CN102277344B - 一种低温碱性蛋白酶及其制备方法 - Google Patents
一种低温碱性蛋白酶及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102277344B CN102277344B CN 201110220386 CN201110220386A CN102277344B CN 102277344 B CN102277344 B CN 102277344B CN 201110220386 CN201110220386 CN 201110220386 CN 201110220386 A CN201110220386 A CN 201110220386A CN 102277344 B CN102277344 B CN 102277344B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alkaline protease
- low
- gene
- temperature alkaline
- subtilis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Abstract
本发明涉及一种低温碱性蛋白酶及其制备方法，属于用重组DNA技术定点突变野生型碱性蛋白酶基因，以改善其特性，并将突变后基因与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBE2S连接，将其在枯草芽孢杆菌中高效表达的方法，涉及具有适冷性及碱稳定性的低温碱性蛋白酶及其制备方法。本发明解决了碱性蛋白酶在低温环境下活性较低，以致应用受限的问题。其技术方案是从微生物特别是嗜碱芽孢杆菌分离野生型碱性蛋白酶基因，对其Glu110、Glu134的氨基酸残基进行突变，经在枯草芽孢杆菌中高效表达，检测其发酵液酶活力达到1985U/mL，在40℃下，该低温碱性蛋白酶(Glu110&134Ala)比野生型碱性蛋白酶活力提高了28％；在10℃下，比野生型碱性蛋白酶活力提高了62％。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及基因的定点突变和重组技术，尤其是一种低温碱性蛋白酶及其制备方法。
背景技术
我国在20世纪70年代初期就成功开发了碱性蛋白酶，并实现了工业化生产。工业生产菌种为地衣芽孢杆菌2709的突变株，但碱性蛋白酶2709酶学性质较差，如：耐热性、反应pH范围、底物特异性、安全性的问题等，导致我国发酵行业碱性蛋白酶年产量很低，绝大多数碱性蛋白酶生产厂家均已停产。
目前，国内洗涤剂生产厂家主要采用丹麦Novoenzyme公司和美国Genencor公司的酶。目前我国洗涤剂总产量为270万吨，而加酶洗涤剂产量只占洗涤剂总量的30％，约80万吨。并且洗涤剂的用量正以每年5％的速度递增，此外，随着人们生活水平的提高，含磷洗涤剂将被逐渐淘汰，这都将使得加酶洗涤剂的市场份额越来越大，发展前景越来越广阔。
寻找一株用于工业化生产的碱性蛋白酶高产菌株，建立起我国自己的碱性蛋白酶生产体系就显得非常必要和重要。这将大大提高我国工业微生物酶制剂的生产技术水平，推动我国酶制剂工业的发展，促进绿色洗涤剂的发展。
近年来随着世界洗涤领域发生的根本性改变，全球洗衣正向着低温、节水型发展，以便节约能源，所以要求洗涤剂用酶(主要是碱性蛋白酶)在低温条件下仍然维持相对高的酶活性。温度是影响生化反应的重要因素，温度每下降10℃，生化反应速度将降低2-3倍。中温酶和高温酶的最适反应温度都较高，在低温下反应活性很低。由于低温碱性蛋白酶在低温下具有较高的活性，因此越来越受到关注。传统的作为洗涤剂添加剂的碱性蛋白酶的最适反应温度通常在50～70℃，在低温下的酶活性很低，所表现出的清洁能力已难以满足消费者的需求。如：Savinase 4.0T低温碱性蛋白酶在pH 10条件下，最适反应温度55℃、20℃时相对活性约为15％。Properase CT低温碱性蛋白酶在pH 10条件下，最适反应温度50℃-55℃，20℃时相对活性约为42％。所以，传统的洗涤剂用酶在低温条件下的酶活性已不适应新一代加酶洗涤剂的发展。低温碱性蛋白酶其最适反应温度通常在40℃以下，应用在食品、洗涤剂、化妆品、水产饲料等工业上，有着中温蛋白酶无法取代的优越性，因此对中温蛋白酶低温进化是非常必要的。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种在低温环境下酶活力较高的低温碱性蛋白酶及其制备方法。
本发明实现目的技术路线如下：
一种低温碱性蛋白酶，是通过如序列7所示的核苷酸序列编码的野生型碱性蛋白酶氨基酸序列中Glu110和Glu134的氨基酸位点替换，得到如序列8所示的核苷酸序列，经宿主细胞枯草芽孢杆菌高效表达后获得低温碱性蛋白酶。
而且，所述野生型碱性蛋白酶来源是嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilius ATCC 31408。
而且，所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600。
