CN105274141B - 一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体及制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体及制备方法和用途。将本发明提供的载体pTol2(UAS:Cas9)导入单细胞期斑马鱼胚胎，获得的Tg(UAS:Cas9)品系与Tg(kop: KalTA4品系)雌鱼杂交后，获得的杂交胚胎能够在斑马鱼原始生殖细胞中高效、特异、持续表达Cas9基因。在制备突变品系时，以Tg(UAS:Cas9)雄鱼与Tg(kop:KalTA4)雌鱼杂交胚胎作为受体胚胎，直接注射靶向基因的gRNA后，能够有效减少体细胞突变，从而增加注射的P0代胚胎的成活率，同时P0代成鱼能够有效的传递突变，具有广泛应用前景。

Description

一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体及制备方法和 用途

技术领域

本发明属于鱼类生物工程技术领域，具体涉及一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体及制备方法和用途。

背景技术

基因编辑技术是揭示基因功能的重要研究工具(Esvelt,K.M.and Wang,H.H.(2013).Genome-scale engineering for systems and synthetic biology.Mol SystBiol 9,641.)。近年来，相继出现的基于核酸内切酶的基因组编辑技术，如：锌指核糖核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFNs)(Bibikova,M.,Beumer,K.,Trautman,J.K.andCarroll,D.(2003).Enhancing gene targeting with designed zinc fingernucleases.Science 300,764.)，转录激活因子样效应物核酸酶(Transcriptionactivator like effector nucleases,TALENs)(Bedell,V.M.,Wang,Y.,Campbell,J.M.,Poshusta,T.L.,Starker,C.G.,Krug,R.G.,2nd,Tan,W.,Penheiter,S.G.,Ma,A.C.,Leung,A.Y.et al.(2012).In vivo genome editing using a high-efficiency TALENsystem.Nature 491,114-8.)和Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9系统(Liu,D.,Wang,Z.,Xiao,A.,Zhang,Y.,Li,W.,Zu,Y.,Yao,S.,Lin,S.and Zhang,B.(2014).Efficient gene targeting inzebrafish mediated by a zebrafish-codon-optimized cas9 and evaluation of off-targeting effect.J Genet Genomics 41,43-6.)，彻底革新了可遗传的定点基因功能缺失研究。与ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas9系统效率高，而且更容易操作，已成为构建基因敲除动物模型的主要技术。CRISPR/Cas9系统是利用能够特异识别DNA序列的RNA(guideRNA,gRNA)引导核酸内切酶Cas9在基因组的特定位点引入DNA双链断裂，然后细胞的非同源末端修复机制在靶点序列产生随机增减或移码突变，从而达到特异改变靶点遗传信息的目的。

在利用CRISPR/Cas9系统制备突变斑马鱼的研究中，研究者们普遍使用体外转录的方法合成核酸内切酶Cas9 mRNA，然后将Cas9 mRNA注射到斑马鱼胚胎中产生Cas9蛋白。然而目前体外转录技术对实验员的操作技能要求较高，否则会面临合成不出来，或者合成的浓度太低，或者合成的Cas9 mRNA存在降解等问题。并且，体外转录出的Cas9 mRNA在长期保存过程中，以及每次使用时反复冻存，都会影响保存的Cas9 mRNA的质量。除了耗时耗力，体外转录的试剂盒往往比较昂贵。如果建立表达Cas9的斑马鱼转基因品系，就能直接以该品系胚胎为受体，利用胚胎自身表达的Cas9产生切割作用。然而在鱼类中缺乏稳定表达Cas9的品系。

另外，在利用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除时，注射靶基因的gRNA和Cas9 mRNA后，体细胞的高效突变可以在P0代胚胎中就能进行表型分析(Liu,D.,Wang,Z.,Xiao,A.,Zhang,Y.,Li,W.,Zu,Y.,Yao,S.,Lin,S.and Zhang,B.(2014).Efficient gene targetingin zebrafish mediated by a zebrafish-codon-optimized cas9 and evaluation ofoff-targeting effect.J Genet Genomics 41,43-6.)。然而，如果靶基因是胚胎早期发育必需基因，体细胞的高效突变也将导致胚胎死亡。例如当我们尝试在斑马鱼中制备tcf7l1a基因的突变体时，用较高浓度的tcf7l1a-gRNA和Cas9 mRNA注射到胚胎后，85％的胚胎产生严重畸形不能存活下去，而存活的胚胎往往不携带需要的移码突变。如果降低注射剂量以减少突变，虽能减少体细胞的突变使胚胎存活，但也会导致生殖细胞的突变降低，增加后续筛选的难度。因此，对于研制胚胎发育早期的必需基因突变品系，有必要减少体细胞突变以提高胚胎存活率，同时增加生殖细胞突变率以增加突变向后代传递的效率。

