = nicht bestimmt
- 0: 100 ± 20%
Waschleistung, bezogen auf PB92-Protease.
- +: > 120% Waschleistung,
bezogen auf PB92-Protease.
- -: < 80% Waschleistung,
bezogen auf PB92-Protease.
-
BEISPIEL 11
-
Die
Waschleistung von PB92-Protease-Mutanten wurde in einem statistischen
Waschmaschinentest im Realmaßstab
von TNO, Delft, Niederlande (Cleaning Techniques Research Institute)
bestimmt. Die Waschleistung dieser Mutanten wurde mit jener von
PB92-Protease verglichen.
-
Alle
Proteasen wurden basierend auf dem Proteingewicht (0,007 Gew.-%)
in IEC-Waschmittel
dosiert. Ausgehend von der Aktivität lieferten diese Dosierungen:
PB92-Protease | 1460
ADU/g Waschmittel |
M216S | 679
ADU/g Waschmittel |
M216Q | 479
ADU/g Waschmittel |
S160D | 1080
ADU/g Waschmittel |
N212D | 1455
ADU/g Waschmittel |
-
Mit
jeder Waschmittel-Proteasenzusammensetzung wurden 8 Waschtests bei
40°C in
identischen AEG-Turnamat-Twinup-Waschmaschinen durchgeführt. In
jeder Waschmaschine wurden 170 g Waschmittel verwendet. Während der
Tests wurden die untersuchten Waschmittel so verwendet, dass jedes
Pulver dieselbe Anzahl an Waschzyklen in allen Maschinen durchlief.
-
Während der
Tests wurde normales Leitungswasser aus der Stadt Delft mit folgenden
Merkmalen verwendet:
Basizität (M): | 2,2
mmol/l |
Härte (H): | 1,6
mmol/l (9°d) |
Temperatur: | 20°C |
-
Schmutz- und Fleckenentfernung
aus Stoffproben
-
Bei
jedem Testdurchlauf wurden 6 Stoffproben mit drei Arten von EMPA-Verschmutzungen
auf Baumwolle (Nr. 111, 116 und 117) zusammen mit der verschmutzten
Wäsche
gewaschen.
-
Die
Schmutz- und Fleckenentfernung aus den künstlich verschmutzten Stoffproben
wurden dann bewertet, indem blaues Dreibereichslicht orthogonal
zur Stoffprobe gesandt wurde. Die Lichtmenge, die von der Stoffprobe
wieder in einem Winkel von 45° abgegeben
wurde, wurde gemessen. Laut der IEC-Veröffentlichung 456 wurde der
Reemis sionswert von Magnesiumoxid mit 100 festgelegt. Je höher der
Reemissionswert, desto besser ist der Waschvorgang für eine bestimmte
Art von Verschmutzung.
-
Beladung der Waschmaschine
-
Die
Waschmaschinen wurden mit einer Beladung von 4,75 kg, die aus Stoffproben
und durch normalen Haushaltsgebrauch verschmutzter Wäsche bestand.
-
Die
Wäsche
umfasste:
6 Stück
Geschirrtücher
4
Stück Unterwäsche
4
Betttücher
4
Kissenbezüge.
-
Wenn
erforderlich wurden saubere Betttücher und Kissenbezüge dazugegeben,
um die erforderliche Beladungsmenge zu erreichen.
-
Bei
jedem Waschvorgang wurde die Wäsche
sorgfältig
ausgewählt.
