CN107760705B - 一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用，所述穿梭质粒载体是将枯草芽孢杆菌质粒pWB980线性化后插入到载体pMD19‑T Simple Vector中构建而成。本发明提供的穿梭载体质粒可在大肠杆菌和多粘类芽孢杆菌中复制。多粘类芽孢杆菌中遗传操作体系尚不成熟、转化步骤较繁琐，且其转化效率相对较低，而大肠杆菌中基因克隆操作十分便利。利用该质粒载体在大肠杆菌中完成外源基因克隆和重组质粒构建工作，便于多粘类芽胞杆菌中开展相关基因功能研究和遗传育种工作，转化率可达7.83±1.54×10⁵CFU/ug DNA。

Description

一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用

(一)技术领域

本发明涉及一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用。

(二)背景技术

多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是杆状、产芽孢的革兰氏阳性细菌，多分离自植物根际土壤。近年来，由于其显著的植物促生功效和抑菌效果，被普遍认为是一种植物根际促生菌。多粘类芽孢杆菌能产生多种抑制细菌和真菌生长的拮抗物质，如多粘菌素、环杆菌素、乔利肽菌素、多肽菌素、谷缬菌素和杀镰孢菌素等多种抗生素，而且由于某些抗生素的合成方式属于非核糖体肽合成酶合成，这更加吸引了越来越多研究者的关注。

质粒pWB980是Wu等于1999年基于pUB110改造构建而得的枯草芽孢杆菌表达载体，该质粒具有P43强组成型启动子和改造了的果聚糖蔗糖酶信号肽，在枯草芽孢杆菌中复制且赋予宿主卡那霉素抗性，该载体自构建后被成功应用于多种功能基因的分泌表达。多粘类芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌亲缘关系较近，质粒pWB980可在多粘类芽孢杆菌中复制表达。

目前，多粘类芽孢杆菌存在转化效率低和遗传操作体系稳定性差等问题，尚难通过遗传学和分子生物学技术手段提高多粘类芽孢杆菌中有用物质的产量。

pWB980是枯草芽孢杆菌基因表达载体，也可在多粘类芽孢杆菌中复制，但多粘类芽孢杆菌的转化步骤较繁琐，且其转化效率相对较低。大肠杆菌中基因克隆操作十分便利。构建一种能够在大肠杆菌和多粘类芽孢杆菌之间进行稳定遗传的穿梭载体，可首先在大肠杆菌中完成外源基因克隆工作，从而极大提高了外源基因导入多粘类芽孢杆菌的效率，便于多粘类芽孢杆菌中开展相关遗传操作工作。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种穿梭质粒载体，以解决上述多粘类芽孢杆菌中外源基因导入困难的技术问题。本发明的另一个目的在于提供上述穿梭质粒载体的构建方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种穿梭质粒载体，所述穿梭质粒载体是将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)质粒pWB980线性化后插入到载体pMD19-T Simple Vector(核苷酸序列为SEQIDNO.5所示)中构建而成。

进一步，所述质粒pWB980包括位于3254～3460的P43启动子位点、位于3616～3702的信号肽编码基因sacB及位于308～1313的Rep、位于1472～2243的卡那霉素抗性基因km^r、位于2461～2865的筛选标记博来霉素抗性基因ble^r。

进一步，所述载体pMD19-T Simple Vector包括位于873～1461的复制起始ori、位于146～475的lacZ基因以及位于1632～2492的筛选标记氨苄青霉素抗性基因amp^r。

进一步，所述穿梭质粒载体核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明所述穿梭质粒载体的构建方法，包括以下步骤：

1)以枯草芽孢杆菌中高拷贝质粒pWB980为模板，通过引物P1(核苷酸序列如SEQID NO.3所示)和P2(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)进行PCR，得到线性化的pWB980质粒(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，纯化后回收；

2)用T4连接酶将纯化回收后的线性化pWB980质粒和载体pMD19-T Simple Vector进行连接；

3)将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，挑取转化子，提取质粒，对其进行单、双酶切验证，得到所述的穿梭质粒载体pWBUC01。

本发明还提供一种所述穿梭质粒载体在筛选多粘类芽孢杆菌标记抗性基因构中的应用。

本发明所述标记抗性基因筛选是将标记抗性基因连入穿梭质粒载体，然后再将载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，最后将阳性转化子转入多粘类芽孢杆菌，获得具有标记抗性基因的多粘类芽孢杆菌。