成体的生殖细胞都是由胚胎发育早期形成的原始生殖细胞(primordial germcells,PGC)发育而来(Braat,A.K.,Speksnijder,J.E.and Zivkovic,D.(1999).Germ linedevelopment in fishes.Int J Dev Biol 43,745-60.)。因此，PGC是胚胎发育阶段唯一能将遗传信息递给子代的细胞类群。作为遗传物质的传递者，鱼类PGC细胞因在早期就能被标记、除去、分离、具有全能性等特点，已成为了鱼类生物工程技术的良好遗传操作对象(Yoshizaki,G.,Takeuchi,Y.and Okutsu,T.(2007)."Germ cell in fish:basic biologyand biotechnological applications".Tanpakushitsu Kakusan Koso 52,2067-72.)。如果在胚胎时期特异性提高CRISPR/Cas9系统在PGC中的突变率，就能减少体细胞突变，从而应用于胚胎早期发育必需基因突变体的制备。另外，增加亲代PGC的突变率，即生殖细胞突变率，就能增加子代中突变比例，从而降低制备突变品系过程中筛选突变子代的工作量。

在我们之前的研究中，利用转录水平的Gal4/UAS转录激活系统，以mRFP作为报告基因，实现斑马鱼PGC中高效、特异、持续的基因诱导表达调控技术(Xiong,F.,Wei,Z.Q.,Zhu,Z.Y.and Sun,Y.H.(2013).Targeted expression in zebrafish primordial germcells by Cre/loxP and Gal4/UAS systems.Mar Biotechnol(NY)15,526-39.)。为了特异性提高CRISPR/Cas9系统在生殖细胞中的突变率，本发明在我们之前建立的PGC特异表达KalTA4转录激活因子的转基因斑马鱼品系Tg(kop:KalTA4)基础上，以Cas9蛋白作为效应品系的报告基因，在斑马鱼中建立原始生殖细胞中高效、特异、持续诱导Cas9表达的转基因品系。首先，构建UAS和nanos3 3’UTR调控Cas9表达的转基因载体pTol2(UAS:Cas9)；其次，建立效应转基因品系Tg(UAS:Cas9)。在效应品系中，Cas9是沉默的。当Tg(kop:KalTA4)品系雌鱼与Tg(UAS:Cas9)品系雄鱼杂交后，KalTA4转录激活因子就能诱导Cas9在杂交胚胎原始生殖细胞中高效、特异、持续地表达，从而在斑马鱼中建立原始生殖细胞特异表达Cas9的转基因品系。最后，我们利用该品系的胚胎可以制备出早期发育必需基因的突变品系。同时，该品系的建立也能节约体外合成Cas9 mRNA的花费和工作量。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体：pTol2(UAS:Cas9)，其序列为SEQ ID NO.1所示。该转基因载体包含受UAS和nanos3 3’UTR调控Cas9的表达框序列，并在Cas9起始密码子前引入了Kozak序列，用于增强转基因的表达；该表达框位于Tol2转座子的左右臂序列中，以便可以使用Tol2转座子系统制备转基因鱼，提高转基因的整合效率。

本发明的另一个目的是在于提供了一种受UAS和nanos3 3’UTR调控Cas9表达的转基因斑马鱼品系Tg(UAS:Cas9)的制备方法。通过将转基因载体pTol2(UAS:Cas9)与Tol2转座酶mRNA导入斑马鱼受精卵中，转基因鱼性成熟后，与野生型的雌鱼杂交，筛选出转基因阳性的子代，即建立Tg(UAS:Cas9)转基因斑马鱼品系。

本发明的最后一个目的是在于提供了一种转基因斑马鱼品系Tg(UAS:Cas9)或pTol2(UAS:Cas9)在制备鱼突变品系中的应用。首先将目的基因有效的gRNA注射到Tg(kop:KalTA4)(Xiong,F.,Wei,Z.Q.,Zhu,Z.Y.and Sun,Y.H.(2013).Targeted expression inzebrafish primordial germ cells by Cre/loxP and Gal4/UAS systems.MarBiotechnol(NY)15,526-39.)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)雄鱼杂交胚胎中建立P0代，然后通过逐代的筛选，获得能稳定遗传的目的基因的突变品系。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下技术措施：