Jedes Stoffstück,
das für
eine der Maschinen ausgewählt
wurde, wies ein gleich schmutziges Gegenstück auf, das in einer der anderen
Waschmaschinen gewaschen wurde. Auf diese Weise war die Verschmutzung
bei jedem Vorgang gleich. Parameter des Waschvorgangs
Programm | 40°C |
Wassermenge
im Hauptwaschgang | 19
l |
Zeit
bis zum Erreichen der Höchsttemperatur | 15
min |
Höchsttemperatur | 43°C |
Waschdauer | 45
min |
Wasserzufuhr | 7
l |
Temperatur
nach der Laugenverdünnung | 30°C |
Abwassermenge | 17
l |
5 Spülungen mit
jeweils etwa 17 Liter kaltem Wasser |
-
Die
Mittelwerte der Reemission (V) und des Verhältnisses (R) würden nach
8 Waschtests bestimmt. Die Ergebnisse der beiden unabhängigen Versuche
sind in den Tabellen 14A und 14B zusammengefasst. Tabelle 14A Entfernung von künstlichen Verschmutzungen
Protease | EMPA-Stoffprobe
Nr. | Gesamt |
111 | 116 | 117 |
V | R | V | R | V | R | V | R |
PB92-Protease | 49 | 1,00 | 44 | 1,00 | 56 | 1,00 | 149 | 1,00 |
M216S | 49 | 1,00 | 46 | 1,05 | 58 | 1,04 | 153 | 1,03 |
Tabelle 14B Entfernung von künstlichen Verschmutzungen
Protease | EMPA-Stoffprobe
Nr. | Gesamt |
111 | 116 | 117 |
V | R | V | R | V | R | V | R |
PB92-Protease | 41 | 1,00 | 35 | 1,00 | 46 | 1,00 | 123 | 1,00 |
M216S | 40 | 0,96 | 33 | 0,94 | 42 | 0,91 | 115 | 0,93 |
M216Q | 42 | 1,01 | 35 | 0,99 | 43 | 0,94 | 120 | 0,98 |
-
In
Tabelle 15 wurden die Verhältnisse
(R), die in statistischen Waschmaschinentests im Realmaßstab erhalten
wurden, durch das entsprechende Verhältnis (R'), das aus Waschleistungswerten in Bezug
auf PB92-Protease, die in Launderometer-Waschtests unter ähnlichen
Bedingungen (10 g/l IEC, Stoffproben EMPA 116 und 117, Waschdauer
30 min, Temperatur 40°C)
berechnet wurde, dividiert. Tabelle 15 Korrelation zwischen einem Waschmaschinentest
im Realmaßstab
und einem Launderometer-Waschtest
Protease | R/R' |
PB92-Protease | 1,00* |
M216S | 1,18 |
M216Q | 1,10 |
S160D | 1,02 |
N212D | 0,98 |
-
R/R'-Werte für eine Protease-Mutante,
die nahe bei 1,00 liegen, weisen auf eine Korrelation zwischen Maschinentests
im Realmaßstab
und Launderometer-Tests hin.
-
BEISPIEL 12
-
2A und
2B zeigen
die Waschleistung von verschiedenen PB92-Protease-Mutanten in 4
g IEC/l laut den in Beispiel 1 beschriebenen Tests und in Bezug
auf eine native PB92-Protease als Funktion ihrer spezifischen Aktivität. Die Figuren
im Diagramm beziehen sich auf die folgenden Protease-Mutanten:
1 PB92-Protease | 11
M216P |
2 M216A | 12
M216T |
3 M216C | 13
M216W |
4 M216S | 14
M216I |
5 M216L | 15
M216G |
6 M216E | 16
M117L, H118D |
7 M216K | 17
M117L, M216Q |
8 M216H | 18
M117L, H118D, M216Q |
9 M216N | 19
M117L, M216S |
10
M216Q | 20
M117L, H118D, M216S |
| |
21
M169S | 31
S259K |
22
M216Y | 32
W235R |
23
M169I, M216S | 33
H243R |
24
M216-ox | 34
H243R, S259K |
25
N212S | 35
D175N |
26
N212D | 36
E134R |
27
S160G, N212D | 37
W235R, S259K |
28
L211Y | 38
W235R, H243R |
29
L211Y, N212S | 39
S259K |
30
A166D, M169I | 40
T207K |
| |
41
S160N | 51
S160I |
42
S160G | 52
S160G, M216S |
43
S160P | 53
S160G, M216Q |
44
S160T | 54
S160L |
45
S160C | 55
S160Y |
46
S160Q | 56
S160D, M216S |
47
S160D | 57
G116V, S126V, P127E, S128K |
48
S160K | 58
G116V, S126L, P127N, S128V |
49
S160R | 59
G116V, S126L, P127Q, S128A |
50
S160A | 60
G116V, S126V, P127M |
| |
61
S126M, P127A, S128G | |
62
G116V, S126Y, P127G, S128L | |
63
G116V, S126N, P127H, S128I | |
64
G116V, S126H, P127Y | |
65
G116V, S126R, P127S, S128P | |
66
G116V, S126F, P127Q | |
67
G116V, S126G, P127Q, S128I | |
68
G116V, S126F, P127L, S128T | |
69
G116V, S126Q, P127D | |
-
3 zeigt
die Waschleistung von verschiedenen PB92-Protease-Mutanten in 7
g IEC/l laut den in Beispiel 1 beschriebenen Tests und in Bezug
auf eine native PB92-Protease als Funktion ihrer spezifischen Aktivität. Die Figuren
im Diagramm beziehen sich auf dieselben Protease-Mutanten wie in 2A und 2B.
-
Alle
Veröffentlichungen
(einschließlich
Patentanmeldungen), die in dieser Beschreibung erwähnt wurden,
geben Informationen über
das Können
von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung, auf das sich diese Erfindung
bezieht.
-
Obwohl
die Erfindung hierin zur Veranschaulichung in gewissem Detail erläutert und
Beispiele zum besseren Verständnis
angeführt
wurden, wird für
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich sein, dass
zahlreiche Veränderungen
und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang
der beiliegenden Ansprüche
abzuweichen.