本发明还提供一种所述穿梭质粒载体在多粘类芽孢杆菌基因敲除中的应用。

本发明所述基因敲除是将标记抗性基因、待敲除基因的同源序列连入穿梭质粒载体，然后再将载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，最后将阳性转化子转入多粘类芽孢杆菌，获得敲除目标基因的多粘类芽孢杆菌。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供的穿梭载体质粒可在大肠杆菌和多粘类芽孢杆菌中复制。多粘类芽孢杆菌中遗传操作体系尚不成熟、转化步骤较繁琐，且其转化效率相对较低，而大肠杆菌中基因克隆操作十分便利。利用该质粒载体在大肠杆菌中完成外源基因克隆和重组质粒构建工作，便于多粘类芽胞杆菌中开展相关基因功能研究和遗传育种工作，转化率可达7.83±1.54×10⁵CFU/ug DNA。

(四)附图说明

图1为穿梭质粒载体pWBUC01图谱。

图2为穿梭载体pWBUC01构建示意图。

图3为质粒pWB980经PCR线性化后的凝胶电泳图。

图4为实施例1转化E.coli DH5α后提取的穿梭质粒pWBUC01单、双酶切鉴定电泳图。

图5为实施例2转化枯草芽孢杆菌WB8000后提取的穿梭质粒pWBUC01的双酶切鉴定电泳图。

图6为实施例2转化多粘类芽孢杆菌ATCC 842后提取的穿梭质粒pWBUC01的双酶切鉴定电泳图。

图7为cat基因PCR电泳图。

图8为cat基因、质粒pWBUC01双酶切电泳图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pWBUC01的构建

张文娣等(张文娣，丁延芹，姚良同等,多粘类芽孢杆菌SC2基因敲除体系的建立[J].微生物学报.2013,53(12):1258-1266.)报道B.subtilis的质粒可在P.polymyxa中复制表达，因此取B.subtilis质粒pHT43、pWB980、pNNB194对P.polymyxa ATCC842的适用性进行了尝试(表1)，结果发现只有质粒pWB980可在P.polymyxa ATCC842中复制表达，转化效率为8.58±1.43×10⁶(cfu/μg DNA)，因此选择pWB980作为插入片段。

表1B.subtilis质粒在P.polymyxa中复制表达情况

pMD19-T Simple Vector是一种高效克隆PCR(TA Cloning)的专用载体，它消除了pUC19载体上的多克隆酶切位点，因此，构建好的穿梭质粒载体将不会受到T载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响，可以大大提高酶切效率。

穿梭载体pWBUC01构建过程如图2所示，包括以下步骤：

1、质粒pWB980的提取

挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB800，参见Functional Productionand Characterization of a Fibrin-Specific Single-Chain Antibody Fragment fromBacillus subtilis:Effects of Molecular Chaperones and a Wall-Bound Proteaseon Antibody Fragment Production)WB800单菌落，接种于5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h。菌液用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提质粒pWB980，-20℃储存待用。

2、质粒pWB980线性化

以质粒pWB980为模板，通过设定引物(P1和P2)进行PCR，使环状质粒pWB980线性化。

P1:ATCCTCTAGAGTCGACCTGCAG(SEQ ID NO.3)

P2:CTGCAGGTCGACTCTAGAGGAT(SEQ ID NO.4)

表2PCR的具体条件

EasyTaq DNA Polymerase Buffer	5μL
		dNTPs	5μL
引物P1	2.5μL
		引物P2	2.5μL
模板(质粒pWB980)	2μL
		EasyTaq DNA Polymerase	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	32.5μL
		Total	50μL

反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃4.5min，30循环；72℃延伸10min；4℃保存。

PCR扩增后的产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图3所示。电泳结果在理论值大小位置出现了单一的特异性条带，用DNA Fragment Purification Kit(Sangon BiotechCo.,Ltd)对其进行纯化回收。

3、大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pWBUC01的构建

将步骤2中线性化质粒pWB980和载体pMD19-T Simple Vector(购自TaKaRa公司)进行连接，反应体系为：

表3

16℃过夜连接，取2.5μL连接产物转化50μL E.coli DH5α感受态细胞，取100μL菌液涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行蓝白斑筛选。挑取阳性转化子，转入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养12h-18h，用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(Sangon Biotech Co.,Ltd)提取质粒，获得大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pWBUC01，即穿梭质粒载体pWBUC01。通过Hind III和EcoR I(NEB)进行单、双酶切验证(如图4)，确定重组质粒后进行测序分析(华大基因)。序列分析结果如SEQ ID NO.1，绘制载体图谱如图1所示。

