CN102229942A - 多功能穿梭载体new pBE2 及其构建方法以及利用该载体构建碱性蛋白酶突变库的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多功能穿梭载体new pBE2及其构建方法以及利用该载体构建碱性蛋白酶突变库的方法，主要结构为LB-P43-SP-MCS-RB；其构建的主要步骤是将pBE2载体大片段分别与P43强启动子、SP的扩增产物连接，并引入BamHI酶切位点；构建碱性蛋白酶突变库的主要方法是将嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因成熟肽片段连入new pBE2，然后转化大肠杆菌，获得阳性克隆，再将阳性克隆转化到枯草芽孢杆菌WB600中，然后进行几轮高通量筛选。本发明提供的构建碱性蛋白酶突变库的方法使得碱性蛋白酶基因突变的针对性增强，针对碱性蛋白酶成熟肽部分进行突变，大大减少了碱性蛋白酶定向进化研究的工作量。

Description

多功能穿梭载体new pBE2 及其构建方法以及利用该载体构建碱性蛋白酶突变库的方法

技术领域

本发明涉及穿梭载体，尤其是一种枯草芽孢杆菌-大肠杆菌间的多功能穿梭载体new pBE2及其构建方法及应用。

背景技术

pBE2简介

目前已经构建了很多在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌之间穿梭的载体，这些载体各有其优点和用途。但是，随着基因工程和分子生物学的快速发展，对载体提出了更高的要求，如多功能、高效表达等。郭新华等人基于pUB110和pGEM3各自的特点，对pUB110和pGEM3进行改造，通过酶切、连接等基因工程手段，构建了pBE2载体，该载体含有两个复制起始位点，可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中复制，性质较稳定，可以用于枯草芽孢杆菌的基因克隆和基因分析。

易错PCR(error-prone PCR)原理

在体外分子定向进化策略中，两个最关键的环节是产生分子多样性和定向筛选。在建立突变体文库方面，为了得到分子多样性，广泛采用的方法是随机突变的易错PCR。

1989年，Leung等提出了是一种能够简便快速地在DNA序列中随机突变的方法-易错PCR(error-prone PCR)技术，其基本原理是通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度，或使用低保真度DNA聚合酶等方法，使碱基在一定程度上随机错误引入，获得突变基因文库，然后筛选得到所需的突变体，该技术的关键在于选择适当的突变频率，较低的突变率(每代每序列有2-3个碱基置换或一个氨基酸替代)可以积累大部分的有益突变，较高的突变将产生中性突变或有害突变，由于在该方法中遗传变异只发生在单一分子内部，故属于无性进化(asexualevolution)。在蛋白质功能和结构研究、预测和发现蛋白质新功能等方面，易错PCR是一种有效的方法，它可以成功改变酶的稳定性、亲和力以及其它的一些功能，该法的不足之处在于：(1)靶序列长度一般为0.5-1.0kb，应用范围有限；(2)中性突变较多；(3)获得的DNA序列中碱基的转换高于颠换。

碱性蛋白酶研究现状

碱性蛋白酶(Alkaline protease)是指在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，1913年Rohm首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用，1945年瑞士Dr.Jaag等人在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中发现了碱性蛋白酶。有数据显示，全世界工业用酶每年销售额大约为1亿美元，在所有的工业用酶制剂中75％是蛋白水解酶，而蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类，大约占全世界每年总销售量的60％左右。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，同时易于实现工业化生产，而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，因此，碱性蛋白酶研究成为蛋白酶研究的热点。

目前，国外碱性蛋白酶主要应用于洗涤及皮革等行业中，99％以上洗涤剂均添加了碱性蛋白酶，因此市场需求出现了供不应求的现象。相信随着碱性蛋白酶研究的进一步深入，该现象将会得到有效的缓解。当前国外碱性蛋白酶高产菌株的选育主要用基因工程技术和蛋白质工程手段进行工业微生物菌种的定向选育，目的性强，而且酶结构研究得也比较的深入。Tsuyoshi Nonaka等人研究了枯草杆菌抗氧化性稳定性并期望能应用于洗涤剂行业，KunamnenAdinarayana等人研究了枯草芽孢杆菌PE-11的热稳定性。研究表明，该酶在60℃处理了350min酶仍保持100％活力，因此碱性蛋白酶和高活力碱性蛋白酶工程菌构建成为国外碱性蛋白酶的热点。