一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体：pTol2(UAS:Cas9)，其序列为SEQID NO.1所示。

转基因载体pTol2(UAS:Cas9)构建方法，包括下述步骤：

1)重组基因片段的获得：

以UAS_F和UAS_R引物对UAS序列进行扩增获得UAS；以Cas9_F和Cas9_R引物对Cas9编码区进行扩增获得Cas9编码区；以nos_F和nos_R引物对nanos3 3’UTR序列进行扩增获得nanos3 3’UTR；以UAS，Cas9编码区和nanos3 3’UTR，这3个DNA片段共同为模板，以UAS_F和nos_R为引物，PCR扩增出由UAS，Cas9编码区和nanos3 3’UTR这3段DNA分子片段拼接成的重组基因片段，即UAS:Cas9-UTRnos3表达框序列。

UAS_F:TAAACGCGTACTTAGATCTAACTGCAGCGGAGTACT；

UAS_R:CTTGTAATCCATGGTGGCGAATTCGTGTGGAGGA。

Cas9_F:CACGAATTCGCCACCATGGATTACAAGGACCACGAC；

Cas9_R:CAATGTCCGCTCCGGATCATTTCTTCTTTTTGGCCTGACC。

nos_F:GAAGAAATGATCCGGAGCGGACATTGATGCTCCGG；

nos_R:TTTCTCGAGCGTTAAGTCTAGAGAAAATGTTTAT。

2)在商业载体pMD18-T(TaKaRa公司)质粒基础上，人工合成包含Tol2转座子序列左臂和右臂的载体pTol2-MCS，其序列为SEQ ID NO.2所示。

3)将获得的重组基因片段及载体pTol2-MCS连接成转基因载体pTol2(UAS:Cas9)。

将UAS:Cas9-UTRnos3表达框序列及人工合成的载体pTol2-MCS(SEQ ID NO.2所示)用MluI和XhoI双酶切连接后即得转基因载体pTol2(UAS:Cas9)，其序列为SEQ ID NO:1所示。

一种转基因斑马鱼Tg(UAS:Cas9)品系的制备方法，包括将转基因载体pTol2(UAS:Cas9)，显微注射的方式将其导入单细胞期斑马鱼胚胎，将检测阳性个体的P0代与野生型斑马鱼侧交繁殖F1代，将阳性F1代个体作为亲本，分别与野生型个体配对繁殖F2代，由此建立受UAS和nanos3 3’UTR调控Cas9表达的效应品系Tg(UAS:Cas9)。

转基因斑马鱼Tg(UAS:Cas9)品系或pTol2(UAS:Cas9)载体在制备斑马鱼原始生殖细胞特异表达Cas9胚胎中的应用。将Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)雄鱼杂交后，杂交胚胎就能够在原始生殖细胞特异表达Cas9。

一种转基因斑马鱼Tg(UAS:Cas9)品系或pTol2(UAS:Cas9)载体在制备斑马鱼突变品系中的应用，特别是用于制备斑马鱼早期发育必须基因突变品系中的应用；包括将目的基因的gRNA通过显微注射至Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)雄鱼的杂交胚胎中，将能够传递突变的P0代成鱼与野生型AB品系斑马鱼侧交，检测突变阳性的子代即获得突变品系。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1)本发明所述方法，构建了转基因品系Tg(UAS:Cas9)。当将Tg(kop:KalTA4)品系的雌鱼与Tg(UAS:Cas9)的雄鱼杂交后，能够获得在原始生殖细胞中高效、特异、持续表达Cas9的胚胎。利用该胚胎作为受体鱼制备早期发育必需基因突变品系，能够降低体细胞突变表型效应，增加P0代的胚胎成活率。同时，性成熟的P0代成鱼能够有效传递突变。

2)本发明的转基因斑马鱼Tg(UAS:Cas9)与转基因品系Tg(kop:KalTA4)雌鱼杂交后，能够在斑马鱼胚胎中表达Cas9基因，从而可以节约体外合成Cas9 mRNA的花费和工作量。只要将目的基因有效的gRNA导入到Tg(kop:KalTA4)与Tg(UAS:Cas9)杂交胚胎中建立P0代，无需同时注射Cas9 mRNA。