一种低温碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)定点突变野生型碱性蛋白酶的成熟肽基因得到低温碱性蛋白酶基因；
(2)将上述低温碱性蛋白酶基因与载体相连，得到携带低温碱性蛋白酶基因的重组表达载体；
(3)将重组载体转化入宿主菌株中，得到重组细胞；
(4)将重组细胞进行发酵制备低温碱性蛋白酶；
(5)提取低温碱性蛋白酶。
而且，所述的重组载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBE2S，pBE2S是一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭分泌表达型载体，含有一个强启动子P43启动蛋白酶基因的转录，一个嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽用于指导菌体中合成的蛋白酶分泌到胞外。
而且，所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600，该菌为6种胞外蛋白酶缺失菌。
本发明的优点和积极效果如下：
本发明使用重叠PCR技术，对野生型碱性蛋白酶进行定点突变，。利用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭分泌表达型载体，转化枯草芽孢杆菌，得到一种具有适冷性的低温碱性蛋白酶(Glu110&134Ala)，并且这一种低温碱性蛋白酶在40℃下，比野生型碱性蛋白酶活力提高了28％；在10℃下，比野生型碱性蛋白酶提高了62％。在低温碱性条件下有较高的酶活，可以节省能源，符合低碳发展理念，应用在食品、洗涤剂、化妆品、水产饲料等工业上，有着中温蛋白酶无法取代的优越性，具有明显的经济效益及社会效益。
附图说明
图1为本发明定点突变流程
图2为本发明重组质粒pBE2S-Mapr的构建示意图；
图3为本发明重组子验证图(1为重组质粒单酶BamHI切，2为重组质粒单酶HindIII切，3为重组质粒双酶切，4为1kb DNA ladder，5为PCR验证)；
图4为本发明SDS-PAGE分析碱性蛋白酶的表达(M为蛋白分子量标准，1为pBE2S-Maprm/WB600，2为pBE2S/WB600)；
图5为本发明在10℃-80℃下，野生型碱性蛋白酶与低温碱性蛋白酶水解酪素相对酶活力。
图6为本发明工程菌表达产物纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(M为蛋白分子量标准，1为野生型碱性蛋白酶，2为低温碱性蛋白酶Glu110&134Ala)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例
1、野生型碱性蛋白酶成熟肽基因Mapr的获得
(1)嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilius ATCC 31408)染色体DNA的提取：
①取1mL菌液于1.5mLEp管中，12000r/min离心1min，弃去上清液，收集菌体。
②悬浮于100μL含有溶菌酶(2mg/mL)的pH8.0TE缓冲液中，用枪头反复吸打均匀，放于37℃培养箱中30～60min。
③加400μL裂解液，用枪头快速吹打，混匀。
④加200μL 5mol/L NaCl，轻混，12000r/min离心10min。
⑤将上清液转至另一灭菌Ep管中，加入等体积苯酚∶氯仿＝1∶1，轻轻颠倒数次，混匀。
⑥12000r/min离心10min，再取上清，酚仿反复抽提两次，最后再用等体积的氯仿抽提一次。
⑦12000r/min离心5min，吸上层水相至另一灭菌Ep管。
⑧加预冷的2倍体积无水乙醇离心沉淀DNA，-70℃，沉淀20min，12000r/min，离心10min。
⑨用1mL 70％乙醇洗涤2次，12000r/min，离心5min，将乙醇倒出，室温静置干燥30min，溶于20μL 1×TE中，加入1μL 1mg/mL的RNase，-20℃保存。
(2)目的基因的获得
参照Genbank上报道的基因序列，并结合所用的pBE2S质粒上的酶切位点，设计引物：
上游引物P1：5’-cgcggatccgcgcaatcagtgccatgggga-3’(下划线部分为加入的BamHI酶切位点)，
下游引物P2：5’-cccaagcttttagcgtgttgccgcttctgcattga-3’(下划线部分为加入的HindIII酶切位点)。
以嗜碱芽孢杆菌染色体DNA为模板，进行PCR，反应体系为：ddH2O37μL，10×buffer5μL，dNTPs(5mmol/L)2μL，引物P1(20μmol/L)2μL，引物P2(20μmol/L)2μL，DNA1μL，Pyrobest高保真DNA聚合酶1μL。扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min反应30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测在约0.8kb处出现特异性条带。大小与Genbank上所报道的807bp相符。
2、野生型碱性蛋白酶基因的定点突变
(1)野生型碱性蛋白酶基因连接入载体pUC19.