我国碱性蛋白酶的研究发展也很快。目前，我国碱性蛋白酶研究已经达到了分子水平，利用基因工程手段和蛋白质工程手段定向改造碱性蛋白酶产生菌产酶活力及酶学性质是今后很长时间的一个发展趋势，随着生物技术基础研究的深入和应用技术手段的完善，碱性蛋白酶研究将会进入一个全新的阶段。但是国内仅局限在低温碱性蛋白酶的筛选方面，关于改善其热稳定性和提高其加工特性的研究还未见报道。因此，为使低温碱性蛋白酶能广泛应用到工业加工以及人们日常生活中，提高低温碱性蛋白酶的热稳定性研究显得非常重要和必要。

发明内容

本发明的目的是在于克服现有技术的不足之处，提供一种多功能穿梭载体new pBE2及其构建方法以及利用该载体构建碱性蛋白酶突变库的方法，其中载体new pBE2能有效提高外源蛋白的表达量以及构建碱性蛋白酶突变库及其筛选的效率，利用该载体构建碱性蛋白酶突变库的方法能快速高效地构建碱性蛋白酶基因突变库，提高了突变文库的丰度，为高通量筛选提供了便利条件。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种多功能穿梭载体new pBE2，其结构包括：LB-P43-KpnI-SP-MCS-RB。

而且，所述LB、RB为左、右臂，是pBE2经EcoRI/KpnI双酶切酶切获得的大片段的两端。

而且，所述P43为序列1的强启动子，SP为序列2的嗜碱芽孢杆菌信号肽加前肽部分，KpnI代表酶切位点。

而且，所述MCS为序列3的多克隆位点上游到下游的顺序分别是：BamHI、Xbal、SalI、PstI、SphI、HindIII酶切位点。

而且，所述LB-P43-SP-MCS-RB为环状，总长度为6876bp。

而且，所述P43强启动子来自于pWB980载体。

一种多功能穿梭载体new pBE2的构建方法，构建方法的步骤为：

(1)双酶切方法获得P43强启动子和pBE2载体大片段；

(2)利用PCR技术获得SP的扩增产物，并引入BamHI酶切位点；

(3)将P43强启动子、SP的扩增产物按顺序依次连入pBE2载体大片段；

(4)连接产物转化大肠杆菌，培养后挑取阳性转化子；

(5)双酶切验证。

而且，所述P43强启动子来自于pWB980载体。

一种利用多功能穿梭载体new pBE2构建碱性蛋白酶突变库的方法，构建的步骤如下：

(1)随机突变碱性蛋白酶成熟肽基因：据GeneBank报道的嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶的基因序列设计引物，以嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因为模板，利用易错PCR技术进行扩增得到成熟肽片段；

(2)将易错PCR扩增得到的成熟肽片段连入new pBE2；

(3)突变基因的克隆：步骤(2)的连接产物转化大肠杆菌，获得阳性克隆；

(4)高通量筛选：提取大肠杆菌中的阳性克隆，转化到枯草芽孢杆菌WB600中，通过高通量筛选获得符合要求的蛋白突变株；

(5)以步骤(4)中获得的功能有所改进菌株的碱性蛋白酶成熟肽基因作为下一轮易错PCR的模板，重复上述步骤，进行多轮易错PCR和高通量筛选，直到获得理想的突变菌株。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明以pBE2载体为基础，利用PCR、易错PCR、酶切、连接等基因工程手段对其进行改造，赋予新载体更多实用价值，其中P43为强启动子可以启动其下游的碱性蛋白酶的高效表达；信号肽与前肽作为一个整体元件引导蛋白的胞内定位，分泌及其在胞外的正确折叠，极大地提高了构建碱性蛋白酶突变库及其筛选的效率；信号肽与前肽下游接BamHI酶切位点，该酶切位点的设置便于在其下游引入碱性蛋白酶成熟肽突变基因。