附图说明

图1为一种基于Gal4/UAS系统在原始生殖细胞中特异表达Cas9的策略示意图。

A:Tg(kop:KalTA4)品系转基因载体示意图；B:Tg(UAS:Cas9)品系转基因载体示意图；C:Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)雄鱼杂交后，原始生殖细胞特异的转录因子KalTA4激活UAS表达Cas9。

图2为一种原位杂交检测Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)雄鱼杂交胚胎中Cas9 mRNA的时空表达模式示意图。

Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)雄鱼杂交胚胎中，在shield时期(B)，1dpf(C)和3dpf(D)时，PGC特异表达Cas9 mRNA。

图3在Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)的杂交胚胎中注射tcf7l1a-gRNA产生的P0代胚胎的表型和死亡率。

相较于共注射tcf7l1a-gRNA和Cas9 mRNA的方法产生的P0代胚胎中，大部分的发育畸形。而在Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)的杂交胚胎中制备突变品系时，P0代的死亡率明显降低。

图4测序检测在Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)的杂交胚胎中注射30ng/l的tcf7l1a-gRNA产生的P0代成鱼的遗传鉴定。

在8尾Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)的杂交胚胎中注射30ng/l的tcf7l1a-gRNA产生的P0代中，有2尾P0代的能够产生突变子代。

具体实施方式

本发明实施例中的方法未经特别说明，均为本领域技术人员熟知的常规方法，具体可参考《分子克隆实验指南》(第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993)。本发明中所用的生物试剂如未经特别说明，均来源于Fermantas公司。

实施例1：

一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体pTol2(UAS:Cas9)，通过以下步骤制备得到

1.设计出基于Gal4/UAS系统在斑马鱼原始生殖细胞中特异表达Cas9的转基因品系，策略图见图1所示，然后设计扩增转基因载体中各个片段所需要的引物。引物序列如下表所示：

2.构建转基因载体pTol2(UAS:Cas9)。

分别以质粒pBK-KalTA4(Distel,M.,Wullimann,M.F.and Koster,R.W.(2009).Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping inzebrafish.Proc Natl Acad Sci U S A 106,13365-70.)和pGH-T7-zCas9(Liu,D.,Wang,Z.,Xiao,A.,Zhang,Y.,Li,W.,Zu,Y.,Yao,S.,Lin,S.and Zhang,B.(2014).Efficientgene targeting in zebrafish mediated by a zebrafish-codon-optimized cas9 andevaluation of off-targeting effect.J Genet Genomics 41,43-6.)为模板，UAS_F和UAS_R，Cas9_F和Cas9_R，nos_F和nos_R为引物，扩增UAS序列、Cas9编码区和nanos3 3’UTR序列。

以UAS_F和UAS_R引物对UAS序列进行扩增，PCR条件为：94℃预变性4分钟；98℃变性10秒，60℃复性30秒，68℃延伸30秒，12个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。

以Cas9_F和Cas9_R引物对Cas9编码区进行扩增，PCR条件为：94℃预变性4分钟；98℃变性10秒，61℃复性30秒，68℃延伸4分30秒，18个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。

以nos_F和nos_R引物对nanos3 3’UTR序列进行扩增，PCR条件为：94℃预变性4分钟；98℃变性10秒，60℃复性30秒，68℃延伸45秒，15个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。

运用连接PCR(Horton,R.M.,Hunt,H.D.,Ho,S.N.,Pullen,J.K.and Pease,L.R.(1989).Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes:genesplicing by overlap extension.Gene 77,61-8.)将UAS序列、Cas9编码区和nanos3 3’UTR序列连接成一条DNA链，即UAS:Cas9-UTRnos3表达框序列。以扩增得到的UAS序列、Cas9编码区和nanos3 3’UTR序列互为模板，以UAS_F和nos_R为引物进行扩增，扩增条件为：94℃预变性4分钟；98℃变性10秒，63-60℃(每个循环降0.5℃)复性30秒，68℃延伸5分钟，8个循环；98℃变性10秒，62℃复性30秒，68℃延伸5分钟，20个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。