将PCR扩增得到的目的基因进行纯化，用BamHI和HindIII双酶切，酶切产物再经纯化后，琼脂糖凝胶电泳检测。同时也将质粒pUC19用BamHI和HindIII进行双酶切，纯化，最后采用T4DNA连接酶12℃连接16h，构建重组质粒pUC19-Mapr。利用电转化法将该重组质粒转入大肠杆菌JM109中，双酶切和PCR验证结果表明Mapr基因已成功克隆到载体pUC19上。
将其测序可知扩增到野生型碱性蛋白酶的序列如SEQ ID No.7。
(2)定点突变
基于重叠PCR技术(见图1)进行定点突变，构建低温碱性蛋白酶。设计引物如下：
上游引物P1：5’-cgcggatccgcgcaatcagtgccatgggga-3’(下划线部分为加入的BamHI酶切位点)，
下游引物P2：5’-cccaagcttttagcgtgttgccgcttctgcattga-3’(下划线部分为加入的HindIII酶切位点)。
重叠引物P3：5’-ccaaggattggcatgggcagggaac-3’
重叠引物P4：5’-gttccctgcccatgccaatccttgg-3’
重叠引物P5：5’-gccacacttgcgcaagctgttaata-3’
重叠引物P6：5’-tattaacagcttgcgcaagtgtggc-3’
在上游引物和下游引物5’端分别引入BamHI和HindIII酶切位点。重叠引物P3与重叠引物P4互补，重叠引物P5与重叠引物P6互补。重叠引物P3与P4中包含了对110位氨基酸残基的突变。而重叠引物P5与P6中则包含了对134位氨基酸残基的突变。
Glu110→Ala
用引物P1、P4扩增上游片段Mapr1，P3、P2扩增下游片段Mapr2。
PCR反应体系包括：10×PCR反应缓冲液5μL，dNTP 2μL，上游引物P1、P3/下游引物P2、P4各1μL，重组质粒pUC19-Mapr 100ng，Pfu DNA聚合酶5U，无菌去离子水补充至5OμL。
PCR扩增条件为：94℃预变性5min，共1个循环；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，共1个循环。
PCR产物切胶回收，适当稀释。以Mapr1、Mapr2为引物，进行PCR。PCR反应体系为：10×PCR反应缓冲液5μL，dNTP 2μL，Mapr1、Mapr2各1μL，Pfu DNA聚合酶5U，无菌去离子水补充至48μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸1min，5个循环；加入引物P1、P2各1μL，进行PCR，PCR扩增条件同前。
对PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段。得到Glu110→Ala的野生型碱性蛋白酶突变基因。
Glu134→Ala
用野生型碱性蛋白酶突变基因Glu110→Ala为模板，引物P1、P6扩增上游片段Mapr3，P5、P2扩增下游片段Mapr4。
PCR反应体系包括：10×PCR反应缓冲液5μL，dNTP 2μL，上游引物P1、P5/下游引物P2、P6各1μL，野生型碱性蛋白酶突变基因Glu110→Ala 50ng，Pfu DNA聚合酶5U，无菌去离子水补充至50μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性5min，共1个循环；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，共1个循环。
PCR产物切胶回收，适当稀释。以Mapr3、Mapr4为引物，进行PCR。PCR反应体系为：10×PCR反应缓冲液5μL，dNTP 2μL，Mapr3、Mapr4各1μL，Pfu DNA聚合酶5U，无菌去离子水补充至48μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸1min，5个循环；加入引物P1、P2各1μL，进行PCR，PCR扩增条件同前。
对PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段。得到Glu110&134→Ala的低温碱性蛋白酶基因Maprm(Glu110&134Ala)。
3、低温碱性蛋白酶表达载体的构建。
大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBE2S利用组成型强启动子P43可以启动其下游基因的表达，且重组分泌载体所含的嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽用于指导菌体中合成的蛋白酶分泌到胞外，可以引导表达产物进入枯草芽孢杆菌的分泌途径，最终分泌到细胞外。质粒pBE2S，野生型碱性蛋白酶基因分别经过双酶切(BamHI，HindIII)纯化，回收，混匀，连接(12℃，16h)。低温碱性蛋白酶(Glu110&134Ala)跟质粒pBE2S构建程序与质粒pBE2S和野生型碱性蛋白酶相同。如图3所示。
将混合产物转化至40μL大肠杆菌JM109感受态细胞。
