CN100497615C - 基因重组毕赤酵母生产蛋白酶的方法 - Google Patents

基因重组毕赤酵母生产蛋白酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明是一种基因重组毕赤酵母生产中性蛋白酶的方法。其特征在于采用巴斯德毕赤氏酵母生产中性蛋白酶。利用巴斯德毕赤氏酵母表达外源蛋白具有高表达、高稳定、高分泌的优点。由于巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)本身不能合成枯草杆菌蛋白酶，本发明通过基因工程的手段，在巴斯德毕赤氏酵母中导入枯草杆菌中性蛋白酶基因，使巴斯德毕赤氏酵母大量产生枯草杆菌中性蛋白酶，由于巴斯德毕赤氏酵母非常容易实现高密度发酵，具有高分泌的特点，因此很容易实现工业化大量廉价生产枯草杆菌中性蛋白酶。

Description

基因重组毕赤酵母生产蛋白酶的方法
技术领域
本发明涉及基因重组毕赤酵母生产中性蛋白酶的方法。
背景技术
蛋白酶是催化肽键水解的一类酶类，中性蛋白酶是指其最适作用pH为6.0～7.5的一类蛋白酶，其主要作用为皮革脱毛、毛皮软化、制蛋白胨、酵母膏、肝宁及用于食品工业等。
中性蛋白酶的研究开发工作自上世纪七十年代就已开始，国内外都于上世纪八十年代初实现产业化，生产的菌种中固体发酵大都采用曲霉，其中主要为栖土曲霉和米曲霉。而液体发酵大都采用细菌，其中以枯草杆菌、液化淀粉芽孢杆菌及腊状芽孢杆菌产量较高。液体发酵也有采用放线菌进行生产的。目前我国生产中性蛋白酶主要采用栖土曲霉、枯草芽孢杆菌，但中性蛋白酶发酵单位一直很低，发酵不稳定，易受噬菌体和酵母的污染。因此国内外科技工作者一直致力于中性蛋白酶生产菌及生产工艺的改进。自上世纪八十年代，国内外科技工作者在相关领域主要做了以下几方面工作：
①筛选耐噬菌体污染菌。
云南大学刘士清等人通过大量的诱变处理及抗噬菌体突变体的筛选工作，得到了抗噬菌体的突变体，该突变体具有较强的抗噬菌体的能力，目前噬菌体污染这一问题已基本上得到解决。
②通过传统的诱变技术筛选高产菌株。
工业上用来生产中性蛋白酶的高产菌株，大多数都是通过诱变后筛选得到的突变株。刘白玲等经过物理和化学复合诱变后，得到中性蛋白酶活性高于B.subtilis AS1.398 30％以上的正突变株。李永泉等人采用激光诱变技术，使中性蛋白酶产生菌发酵单位达到8200单位/每毫升发酵液。刑台酶制剂厂采用温刺法及刘士清等[10]采用DES诱变结合热处理使菌株中性蛋白酶发酵单位分别达到8000和12000单位/毫升发酵液。中国人民解放军兽医大学利用卫星搭载蛋白酶生产菌，通过空间诱变育种使中性蛋白酶活性提高1～3倍。但是，由于诱变通常会导致两种蛋白酶(中性和碱性蛋白酶)的同时高产，因此就需要寻找更为有效的提高中性蛋白酶产量的方法。
③采用基因工程手段以提高中性蛋白酶的发酵单位。
随着分子生物学技术的迅猛发展和广泛应用，中性蛋白酶的分子生物学研究逐步兴起，至今已经克隆出多种不同微生物来源的中性蛋白酶基因，并在细菌及酵母等各种宿主菌中得到了表达。目前，商业上所用的中性蛋白酶大部分来源于芽孢杆菌属(Bacillus)，据统计，早在1980年，仅芽孢杆菌中蛋白酶就已占了商品酶总产量的38％。因此，采用生物技术大幅度地提高芽孢杆菌中性蛋白酶的产量，一直以来都是基因工程研究领域的重要课题之一。
自上个世纪八十年代以来，为使中性蛋白酶基因获得高效表达，来自包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)和淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等在内的十多种芽孢杆菌属中性蛋白酶基因在B.subtilis中得到表达。1983年，Fujii等将从B.stearothermophilus CU21中克隆得到的中性蛋白酶基因转入同种菌的另一菌株MD-3中进行表达，中性蛋白酶的产量比供体菌提高了15倍。1984年，Maria等从B.subtilis中克隆出中性蛋白酶基因(nprE)，通过高拷贝质粒将其转入B.subtilis BG84中表达，中性蛋白酶活性达3000U/ml。1991年，杨庆云等用鸟枪法克隆得到B.stearothermophilus313-1的中性蛋白酶基因，该基因在B.subtilis中的表达量比供体菌株提高了约30倍。华东理工大学王丽影等人从枯草杆菌中克隆出蛋白酶基因，然后克隆入B.subtilis中进行表达，并结合补料分批发酵工艺，使发酵单位达13000单位/每毫升发酵液。
由于B.subtilis具有无致病性和可将表达的各种蛋白酶分泌到细胞外等特点，因此，目前中性蛋白酶基因的克隆一般都以B.subtilis作为宿主菌，除此之外，也有用大肠杆菌和酵母菌作为受体菌来表达中性蛋白酶基因的。但据文献报道，一般重组的中性蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达量要比在供体菌中低，即便是有所提高，其表达的蛋白也难以分泌到培养基中，而是积累在细胞质或周质腔内。1993年，Lin-Fa Wang等人将B.subtilis中的完整中性蛋白酶基因(nprE)首次转入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisine)中进行异源表达。但是，表达的蛋白质未能分泌至胞外，而是以蛋白酶前体的形式累积在胞内，当把酵母转化酶的信号肽序列整合到成熟nprE上游时，中性蛋白酶分泌到胞外，然而，表达产物由于高度糖基化而无生物学活性。从以上这些报道中可以看出，中性蛋白酶的总体表达水平不高，但同时也证实了利用基因工程手段来提高中性蛋白酶表达水平的有效性。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因重组毕赤酵母生产中性蛋白酶的方法。它是从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus 168)中分离出中性蛋白酶基因，成功实现中性蛋白酶基因在真核表达系统毕赤酵母中的高效表达。
本发明是从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus 168)中分离出中性蛋白酶基因，在真核表达系统毕赤酵母中高效表达。
本发明的具体方法和步骤
1、工程菌的构建
采用多聚酶链反应(PCR)的方法，从Bacillus subtilus 168中克隆出编码中性蛋白酶基因的全序列，然后克隆入毕赤酵母表达载体PGAP得到重组子，重组子分别转化毕赤酵母表达宿主GS115，SMD1168。然后分别筛选出高效表达转化子GSp5和SMDp18，转化子为组成型表达，在普通葡萄糖培养基中就能产生中性蛋白酶。
所克隆出任何基因片断具备编码下列氨基酸序列：