在商业载体pMD18-T(TaKaRa公司)质粒基础上，人工合成包含Tol2转座子序列左臂和右臂的载体pTol2-MCS。在该载体中，Tol2转座子序列左臂和右臂之间有BglII，PstI，BsiwI，XmaI，MluI，XhoI，HindIII等7个多酶切位点，pTol2-MCS序列为SEQ ID NO.2所示。

将UAS:Cas9-UTRnos3表达框序列及人工合成的载体pTol2-MCS在37℃水浴中用NEB公司的限制性内切酶MluI和XhoI双酶切酶切4-6小时，再参照Axygen公司的PCR clean-up回收试剂盒回收酶切产物。然后将回收的DNA片段与载体利用NEB公司的T4连接酶在室温连接30分钟，最后将连接产物转化入大肠杆菌TOP10菌株(购自Invitrogen公司)，转化的具体过程为：将连接产物加入4℃感受态细胞中，轻混匀；冰浴30分钟；42℃热激45秒，冰浴2分钟；加入800ul LB培养基，37℃，100rpm培养1h；涂平板，37℃培养12-16h(常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993)。利用引物F：GATCCCATCGCGTCTCAG，R：CCCAGCCCACGCTATTTG。进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，57℃复性30秒，72℃延伸90秒，30个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存。最后测序确认，获得转基因载体pTol2(UAS:Cas9)。该转基因载体的序列SEQ ID NO:1所示。

实施例2：

一种转基因斑马鱼Tg(UAS:Cas9)品系的制备方法，包括：

利用Ambion公司的MACHINE体外转录试剂盒合成Tol2转座酶mRNA，然后将转基因载体pTol2(UAS:Cas9)与体外转录合成的Tol2转座酶mRNA按照1:5的比例混合(总浓度100ng/l)，采用显微注射的方式将其导入单细胞期斑马鱼胚胎，获得P0代转基因鱼苗。

收集P0代胚胎，用引物F：GATCCCATCGCGTCTCAG，R：CCCAGCCCACGCTATTTG，进行PCR检测转基因的传递情况，扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，57℃复性30秒，72℃延伸90秒，30个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存。

将扩增检测阳性个体的P0代与野生型斑马鱼侧交繁殖F1代。将F1代群体培养至性成熟，取F1代斑马鱼尾鳍进行基因型检测，采用相同的方法，PCR作遗传检测，筛选出转基因阳性F1代个体。将阳性F1代个体作为亲本，分别与野生型个体配对繁殖F2代。然后F2代转基因杂合子成鱼自交，通过逐代的筛选，鉴定出的转基因纯合子，由此建立受UAS调控Cas9表达的效应品系Tg(UAS:Cas9)，用于以下实施例。

实施例3：

Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)雄鱼杂交胚胎特异地在原始生殖细胞中表达Cas9：

1.原位杂交检测Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)雄鱼杂交胚胎特异地在原始生殖细胞中表达Cas9。

(1)Cas9探针制备。

A.模板的制备和纯化。

以质粒pTol2(UAS:Cas9)为模板，zCas9-probe-F：ACTGAAAGGAAGCCCCGAG和T3-nanos3-R:GATCCATTAACCCTCACTAAAGGGAATCTCCCGGAGCATCAAT为引物，PCR扩增出模板DNA，参照Axygen公司的PCR clean up试剂盒回收PCR产物，以其作为合成探针的探针。

B.探针合成和回收。

参照Promega的T3 RNA聚合酶说明书转录合成RNA探针，并参照sigma spin post-reaction chean-up columns说明书回收探针。

(2)原位杂交检测激活品系Tg(kop:KalTA4)与效应品系Tg(UAS:Cas9)杂交胚胎中Cas9mRNA的表达。

取Tg(kop:KalTA4)雌鱼与效应品系Tg(UAS:Cas9)雄鱼配对，收集的4cell(a)，sphere(b)，shield(c)及1day post-fertilization(dpf)(d)时期的杂交胚胎，然后用Cas9探针进行原位杂交检测(常规方法，Thisse,B.,Heyer,V.,Lux,A.,Alunni,V.,Degrave,A.,Seiliez,I.,Kirchner,J.,Parkhill,J.P.and Thisse,C.(2004)"Spatial and temporalexpression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridizationscreening."Methods Cell Biol 77,505-519.)