其中，线性化质粒pWB980及pMD19-T Simple Vector的摩尔浓度比控制在1:3到1:10。

实施例2大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭质粒载体pWBUC01的应用

1、大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pWBUC01转化枯草芽孢杆菌WB800

将实施例1构建得到的穿梭载体pWBUC01转化枯草芽孢杆菌WB800，具体的，包括以下步骤：

A、枯草芽孢杆菌WB800感受态的制备

1)、挑取新鲜的枯草芽胞杆菌WB800单菌落接种于5mL LB液体试管中，37℃，200r/min培养过夜。

2)、菌液按5％(v/v)接种量接入50mL含0.5mol/L山梨醇的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养至OD₆₀₀为2左右，取全部菌液冰浴30min，5000r/min，4℃离心6min，收集菌体。

3)、用10mL预冷的Solution A(0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L的甘露醇，10％甘油，溶于去离子水中)重悬菌体，5000r/min，4℃离心8min，去上清(尽量除尽上清)，如此漂洗3次。

4)、30mL预冷的Solution B(0.5mol/L海藻糖，0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇，10％甘油，溶于去离子水中)洗涤菌体一次，8000r/min，4℃离心5min，去上清(尽量除尽上清)。

5)、500μL Solution B悬浮菌体，即为枯草芽孢杆菌WB800电转感受态细胞，分装成50μL每管，-80℃保存，待用。

B、穿梭质粒载体pWBUC01转化枯草芽胞杆菌WB800感受态细胞

1)、电转化：将2μL实施例1制备的穿梭质粒载体pWBUC01与步骤A制备的50μL枯草芽孢杆菌WB800电转感受态细胞轻柔混合，冰浴30min，将混合物转入预冷的1mm电击杯中，2000V电击一次，之后迅速加入1mL预冷的复苏液(含0.5mol/L山梨醇和0.38mol/L甘露醇的LB液体培养基)，37℃，200r/min培养3h。

2)、取100μL菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养12h。

3)、挑取阳性转化子，转入5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养12h，用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，通过Hind III和EcoR I进行双酶切验证(如图5)，结果证明的确是质粒pWBUC01。说明构建的大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pWBUC01能够在枯草芽孢杆菌WB800中复制表达。

2、大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pWBUC01转化多粘类芽孢杆菌ATCC842

将实施例1构建得到的穿梭质粒载体pWBUC01转化多粘类芽孢杆菌ATCC 842，具体的，包括以下步骤：

A、多粘类芽孢杆菌ATCC 842感受态的制备

1)、挑取新鲜的多粘类芽孢杆菌ATCC 842(P.polymyxa ATCC 842菌种保藏号：BUCSAV 162,CCM 1459,NCIB 8158,NCTC 10343,NRS 1105，Reclassification ofPaenibacillus durum(Formerly Clostridium durum Smith and Cat0 1974)Collins etal.1994as a Member of the Species P.azotojixans(Formerly Bacillus azotojixaSeldin et al.1984)Ash et al.1994)单菌落接种于5mL LB液体试管中，37℃，200r/min培养过夜。

2)、菌液按4％(v/v)接种量接入50mL含0.5mol/L山梨醇的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养至OD₆₀₀为0.5左右，取全部菌液冰浴10min，5000r/min，4℃离心5min，收集菌体。

3)、100mL预冷的Solution A(0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L的甘露醇，10％甘油，溶于去离子水中)重悬菌体3次，5000r/min，4℃离心8min，去上清(尽量除尽上清)。

4)、30mL预冷的Solution B(0.5mol/L海藻糖，0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇，10％甘油，溶于去离子水中)洗涤菌体一次，8000r/min，4℃离心5min，去上清(尽量除尽上清)。