MGLGKKLSVRVAASFMSLSISLPGVQAAEGHQLKENQTNFLSKKPIAQSELSAPNDKAVKQFLKKNSNIFKGDPSKSVKLVESTTDALGYKHFRYAPVVNGVPIKDSQVIVHVDKSDNVYAVNGELHNQSAAKTDNSQKVSSEKALALAFKAIGKSPDAVSNGAAKNSNKAELKAIETKDGSYRLAYDVTIRYVEPEPANWEVLVDAETGSILKQQNKVEHAAATGSGTTLKGATVPLNISYEGGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNRQSRLPGTLVSSTTKTFTSSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYSNFKRNSYDNKGSKIVSSVHYGTQYNNAAWTGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSLDVTAHEMTHGVTQETANLIYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYNQPDNYANYRNLPNTDEGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKLGVSKSQQIYYRALTTYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSTDAAKVEAAWNAVGL
2、采用上述基因工程菌通过摇瓶生产中性蛋白酶
从平板上取少量菌接种于YEPD培养基[1％酵母粉、2％蛋白胨、2％甘油(或葡萄糖)]，30℃，200转/分培养四天后，经5000转/分离去除细胞，得到含中性蛋白酶的上清液。然后进行发酵液酶活和酶学性质的检测。
3、酶活测定方法和粗酶酶学性质
(1)酶活测定方法
①原理：
蛋白酶在一定的条件下，水解酪素底物，生成含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，故可在680nm的波长下进行比色，计算酶活力。
②酶反应体系：
1ml适当稀释的发酵液，1ml溶于pH7.5，0.02mol/L磷酸缓冲液中的1％酪素溶液，40℃反应10min，生成的酪氨酸采用福林法测定。
③酶活定义：
在上述条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为一个酶活单位。
(2)粗酶酶学性质
①酶作用的最适pH：见表1和图1
表1.酶作用的最适pH
Figure C200410079582D00061
②pH对酶稳定性的影响：见表2和图2
表2.pH对酶稳定性的影响
Figure C200410079582D00071
③酶作用的最适温度：见表3和图3
表3.酶作用的最适温度
④温度对酶稳定性的影响：见表4和图4
表4.温度对酶稳定性的影响
Figure C200410079582D00081
也可使用不同的培养方法、不同的提取方法得到。
本发明与现有技术相比所具有的有益效果：
巴斯德毕赤氏酵母是真核基因新型表达系统。这个系统有着独特的优点，潜力很大，利用其表达外源蛋白具有下列优点：(1)高表达。由于表达载体利用醇氧化酶基因启动子很强，细胞生长速度很快，所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高。例如破伤风毒素蛋白的产量达12g/L，而目前常用的表达系统一般在毫克级。所以其表达量比其它系统高10倍甚至100倍，这在表达量方面是一大突破。(2)高稳定。由于该系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在，而是整合在染色体上，所以构建的菌株十分稳定。(3)高分泌。将酿酒酵母中的一些信号系列和先导序列用于该表达系统，加之它自身的生物学特性，其分泌表达可达10g/L，这在已知的分泌表达系统中是十分少见的。鉴于该表达系统具大潜力，因此该表达系统对于新型酶种的开发具有重大意义。
巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)本身不能合成枯草杆菌蛋白酶，本发明通过基因工程的手段，在巴斯德毕赤氏酵母中导入枯草杆菌中性蛋白酶基因，使巴斯德毕赤氏酵母大量产生枯草杆菌中性蛋白酶，由于巴斯德毕赤氏酵母非常容易实现高密度发酵，具有高分泌的特点，因此很容易实现工业化大量廉价生产枯草杆菌中性蛋白酶。
附图说明
图1是本发明的酶作用的最适pH。
图2是本发明的pH对酶稳定性的影响。
图3是本发明的酶作用的最适温度。
图4.是本发明的温度对酶稳定性的影响。
具体实施方式
实施例：
按以下方法制取中性蛋白酶：
1、工程菌的构建
采用多聚酶链反应(PCR)的方法，从Bacillus subtilus 168中克隆出编码中性蛋白酶基因的全序列，然后克隆入毕赤酵母表达载体PGAP得到重组子，重组子分别转化毕赤酵母表达宿主GS115，SMD1168，然后分别筛选出组成型高效表达转化子(GSp5和SMDp18)(在普通葡萄糖培养基中就能产生中性蛋白酶)。从Bacillus subtilus 168中所克隆出的基因片断具备编码下列氨基酸序列：MGLGKKLSVRVAASFMSLSISLPGVQAAEGHQLKENQTNFLSKKPIAQSELSAPNDKAVKQFLKKNSNIFKGDPSKSVKLVESTTDALGYKHFRYAPVVNGVPIKDSQVIVHVDKSDNVYAVNGELHNQSAAKTDNSQKVSSEKALALAFKAIGKSPDAVSNGAAKNSNKAELKAIETKDGSYRLAYDVTIRYVEPEPANWEVLVDAETGSILKQQNKVEHAAATGSGTTLKGATVPLNISYEGGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNRQSRLPGTLVSSTTKTFTSSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYSNFKRNSYDNKGSKIVSSVHYGTQYNNAAWTGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSLDVTAHEMTHGVTQETANLIYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYNQPDNYANYRNLPNTDEGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKLGVSKSQQIYYRALTTYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSTDAAKVEAAWNAVGL
2、采用上述基因工程菌通过摇瓶生产中性蛋白酶
从平板上取少量菌接种于YEPD培养基(现有技术)中，培养基的组成是：1％酵母粉、2％蛋白胨、2％甘油(或葡萄糖)；在该培养基中30℃，200转/分培养四天后，经5000转/分离去除细胞，得到含中性蛋白酶的上清液。然后进行发酵液酶活和酶学性质的检测。