原位杂交结果显示在Tg(kop:KalTA4)雌鱼与效应品系Tg(UAS:Cas9)的杂交胚胎中，并不能在4cell期观察到生殖质特异地Cas9 mRNA的表达(图2A)。发育至shield时期，所有检测的胚胎中的Cas9 mRNA阳性细胞呈4簇分布于在胚盘的边缘(图2B)。发育至1dpf时，Cas9 mRNA阳性细胞呈左右对称全部迁移至卵黄球与卵黄管交接处的双侧(图2C)。到发育第三天时，Cas9 mRNA阳性细胞沿着纵轴位于生殖脊中(图2D)。因此，原位杂交的结果显示Tg(kop:KalTA4)雌鱼与效应品系Tg(UAS:Cas9)的杂交胚胎中Cas9 mRNA的表达模式与生殖细胞的标志基因vasa的表达模式相似。结果表明杂交胚胎中的Cas9非常特异地表达于PGC中。

因此，本发明构建出能够在斑马鱼原始生殖细胞中特异高效的表达Cas9的转基因斑马鱼胚胎，为基于CRISPR/CAS9系统特异高效地在生殖细胞中的目的基因产生突变提供平台。

实施例4：

Tg(UAS:Cas9)斑马鱼品系或pTol2(UAS:Cas9)载体在制备斑马鱼突变品系中的应用：

1.制备目的基因gRNA。

以斑马鱼早期胚胎发育必需的基因tcf7l1a为对象，设计tcf7l1a-gRNA，通过网站http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat验证了靶点的唯一性，提取野生型AB斑马鱼基因组DNA，用引物F:TTCTAACCTCCACAGTCGC，R：CCTTCCGCAAAGTATTCC，进行PCR扩增tcf7l1a-gRNA的靶点处DNA序列。PCR程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸5分钟；4℃保存。将PCR产物用引物测序，测序验证靶点在基因组中的准确性。然后利用T7RNA聚合酶(NEB公司)合成tcf7l1a-gRNA。

2.在Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)的杂交胚胎中注射tcf7l1a-gRNA。

通过显微注射仪和显微注射法(Zhu Z,Li G,He L,et al.Novel gene transferinto the fertilized eggs of goldfish(Carassius auratus L.1758).Z angew Ichthyol,1985,1:31-34)，在Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)的杂交胚胎中注射30ng/l的tcf7l1a-gRNA。同时，通过体外转录的方法合成出Cas9 mRNA(常规方法：Liu,D.,Wang,Z.,Xiao,A.,Zhang,Y.,Li,W.,Zu,Y.,Yao,S.,Lin,S.and Zhang,B.(2014).Efficient gene targeting in zebrafish mediated by a zebrafish-codon-optimized cas9 and evaluation of off-targeting effect.J Genet Genomics 41,43-6.)，然后，在野生型胚胎中注射30ng/l的tcf7l1a-gRNA和500ng/l泛表达Cas9 mRNA作为对照组。注射剂量25ng/l，1-2nl/卵。

3.P0代胚胎表型观察。

胚胎发育至1dpf时，观察实验组和对照组的表型和死亡率。结果显示，相较于目前常用的泛表达Cas9 mRNA有15％(23/154)的胚胎严重畸形，36％(56/154)的胚胎发生了部分的畸形，这些畸形的胚胎都不能成活。而在Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)的杂交胚胎中制备突变品系的死亡率明显降低，仅仅1％(2/139)出现了畸形，表明杂交胚胎中的PGC-Cas9 mRNA降低了体细胞突变表型效应(图3)，从而增加了P0代胚胎的成活率。

4.P0代成鱼遗传鉴定。

将Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)的杂交胚胎中注射30ng/l的tcf7l1a-gRNA产生的P0代群体培养至性成熟(3个月)。取P0代成鱼与野生型AB侧交，收集子代胚胎用引物F:TTCTAACCTCCACAGTCGC，R：CCTTCCGCAAAGTATTCC，进行PCR作遗传检测。PCR程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸5分钟；4℃保存。PCR产物切胶回收后，连入PMD18-T载体(takara公司)中，测序检测P0代个体能否传递tcf7l1a突变。结果显示：在Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)的杂交胚胎中注射30ng/l的tcf7l1a-gRNA产生的P0代群体中，25％(2/8)的P0代成鱼能够产生突变子代(图4)，表明以Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:Cas9)的杂交胚胎作为受体胚胎，能够高效的制备突变品系。