将重组子质粒和空质粒分别用单酶切和双酶切，结果如图4所示。重组质粒pBE2S-Maprm双酶切得到两条带：一条分子量大小约0.8kb，与PCR产物带大小一致；另一条带大小约3.8kb，与线性pBE2S的分子量大小相符；而单酶切的重组子分子量正好是两者之和为4.6kb，这说明质粒pBE2S上已连接有目的基因Maprm。
pBE2S-Maprm为模板进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，在0.8kb处分别出现特异性条带，其大小与目的基因片段大小完全吻合，而空质粒对照则没有，进一步说明重组质粒上已连有目的基因Maprm。
4、含有低温碱性蛋白酶基因工程菌的构建和筛选。
(1)枯草芽孢杆菌高效电转化法感受态的制备及转化
挑取一环孢子接种于少量生长培养基(LB+0.5M山梨醇)中，过夜培养。将种子以1/16的接种量接种于生长培养基(LB+0.5M山梨醇)中，37℃摇床震荡培养，至OD600在0.85～0.95左右。冰水浴冷却培养物10min，于4℃，5000×g，离心5min收集菌体。反复用冰冷的电击缓冲液(0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇，10％(V/V)甘油)洗涤细胞收集物4次。用原培养液1/40体积的电击缓冲液重新悬浮细胞收集物，细胞浓度应该在1～1.3×1010cfu/mL。感受态细胞可以分成小份保存在-80℃，在转化效率有所下降之前都可以正常使用。转化条件：60μL感受态细胞加入8μL(50ng/μL)重组质粒混匀并转移到冰冷的电转化杯(1mm)中，冰浴1～1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5～5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布在含卡那霉素的LB平板上，37℃培养，观察和验证转化子。
(2)枯草芽孢杆菌中质粒的提取
挑取枯草芽孢杆菌单菌落，接入到5mL含10μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，于37℃条件下180r/min振荡培养过夜。将1.5mL菌液转入干净的微量离心管中，12000r/min离心5min，收集菌体，弃上清。沉淀用1mL TE溶液充分悬浮。转入EP管中，再用TE溶液洗涤菌体1～2次。收集菌体后，加预冷的溶液I 150μL，再加入40μL10mg/mL的溶菌酶，充分悬浮菌体，置于0℃放置40min。沿管壁加入300μL溶液II，轻轻颠倒离心管3～5次，置0℃4min后，迅速加入200μL溶液III，0℃放置20min以上。12000r/min 4℃离心8min，上清液转管，并加入等体积的苯酚∶氯仿(1∶1)，反复颠倒离心管数次。12000r/min离心5min，上清液转管，加入两倍体积的无水乙醇，-70℃放置20min。12000r/min离心10min，弃上清液，用0.5mL 75％乙醇洗涤沉淀1～2次，每次洗后用微量加样器小心吸去上清。用8～20μL无菌双蒸水或TE溶液溶解沉淀，-20℃保存。
5、枯草芽孢杆菌重组菌株中低温碱性蛋白酶的表达。
将验证为阳性的转化子接种于含25μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/min培养过夜，按1％接种量转接于50mL新鲜培养基中，200r/min培养24h，直接取上清液进行SDS-PAGE分析。
在枯草芽孢杆菌WB600中，利用组成型强启动子P43可以启动其下游基因的表达，且重组分泌载体所含的嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽可以引导表达产物进入枯草芽孢杆菌的分泌途径，最终分泌到细胞外。由图5可知，对上清液进行SDS-PAGE，以带有空质粒的宿主菌WB600/pBE2S的上清液作对照，在分子量大约为28kDa的位置，结果发现重组子WB600/pBE2S-Maprm的上清液有一条明显的蛋白带，分子质量与碱性蛋白酶的理论相对分子质量相符，而对照菌株在28kDa处无蛋白带，说明碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中成功地表达，并且碱性蛋白酶在嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽序列引导下分泌到细胞外，完成了分泌表达。
将低温碱性蛋白酶基因(Glu110&134Ala)分别与载体pBE2S连接，利用高渗电转化法转化枯草芽孢杆菌蛋白酶缺陷菌株WB600，通过双酶切、PCR法验证。利用缺失6种胞外蛋白酶的枯草芽孢杆菌WB600作为宿主，碱性蛋白酶(野生型碱性蛋白酶、Glu110&134Ala)在重组菌株WB600/pBE2S-Mapr及WB600/pBE2S-Maprm较高水平的表达。从图6可知，在40℃下，其发酵液酶活酶活分别为1563U/mL、1985U/mL，低温碱性蛋白酶比野生型碱性蛋白酶活力提高了28％。在10℃下，比野生型碱性蛋白酶提高了62％。
6、低温碱性蛋白酶的分离纯化。
(1)盐析：将发酵液离心、浓缩处理，取上清浓缩液100ml；将装有上清液的烧杯放在另一装有冰水的大烧杯内，置于磁力搅拌器上搅拌；边搅拌，边按照确定的分级沉淀条件加入硫酸铵进行盐析；将盐析后的溶液8000r/min离心10min；弃去上清液，将沉淀溶于蒸馏水。