5)、1mL Solution B悬浮菌体，获得多粘类芽孢杆菌ATCC 842感受态细胞，分装成50μL每管，-80℃保存，待用。

B、穿梭质粒载体pWBUC01转化多粘类芽孢杆菌ATCC 842感受态细胞

1)、电转化：将2μL实施例1制备的穿梭质粒载体pWBUC01与50μL多粘类芽孢杆菌ATCC 842感受态细胞轻柔混合，冰浴30min，将混合物转入预冷的1mm电击杯中，2000V电击一次，之后迅速加入1mL预冷的复苏液(含0.5mol/L山梨醇和0.38mol/L甘露醇的LB液体培养基)中，37℃，200r/min培养4h。

2)、取100μL菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养24h。

3)、挑取阳性转化子，转入5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h，用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，通过Hind III和EcoR I进行双酶切验证(如图6)，结果证明的确是质粒pWBUC01。说明构建的大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pWBUC01能够在多粘类芽孢杆菌ATCC 842中复制表达。

3.利用上述实施例1制备的穿梭质粒载体pWBUC01进行外源基因在多粘类芽孢杆菌中的表达

将实施例1构建得到的穿梭质粒载体pWBUC01连接外源基因，并在多粘类芽孢杆菌ATCC 842中表达，具体的，包括以下步骤：

1)、以Cat-F和Cat-R为引物，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，以枯草芽孢杆菌WB800基因组DNA为模板，PCR扩增枯草芽孢杆菌WB800中氯霉素抗性基因cat，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

表4 PCR的具体条件为：

EasyTaq DNA Polymerase Buffer	5μL
		dNTPs	5μL
引物Cat-F	2.5μL
		引物Cat-R	2.5μL
模板(枯草芽孢杆菌WB800基因组DNA)	2μL
		EasyTaq DNA Polymerase	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	32.5μL
		Total	50μL

反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃4.5min，30循环；72℃延伸10min；4℃保存。

PCR扩增后的产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，如附图7所示。

2)、用DNA Fragment Purification Kit(TaKaRa)对cat基因PCR产物进行纯化回收。

3)、用Bam HI和Xba I对cat基因纯化产物和实施例1制备的穿梭质粒载体pWBUC01进行双酶切，酶切体系为：

表5

Bam HI	1μL
		Xba I	1μL
Buffer	5μL
		DNA	1μL
ddH<sub>2</sub>O	42μL
		Total	50μL

4)、酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图8所示，用Easy Pure Quick GelExtraction Kit(TRAN)对其进行切胶回收。

5)、将回收后的cat基因和质粒pWBUC01进行连接，16℃过夜，反应体系为:

表6

T4DNA连接酶Buffer	1μL
		片段：cat	2μL
载体：pWBUC01	6μL
		T4DNA连接酶(NEB)	1μL
Total	10μL

6)、取10μL连接液，加入到100μL感受态细胞Trans 110(TransGen Biotech)中，轻弹管壁数下混匀，冰上放置30min；42℃热激90s，冰浴2min；加900μL LB，37℃，200rpm，摇菌1h；取100μL菌液涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养。

7)、随机挑取转化子进行菌落PCR后验证为阳性转化子，进行测序分析(华大基因)。序列分析结果如SEQ ID NO.9所示，质粒命名为pWBUC01-cat。

8)、用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒pWBUC01-cat，用实施例2步骤1中方法转化多粘类芽孢杆菌P.polymyxa ATCC842，取100μL菌液涂布含有5μg/mL氯霉素的LB平板，37℃过夜培养。

9)、挑取转化子菌落PCR后验证其为阳性转化子。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6525