因此，本发明制备出了在胚胎早期生殖细胞高效表达Cas9的转基因斑马鱼，利用该胚胎作为受体鱼制备早期发育必需基因突变品系，能够降低体细胞突变表型效应，增加P0代的胚胎成活率。同时，性成熟的P0代成鱼能够有效传递突变。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体及制备方法和用途

<130> 一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体及制备方法和用途

<160> 8

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 7949

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccatggatta caaggaccac gacggtgatt ataaggatca cgacatcgac tacaaagacg 60

acgatgataa gatggcccct aagaaaaaga gaaaggtcgg aattcacgga gttcccgctg 120

cagataaaaa gtacagcatt ggactggaca tcggaacaaa tagcgtgggc tgggctgtga 180

ttactgacga atataaggtg cctagcaaaa agtttaaagt gctgggaaac accgacagac 240

acagcatcaa aaaaaacctg atcggcgctc tgctgtttga tagcggtgaa actgccgagg 300

ctactagact gaagagaact gctagaagaa gatataccag aagaaagaat agaatttgtt 360

acctgcaaga aatctttagc aatgagatgg caaaggttga cgatagcttc tttcatagac 420

tggaggagag cttcctggtc gaggaggaca agaagcacga gagacacccc atcttcggaa 480

atatcgtgga cgaggtggca taccatgaaa agtatcctac catttaccac ctgagaaaaa 540

agctggtgga cagcacagac aaggccgatc tgagactgat ctacctggca ctggcccaca 600

tgatcaaatt tagaggccat ttcctgattg aaggagacct gaaccccgat aacagcgatg 660

ttgataaact gttcatccaa ctggttcaga cctataacca actgtttgag gagaacccta 720

ttaacgccag cggagtggat gcaaaggcca tcctgagcgc tagactgagc aaaagcagaa 780

gactggaaaa tctgatcgcc cagctgcccg gcgaaaaaaa gaatggactg ttcggcaatc 840

tgattgcact gagcctggga ctgacaccta acttcaagag caatttcgat ctggctgagg 900

acgccaaact gcagctgagc aaagacacat atgatgacga cctggataac ctgctggcac 960

aaattggtga ccaatacgct gacctgttcc tggctgctaa gaatctgagc gatgccattc 1020

tgctgagcga catcctgaga gtgaacacag agattaccaa ggcacccctg agcgcaagca 1080

tgattaagag atacgacgag caccaccaag atctgaccct gctgaaggcc ctggtcagac 1140

aacaactgcc agagaagtat aaagaaattt tctttgacca aagcaagaac ggttacgctg 1200

gctacattga cggcggtgca agccaagagg agttctataa gttcattaag ccaatcctgg 1260

agaaaatgga tggaactgag gagctgctgg ttaagctgaa tagagaggat ctgctgagaa 1320

aacaaagaac attcgacaac ggtagcatcc cacaccagat tcatctgggt gagctgcacg 1380

caattctgag aagacaggaa gacttttatc cattcctgaa ggacaacaga gaaaagatcg 1440

agaagattct gacatttaga atcccctact acgtgggacc tctggctaga ggcaatagca 1500

gattcgcatg gatgactaga aagagcgagg agacaattac cccttggaac tttgaagaag 1560

tggtggataa gggagcaagc gcccaaagct tcattgagag aatgacaaac ttcgataaga 1620

acctgcctaa cgagaaggtt ctgcccaagc atagcctgct gtatgaatat ttcacagtgt 1680

acaacgagct gacaaaggtc aagtacgtca cagagggcat gagaaagccc gcctttctga 1740

gcggagaaca aaagaaggct attgttgacc tgctgttcaa gaccaacaga aaagttacag 1800

ttaaacagct gaaagaggac tacttcaaaa agattgaatg ttttgacagc gtggaaatca 1860

gcggcgttga ggacagattt aacgctagcc tgggcaccta ccacgatctg ctgaaaatca 1920

tcaaagataa ggactttctg gacaacgaag aaaacgagga cattctggaa gacattgtgc 1980

tgacactgac tctgttcgaa gatagagaaa tgatcgagga aagactgaaa acttatgcac 2040

atctgttcga cgacaaagtg atgaagcaac tgaagagaag aagatacact ggatggggca 2100