(2)透析：
透析袋的准备：用10mmol/L碳酸氢钠溶液煮沸透析袋30min；之后，用双蒸水充分洗涤透析袋，洗毕，在4℃贮存于1mmol/L EDTA溶液中。
透析：将盐析所得沉淀物溶液装入打结的透析袋中，将透析袋放入10倍于该溶液体积的蒸馏水中，4℃透析。
(3)将DEAE Sephadex-A-50溶于10倍体积的去离子水中静止过夜，使其溶涨，用0.5mol/L NaOH溶液浸泡1h，再用去离子水反复清洗，过滤，然后用0.5mol/L HCl溶液浸泡1h后用去离子水反复清洗，过滤，再用0.5mol/L NaOH溶液反复清洗后，再用去离子水充分清洗至pH值不变，脱气备用。将清洗的离子交换剂溶于0.02mol/L pH6.0的PBS缓冲溶液中平衡，过滤，将平衡后的离子交换剂倒入柱中，再用0.02mol/L pH6.0的PBS缓冲溶液洗柱到pH6.0。将透析后的样品溶液8000r/min离心10min，取上清液缓慢加在柱床表面。
(4)Sephadex G-75凝胶过滤层析
层析柱的填装：凝胶溶于2.5mmol/L醋酸钠(pH 5.0)缓冲液中，搅拌混匀。自然溶胀24h。用真空泵对凝胶浆抽气1h以排除气泡。装柱前取3/4体积的凝胶和1/4体积的缓冲液制成凝胶浆。先将缓冲液加入层析柱，当有缓冲液流出时关闭柱的出口。沿玻璃棒一次倾入凝胶浆，当凝胶装到柱底之后，打开柱底出口以加快装柱进程，随之加以更多的缓冲液。将层析柱与蠕动泵和贮液器相连接，用三倍柱床体积的缓冲液洗涤层析柱，使其平衡。待平衡液流至床表面以下1～2mm，关闭出口。
样品上柱：将过DEAE Sephadex-A-50活性峰蛋白质溶液进入，当溶液表面与柱床表面重合时，仔细地加入2.5mmol/L醋酸钠(pH 5.0)缓冲液，待降至床表面下2～5em时，接恒压洗脱瓶，以1mL/min加量进行蛋白质的层析和洗脱。每管2mL分部收集。测定A280nm吸光值及酶活。
层析柱的再生：以2倍体积的0.2％NP-40再生层析柱。以4倍体积的去离子水清洗层析柱。以5倍体积的2.5mmol/L醋酸钠(pH 5.0)缓冲液重新平衡层析柱。
将介质浸泡于加0.02％叠氮钠的醋酸钠缓冲液中，4℃保存。
收集经过四步纯化的蛋白酶液，浓缩后，经过SDS-PAGE检测，分离得到的组分呈单一条带，其分子量为28KDa，见图7。
野生型碱性蛋白酶上清液比活力达到35722U/mg，纯度提高了59.5倍，回收率为22.3％；低温碱性蛋白酶(Glu110&134Ala)上清液经分离纯化后，比活力达到45724U/mg，纯度提高了62.6倍，回收率为15.7％。
如表1所示，在10℃下，野生型碱性蛋白酶的Km值为151uM，而低温碱性蛋白酶Glu110&134Ala的Km值为111uM；在40℃下，野生型碱性蛋白酶的Km值为236uM，而低温碱性Glu110&134Ala的Km值为192uM。发现在10℃和40℃下，与野生型碱性蛋白酶比较，低温碱性蛋白酶的Km值变小，说明由于突变导致酶结构发生改变，酶更容易与底物特异结合。
Kcat是转化率常数，单位酶的催化常数(Kcat)或转换数等于每个酶分子每秒钟转换成产物(或底物)的最大分子数，在数值上Kcat等于Vmax除以总酶浓度，即：
Kcat＝Vmax/[E]
实验体系下的酶浓度为0.01mg/mL，酶分子量为28kDa，计算出的Kcat数值及Kcat/Km。由表1可知，在10℃条件下，低温碱性蛋白酶Kcat值为39.1s-1，高于野生型碱性蛋白酶的Kcat值(25.6s-1)。
获得了一个具有适冷性的低温碱性蛋白酶(Glu110&134Ala)。
经过比较，发现本发明涉及的产低温碱性蛋白酶工程菌制备生成的低温碱性蛋白酶，在40℃下，低温碱性蛋白酶(Glu110&134Ala)比野生型碱性蛋白酶活力提高了28％；在10℃下，比野生型碱性蛋白酶提高了62％。
表1 野生型碱性蛋白酶与低温碱性蛋白酶的酶动力学参数
以下为本发明野生型碱性蛋白酶及低温碱性蛋白酶基因序列(1-Mapr、2-Glu110&134Ala)；
野生碱性蛋白酶 AGGATTG
TGGGCAGGGAACAATGGCAT 350
低温碱性蛋白酶 AGGATTG
TGGGCAGGGAACAATGGCAT 350
野生碱性蛋白酶 GCCACACTT
CAAGCTGTTAATAGCGGC 420
低温碱性蛋白酶 GCCACACTT
CAAGCTGTTAATAGCGGC 420
Claims (5)
1.一种低温碱性蛋白酶，其特征在于：是通过如序列7所示的核苷酸序列编码的野生型碱性蛋白酶氨基酸序列中Glu110和Glu134的氨基酸位点替换，得到如序列8所示的核苷酸序列，经宿主细胞枯草芽孢杆菌高效表达后获得低温碱性蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的低温碱性蛋白酶，其特征在于：所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)WB600。
3.一种如权利要求1所述的低温碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）定点突变野生型碱性蛋白酶的成熟肽基因得到低温碱性蛋白酶基因；