2、本发明提供的构建碱性蛋白酶突变库的方法使得碱性蛋白酶基因突变的针对性增强，即只针对碱性蛋白酶成熟肽部分进行突变，大大减少了碱性蛋白酶定向进化研究的工作量，本方法的使用极大地提高了突变库的构建效率和突变文库的丰度，在提高工作效率的同时也大大节省了人力、物力和财力的损耗。

附图说明

图1为本发明载体new pBE2的结构示意图；

图2为本发明载体New pBE2构建流程图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一、多功能穿梭载体new pBE2的构建方法：

(1)对pWB980载体进行EcoRI/KpnI双酶切，获得P43强启动子；对pBE2载体进行EcoRI/KpnI双酶切，采用50ul酶切体系，37℃酶切3小时；

(2)连接pBE2酶切大片段和P43，采用20ul连接体系，16℃连接2小时；

(3)设计引物Psp1、Psp2，从嗜碱芽孢杆菌基因组中扩增碱性蛋白酶信号肽和前肽部分；

①设计引物

P_sp1：

CGGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAAGAAACCGTTGGGGAAAATT

G；横线部分为KpnI的酶切位点

Psp2：

CGCGGATCCCGCCATTGTCGTTACTTCTGCATCC；横线部分为BamHI酶切位点

②PCR扩增嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽部分(sp)

sp扩增体系：采用50ul的PCR体系：

PCR扩增条件

(4)琼脂糖凝胶电泳，切胶回收SP扩增产物；

(5)KpnI/BamHI对SP扩增产物和连有P43强启动子的pBE2载体进行双酶切，采用50ul酶切体系，37℃酶切3小时；

(6)PCR纯化试剂盒纯化回收酶切产物；

(7)连接上述酶切产物，采用20ul连接体系，16℃连接2小时；

(8)连接产物化学转化法转化大肠杆菌；

①从大肠杆菌DH5 α平板上挑取一个单菌落接于2ml液体LB培养基中，37℃震荡培养过夜，然后将2ml菌液转接到一个含有200ml液体LB培养基中，37℃震荡培养2-3h(此时，OD600≤0.4-0.5，细胞数务必＜108/ml)；

②将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min，然后4℃，4000r/min，离心10min，回收细胞，倒出培养液，将管倒置1min，以便培养液流尽；

③用冰冷的0.1mol/L CaCl210ml悬浮沉淀，立即放在冰上保温30min，然后4℃，4000r/min，离心10min，回收细胞，用冰冷的0.1mol/L CaCl2 2ml悬浮细胞(务必放在冰上)；

④分装细胞，每200ul一份，此细胞为感受态细胞；

⑤取200ul新鲜配置的感受态细胞，加入连接产物2ul，混匀，冰上放置30min，然后将管放置到42℃循环水浴1-2min，然后冰浴2min；

⑥每管加800ul液体LB培养基，37℃震荡培养1h；

⑦将适当体积(100ul)已转化的感受态细胞涂在含有Amp的LB平板上，倒置平板，37℃培养12-16h，观察现象，挑取阳性转化子；

(9)双酶切验证：将上述阳性转化子破碎后，进行KpnI/BamHI双酶切方法验证转化子，6876bp处即为多功能穿梭载体new pBE2。

二、利用该载体构建碱性蛋白酶突变库的方法

(1)根据GeneBank提供的碱性蛋白酶基因序列设计引物Pmp1、Pmp2；

Pmp 1：CGCGGATCCCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCG；酶切位点为BamHI；

Pmp2：ACGCGTCGACTTAGCGTGTTGCCGCTTCTGCATTGAC；酶切位点为SalI.

(2)以Pmp1、Pmp2为引物，利用易错PCR(error-prone PCR)技术，扩增碱性蛋白酶成熟肽部分；

(3)琼脂糖凝胶电泳易错PCR产物，切胶回收目的片段；

(4)BamHI/SalI对易错PCR产物及new pBE2载体进行双酶切；

(5)切胶回收双酶切片段，酶切体系，条件如步骤一中(1)所述；

(6)连接两段双酶切产物，连接体系，条件如步骤一中(2)所述；

(7)连接产物化学转化法转化大肠杆菌，获得大量突变克隆；

(8)B型小量质粒快速提取试剂盒提取突变克隆；

(9)将获得的突变克隆电转化法转化枯草芽孢杆菌WB600；

①挑取一环孢子接于少量生长培养基(LB+0.5M山梨醇)中，过夜培养；

②接种子以1/16的接种量接种于生长培养基中，37℃摇床震荡培养至OD600在0.85-0.95左右；

③冰水浴冷却培养物10min，4℃，8000-10000r/min，离心5min，收集菌体；

④反复用冰冷的电击缓冲液(0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇，10％(v/v)甘油)洗涤细胞收集物4次；