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt agaactcggt acgcgcggat 420

cttccagaga ttatcctcta gagtcgacct gcagatcctc tagagtcgac ctgcaggcat 480

gcaagctagc ttcagcacaa ttccaagaaa aacacgattt agaacctaaa aagaacgaat 540

ttgaactaac tcataaccga gaggtaaaaa aagaacgaag tcgagatcag ggaatgagtt 600

tataaaataa aaaaagcacc tgaaaaggtg tctttttttg atggttttga acttgttctt 660

tcttatcttg atacatatag aaataacgtc atttttattt tagttgctga aaggtgcgtt 720

gaagtgttgg tatgtatgtg ttttaaagta ttgaaaaccc ttaaaattgg ttgcacagaa 780

aaaccccatc tgttaaagtt ataagtgact aaacaaataa ctaaatagat gggggtttct 840

tttaatatta tgtgtcctaa tagtagcatt tattcagatg aaaaatcaag ggttttagtg 900

gacaagacaa aaagtggaaa agtgagacca tggagagaaa agaaaatcgc taatgttgat 960

tactttgaac ttctgcatat tcttgaattt aaaaaggctg aaagagtaaa agattgtgct 1020

gaaatattag agtataaaca aaatcgtgaa acaggcgaaa gaaagttgta tcgagtgtgg 1080

ttttgtaaat ccaggctttg tccaatgtgc aactggagga gagcaatgaa acatggcatt 1140

cagtcacaaa aggttgttgc tgaagttatt aaacaaaagc caacagttcg ttggttgttt 1200

ctcacattaa cagttaaaaa tgtttatgat ggcgaagaat taaataagag tttgtcagat 1260

atggctcaag gatttcgccg aatgatgcaa tataaaaaaa ttaataaaaa tcttgttggt 1320

tttatgcgtg caacggaagt gacaataaat aataaagata attcttataa tcagcacatg 1380

catgtattgg tatgtgtgga accaacttat tttaagaata cagaaaacta cgtgaatcaa 1440

aaacaatgga ttcaattttg gaaaaaggca atgaaattag actatgatcc aaatgtaaaa 1500

gttcaaatga ttcgaccgaa aaataaatat aaatcggata tacaatcggc aattgacgaa 1560

actgcaaaat atcctgtaaa ggatacggat tttatgaccg atgatgaaga aaagaatttg 1620

aaacgtttgt ctgatttgga ggaaggttta caccgtaaaa ggttaatctc ctatggtggt 1680

ttgttaaaag aaatacataa aaaattaaac cttgatgaca cagaagaagg cgatttgatt 1740

catacagatg atgacgaaaa agccgatgaa gatggatttt ctattattgc aatgtggaat 1800

tgggaacgga aaaattattt tattaaagag tagttcaaca aacgggccag tttgttgaag 1860

attagatgct ataattgtta ttaaaaggat tgaaggatgc ttaggaagac gagttattaa 1920

tagctgaata agaacggtgc tctccaaata ttcttattta gaaaagcaaa tctaaaatta 1980

tctgaaaagg gaatgagaat agtgaatgga ccaataataa tgactagaga agaaagaatg 2040

aagattgttc atgaaattaa ggaacgaata ttggataaat atggggatga tgttaaggct 2100

attggtgttt atggctctct tggtcgtcag actgatgggc cctattcgga tattgagatg 2160

atgtgtgtca tgtcaacaga ggaagcagag ttcagccatg aatggacaac cggtgagtgg 2220

aaggtggaag tgaattttga tagcgaagag attctactag attatgcatc tcaggtggaa 2280

tcagattggc cgcttacaca tggtcaattt ttctctattt tgccgattta tgattcaggt 2340

ggatacttag agaaagtgta tcaaactgct aaatcggtag aagcccaaac gttccacgat 2400

gcgatttgtg cccttatcgt agaagagctg tttgaatatg caggcaaatg gcgtaatatt 2460

cgtgtgcaag gaccgacaac atttctacca tccttgactg tacaggtagc aatggcaggt 2520

gccatgttga ttggtctgca tcatcgcatc tgttatacga cgagcgcttc ggtcttaact 2580

gaagcagtta agcaatcaga tcttccttca ggttatgacc atctgtgcca gttcgtaatg 2640

tctggtcaac tttccgactc tgagaaactt ctggaatcgc tagagaattt ctggaatggg 2700

attcaggagt ggacagaacg acacggatat atagtggatg tgtcaaaacg cataccattt 2760

tgaacgatga cctctaataa ttgttaatca tgttggttac gtatttatta acttctccta 2820

gtattagtaa ttatcatggc tgtcatggcg cattaacgga ataaagggtg tgcttaaatc 2880

gggccatttt gcgtaataag aaaaaggatt aattatgagc gaattgaatt aataataagg 2940

taatagattt acattagaaa atgaaagggg attttatgcg tgagaatgtt acagtctatc 3000

ccggcattgc cagtcgggga tattaaaaag agtataggtt tttattgcga taaactaggt 3060

ttcactttgg ttcaccatga agatggattc gcagttctaa tgtgtaatga ggttcggatt 3120

catctatggg aggcaagtga tgaaggctgg cgctctcgta gtaatgattc accggtttgt 3180

acaggtgcgg agtcgtttat tgctggtact gctagttgcc gcattgaagt agagggaatt 3240

gatgaattat atcaacatat taagcctttg ggcattttgc accccaatac atcattaaaa 3300

gatcagtggt gggatgaacg agactttgca gtaattgatc ccgacaacaa tttgattagc 3360

ttttttcaac aaataaaaag ctaaaatcta ttattaatct gttcagcaat cgggcgcgat 3420

tgctgaataa aagatacgag agacctctct tgtatctttt ttattttgag tggttttgtc 3480

cgttacacta gaaaaccgaa agacaataaa aattttattc ttgctgagtc tggctttcgg 3540

taagctagac aaaacggaca aaataaaaat tggcaagggt ttaaaggtgg agattttttg 3600

agtgatcttc tcaaaaaata ctacctgtcc cttgctgatt tttaaacgag cacgagagca 3660

aaacccccct ttgctgaggt ggcagagggc aggttttttt gtttcttttt tctcgtaaaa 3720

aaaagaaagg tcttaaaggt tttatggttt tggtcggcac tgaattcgag ctcagcatta 3780

ttgagtggat gattatattc cttttgatag gtggtatgtt ttcgcttgaa cttttaaata 3840

cagccattga acatacggtt gatttaataa ctgacaaaca tcaccctctt gctaaagcgg 3900