（2）将上述低温碱性蛋白酶基因与载体相连，得到携带低温碱性蛋白酶基因的重组表达载体；
（3）将重组载体转化入宿主菌株中，得到重组细胞；
（4）将重组细胞进行发酵制备低温碱性蛋白酶；
（5）提取低温碱性蛋白酶。
4.根据权利要求4所述的低温碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述的重组载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBE2S，pBE2S是一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭分泌表达型载体，含有一个强启动子P43启动蛋白酶基因的转录，一个嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽用于指导菌体中合成的蛋白酶分泌到胞外。
5.根据权利要求4所述的低温碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600，该菌为6种胞外蛋白酶缺失菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110220386 CN102277344B (zh) | 2011-08-03 | 2011-08-03 | 一种低温碱性蛋白酶及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110220386 CN102277344B (zh) | 2011-08-03 | 2011-08-03 | 一种低温碱性蛋白酶及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102277344A CN102277344A (zh) | 2011-12-14 |
| CN102277344B true CN102277344B (zh) | 2012-12-12 |
Family
ID=45103077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110220386 Active CN102277344B (zh) | 2011-08-03 | 2011-08-03 | 一种低温碱性蛋白酶及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102277344B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103409347B (zh) * | 2013-07-25 | 2015-10-28 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 一种产碱性蛋白酶的菌株及其工业化液体发酵方法 |
| CN104818225A (zh) * | 2015-03-10 | 2015-08-05 | 天津科技大学 | 低温蛋白酶生产菌及该菌产生的低温蛋白酶和该酶的基因 |
| CN106801048B (zh) * | 2017-03-01 | 2019-07-16 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种低温碱性蛋白酶及其制备方法 |
| CN109852615B (zh) * | 2019-01-17 | 2022-11-22 | 天津科技大学 | 一种能够表达碱性蛋白酶的双向启动子、应用、质粒和基因工程菌 |
| CN110106128B (zh) * | 2019-04-24 | 2021-08-17 | 天津科技大学 | 一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1036602A (zh) * | 1988-02-11 | 1989-10-25 | 哥斯特-布卡德斯公司 | 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用 |
| CN101597615A (zh) * | 2009-07-10 | 2009-12-09 | 天津科技大学 | 低温碱性蛋白酶基因、含有该基因的工程菌及二者的构建方法以及低温碱性蛋白酶 |
-
2011
- 2011-08-03 CN CN 201110220386 patent/CN102277344B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1036602A (zh) * | 1988-02-11 | 1989-10-25 | 哥斯特-布卡德斯公司 | 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用 |