⑤用原培养液1/40体积的电击缓冲液重新悬浮细胞收集物，细胞浓度应该在1-1.3×1010cfu/ml；

⑥感受态细胞分成小份保存在-80℃(不需要液氮预冻)；

⑦转化条件：60ul感受态细胞加入1ul(50ng/ul)连接产物，混匀，并将混合物转移到冰冷的电转杯中，冰浴1-1.5min后，电击1次(25uF，200 Ω，4.5-5.0ms)；

⑧点击完毕后，立即加入1ml复苏培养基(LB+0.5M山梨醇+0.38mol/L甘露醇)，37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布在LB平板上，37℃培养，观察和验证转化子；

(10)高通量筛选：将转化子涂布在含有Kana抗性的牛奶LB平板上，平板上产蛋白降解圈的菌落为含有功能的突变子；

选择碱性蛋白酶活性高的或有新功能的突变体作为下一轮易错PCR的模板，重复上述步骤，进行多轮易错PCR和高通量筛选，直到获得理想的突变体。

Claims (9)

1.一种多功能穿梭载体new pBE2，其特征在于：其结构包括：LB-P43-KpnI-SP-MCS-RB。

2.根据权利要求1所述的多功能穿梭载体new pBE2，其特征在于：所述LB、RB为左、右臂，是pBE2经EcoRI/KpnI双酶切酶切获得的大片段的两端。

3.根据权利要求1所述的多功能穿梭载体new pBE2，其特征在于：所述P43为序列1的强启动子，SP为序列2的嗜碱芽孢杆菌信号肽加前肽部分，KpnI代表酶切位点。

4.根据权利要求1所述的多功能穿梭载体new pBE2，其特征在于：所述MCS为序列3的多克隆位点上游到下游的顺序分别是：BamHI、Xbal、SalI、PstI、SphI、HindIII酶切位点。

5.根据权利要求1所述的多功能穿梭载体new pBE2，其特征在于：所述LB-P43-SP-MCS-RB为环状，总长度为6876bp。

6.根据权利要求1或3所述的多功能穿梭载体new pBE2的构建方法，其特征在于：所述P43强启动子来自于pWB980载体。

7.一种如权利要求1所述的多功能穿梭载体new pBE2的构建方法，其特征在于：构建方法的步骤为：

(1)双酶切方法获得P43强启动子和pBE2载体大片段；

(2)利用PCR技术获得SP的扩增产物，并引入BamHI酶切位点；

(3)将P43强启动子、SP的扩增产物按顺序依次连入pBE2载体大片段；

(4)连接产物转化大肠杆菌，培养后挑取阳性转化子；

(5)双酶切验证。

8.根据权利要求7所述的多功能穿梭载体new pBE2的构建方法，其特征在于：所述P43强启动子来自于pWB980载体。

9.一种利用如权利要求1所述的多功能穿梭载体new pBE2构建碱性蛋白酶突变库的方法，其特征在于：构建的步骤如下：

(1)随机突变碱性蛋白酶成熟肽基因：据GeneBank报道的嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶的基因序列设计引物，以嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因为模板，利用易错PCR技术进行扩增得到成熟肽片段；

(2)将易错PCR扩增得到的成熟肽片段连入new pBE2；

(3)突变基因的克隆：步骤(2)的连接产物转化大肠杆菌，获得阳性克隆；

(4)高通量筛选：提取大肠杆菌中的阳性克隆，转化到枯草芽孢杆菌WB600中，通过高通量筛选获得符合要求的蛋白突变株；

(5)以步骤(4)中获得的功能有所改进菌株的碱性蛋白酶成熟肽基因作为下一轮易错PCR的模板，重复上述步骤，进行多轮易错PCR和高通量筛选，直到获得理想的突变菌株。

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