ccaaggacgc tgccgccggg gctgtttgcg tttttgccgt gatttcgtgt atcattggtt 3960

tacttatttt tttgccaaag ctgtaatggc tgaaaattct tacatttatt ttacattttt 4020

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acagccattg aacatacggt tgatttaata actgacaaac atcaccctct tgctaaagcg 3900

gccaaggacg ctgccgccgg ggctgtttgc gtttttgccg tgatttcgtg tatcattggt 3960

ttacttattt ttttgccaaa gctgtaatgg ctgaaaattc ttacatttat tttacatttt 4020

tagaaatggg cgtgaaaaaa agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagtgat agcggtacca 4080

ggagggctgg aagaagcaga ccgctaacac agtacataaa aaaggagaca tgaacgatga 4140

acatcaaaaa gtttgcaaaa caagcaacag tattaacctt tactaccgca ctgctggcag 4200

gaggcgcaac tcaagctttt gcctcgagct cggtacccgg gtatccatga actttaataa 4260

aattgattta gacaattgga agagaaaaga gatatttaat cattatttga accaacaaac 4320

gacttttagt ataaccacag aaattgatat tagtgtttta taccgaaaca taaaacaaga 4380

aggatataaa ttttaccctg catttatttt cttagtgaca agggtgataa actcaaatac 4440

agcttttaga actggttaca atagcgacgg agagttaggt tattgggata agttagagcc 4500

actttataca atttttgatg gtgtatctaa aacattctct ggtatttgga ctcctgtaaa 4560

gaatgacttc aaagagtttt atgatttata cctttctgat gtagagaaat ataatggttc 4620

ggggaaattg tttcccaaaa cacctatacc tgaaaatgct ttttctcttt ctattattcc 4680

atggacttca tttactgggt ttaacttaaa tatcaataat aatagtaatt accttctacc 4740

cattattaca gcaggaaaat tcattaataa aggtaattca atatatttac cgctatcttt 4800

acaggtacat cattctgttt gtgatggtta tcatgcagga ttgtttatga actctattca 4860

ggaattgtca gataggccta atgactggct tttataatct agagtcgacc tgcagaatcg 4920

tcgaacggca ggcgtgcaaa cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 4980

tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 5040

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 5100

tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 5160

ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 5220

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 5280

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 5340

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 5400

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ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 5520

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gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 5640

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 5700

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 5760

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 5820

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 5880

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 5940

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 6000

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 6060

taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 6120

caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 6180

gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 6240

gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 6300

ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 6360

attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 6420

gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 6480

tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 6540

agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 6600

gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 6660

actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 6720

tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 6780

attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 6840

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 6900

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 6960

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 7020

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat gggggttccg 7080

cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 7140

acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 7177

Claims (3)

1.一种穿梭质粒载体，其特征在于所述穿梭质粒载体是将枯草芽孢杆菌质粒pWB980线性化后插入到载体pMD19-T Simple Vector中构建而成，所述穿梭质粒载体核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述穿梭质粒载体在多粘类芽孢杆菌外源基因表达中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述外源基因表达是将外源基因连入穿梭质粒载体，转入多粘类芽孢杆菌ATCC 842，获得表达外源基因的多粘类芽孢杆菌。

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