Claims (2)

1.一种基因重组毕赤酵母生产中性蛋白酶的方法，其特征在于采用巴斯德毕赤氏酵母生产中性蛋白酶，即采用多聚酶链反应的方法，从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)168中克隆出编码中性蛋白酶基因的全序列，然后克隆入毕赤酵母表达载体PGAP得到重组子，重组子分别转化毕赤酵母表达宿主GS115，SMD1168，然后分别筛选出组成型的高效表达转化子，得基因工程菌GSp5和SMDp18，该菌在普通葡萄糖培养基中就能产生中性蛋白酶；该全序列所编码的氨基酸序列如下：
MGLGKKLSVRVAASFMSLSISLPGVQAAEGHQLKENQTNFLSKKPIAQSELSA
PNDKAVKQFLKKNSNIFKGDPSKSVKLVESTTDALGYKHFRYAPVVNGVPIKD
SQVIVHVDKSDNVYAVNGELHNQSAAKTDNSQKVSSEKALALAFKAIGKSPD
AVSNGAAKNSNKAELKAIETKDGSYRLAYDVTIRYVEPEPANWEVLVDAETG
SILKQQNKVEHAAATGSGTTLKGATVPLNISYEGGKYVLRDLSKPTGTQIITY
DLQNRQSRLPGTLVSSTTKTFTSSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYSNFKRNSY
DNKGSKIVSSVHYGTQYNNAAWTGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSLDVTAHEM
THGVTQETANLIYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSL
SNPTKYNQPDNYANYRNLPNTDEGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKLGVSKS
QQIYYRALTTYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSTDAAKVEAAWNAVGL。
2.根据权利要求1所述的基因重组毕赤酵母生产中性蛋白酶的方法，其特征在于采用GSp5和SMDp18基因工程菌在普通葡萄糖培养基中，30℃，200转/分培养四天后，经5000转/分离心去除细胞，得到含中性蛋白酶的上清液。
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中性蛋白酶基因的克隆与表达载体的构建. 许波等.云南师范大学学报，第22卷第1期. 2002
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甲醇毕赤氏酵母表达体系. 陈偿.热带农业科学，第2期. 1999
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