| CN101597615A (zh) * | 2009-07-10 | 2009-12-09 | 天津科技大学 | 低温碱性蛋白酶基因、含有该基因的工程菌及二者的构建方法以及低温碱性蛋白酶 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Laan J.C.,et al.Cloning,characterizaiton,and multiple chromosomal integration of a bacillus alkaline protease gene.《Applied and environmental microbiology》.1991,第57卷(第4期),901-909. * |
| Martin JR et al.The solution structure of serine protease PB92 from Bacillus alcalophilus presents a rigid fold with a flexible substrate-binding site.《Structure》.1997,第5卷(第4期), * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102277344A (zh) | 2011-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106754833B (zh) | 在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法及重组枯草芽孢杆菌 | |
| CN102277344B (zh) | 一种低温碱性蛋白酶及其制备方法 | |
| CA2074084A1 (en) | Enzyme exhibiting cellulase activity | |
| CN112553134B (zh) | 一种在枯草芽孢杆菌中表达α-淀粉酶的方法 | |
| CN104651383A (zh) | 一种重组毕赤酵母工程菌及其生产方法 | |
| CN102586167B (zh) | 一株重组的枯草芽孢杆菌及由其生产转谷氨酰胺酶的方法 | |
| CN106801048B (zh) | 一种低温碱性蛋白酶及其制备方法 | |
| CN103937830A (zh) | 一种高效分泌表达纳豆激酶的重组菌 | |
| CN109022438A (zh) | 一种角蛋白酶异源表达的启动子及其应用 | |
| CN113151270A (zh) | 一种高效表达碱性蛋白酶的启动子及其应用 | |
| CN104480087B (zh) | 一种耐高温α‑淀粉酶及其制备方法和应用 | |
| CN106701813A (zh) | 表达载体及其构建方法与应用 | |
| CN100348720C (zh) | 一种生产甘露聚糖酶的方法及其专用工程菌 | |
| CN110093326B (zh) | 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用 | |
| CN105154417B (zh) | 一种真菌来源的酸性纤维素酶及其基因和应用 | |
| CN101182475B (zh) | 高效表达弹性蛋白酶的毕赤酵母及其构建方法和应用 | |
| CN111808834A (zh) | 在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法、重组启动子以及应用 | |
| CN101457230B (zh) | 一种高温α-淀粉酶及其突变体的高效制备方法 | |
| CN105018407A (zh) | 一种分泌表达脯氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN112980753B (zh) | 用于外源蛋白分泌的糖苷水解酶融合表达系统 | |
| CN102229942A (zh) | 多功能穿梭载体new pBE2 及其构建方法以及利用该载体构建碱性蛋白酶突变库的方法 | |
| CN101407822B (zh) | 一种双精氨酸途径蛋白质分泌载体的构建方法及其应用 | |
| CN102712932B (zh) | 经修饰的木聚糖酶的核苷酸分子及其应用 | |
| CN105420220A (zh) | 一种天冬氨酸类蛋白酶及其编码基因与应用 | |
| CN100497615C (zh) | 基因重组毕赤酵母生产蛋白酶的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20111214 Assignee: Shandong Longkete Enzyme Preparation Co., Ltd. Assignor: Tianjin University of Science & Technology Contract record no.: 2015370000061 Denomination of invention: Low-temperature alkaline protease and preparation method thereof Granted publication date: 20121212 License type: Exclusive License Record date: 20150427 |
|
| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model |