gactgagcag aaagctgatc aacggaatca gagacaagca aagcggaaaa actattctgg 2160

attttctgaa aagcgacggt ttcgccaata gaaacttcat gcaactgatt cacgatgaca 2220

gcctgacttt caaggaggat attcaaaagg cacaggtgag cggccagggc gatagcctgc 2280

acgaacacat cgcaaatctg gccggtagcc ctgccattaa gaagggcatc ctgcagacag 2340

tgaaggttgt tgatgaactg gtcaaggtga tgggtagaca caagcccgag aatattgtga 2400

tcgagatggc tagagagaac caaacaacac aaaagggaca gaagaatagc agagaaagaa 2460

tgaaaagaat tgaggaggga atcaaggagc tgggtagcca gatcctgaaa gaacaccctg 2520

tcgagaatac acaactgcaa aacgaaaagc tgtacctgta ctacctgcaa aatggcagag 2580

acatgtacgt ggaccaagag ctggatatta acagactgag cgactacgat gtcgaccaca 2640

tcgtgcctca aagcttcctg aaggatgaca gcatcgacaa taaagtgctg actagaagcg 2700

acaagaacag aggaaaaagc gacaacgtgc ccagcgagga agtggttaaa aagatgaaga 2760

actactggag acagctgctg aatgccaagc tgatcacaca aagaaaattc gacaacctga 2820

ccaaagccga gagaggaggt ctgagcgaac tggacaaggc tggattcatt aagagacaac 2880

tggttgaaac cagacagatt acaaagcacg tggctcaaat cctggacagc agaatgaata 2940

ccaaatatga cgagaacgac aaactgatta gagaggtgaa ggttattact ctgaagagca 3000

aactggtcag cgacttcaga aaggacttcc aattctacaa ggtgagagag atcaacaatt 3060

accaccacgc acacgacgct tacctgaacg ctgtggtggg cacagctctg atcaaaaagt 3120

atccaaaact ggaaagcgag tttgtgtacg gtgactataa agtttatgat gtgagaaaaa 3180

tgatcgctaa gagcgagcag gagatcggaa aggctacagc caagtatttc ttttacagca 3240

acattatgaa ctttttcaag actgaaatca ccctggcaaa cggtgagatc agaaaaagac 3300

cactgatcga aacaaatggc gagacaggcg agatcgtgtg ggataaggga agagacttcg 3360

ctaccgttag aaaggttctg agcatgccac aggttaacat tgtgaagaaa actgaggtgc 3420

agacaggagg tttcagcaag gagagcatcc tgcctaagag aaacagcgat aagctgattg 3480

caagaaaaaa ggattgggac cctaagaagt acggcggttt tgacagccct actgtggctt 3540

acagcgtgct ggtggtggct aaagtggaga agggcaaaag caagaagctg aaaagcgtga 3600

aggaactgct gggaattaca atcatggaga gaagcagctt cgagaagaac ccaatcgact 3660

tcctggaggc taagggatac aaggaagtta agaaggacct gatcatcaag ctgcccaagt 3720

acagcctgtt cgagctggaa aatggtagaa agagaatgct ggctagcgct ggtgagctgc 3780

agaagggaaa tgaactggca ctgcctagca agtacgttaa ctttctgtat ctggcaagcc 3840

attacgagaa actgaaagga agccccgagg acaatgagca gaaacaactg ttcgtggaac 3900

agcacaaaca ctatctggac gagattatcg agcagatcag cgaatttagc aaaagagtga 3960

tcctggctga tgctaacctg gataaagtcc tgagcgctta caacaaacat agagataagc 4020

ctatcagaga gcaggccgaa aacatcatcc acctgttcac actgacaaac ctgggcgctc 4080

ctgccgcttt caagtacttt gataccacta ttgatagaaa gagatatact agcaccaaag 4140

aggtgctgga cgccaccctg attcaccaga gcattaccgg actgtacgaa actagaatcg 4200

acctgagcca actgggagga gacaagagac ccgctgcaac taaaaaggca ggtcaggcca 4260

aaaagaagaa atgatccgga gcggacattg atgctccggg agatttgaag aaacactttt 4320

taccgcaggt tttaatgttt aagttttaac tctttaattg tttgtttggt tgatacgcgg 4380

cggattgcga gtttgcatgc atgtgtgcgt tcactgtttg attttgcact ttttgtgtgt 4440

gtgtatatgt gtgtgtttgc tgtgttttat tttgtgtgca ctggtgttgt gttttcactt 4500

ggtaacaaac ttgtacacaa gccagcaggc tcgctacagg cgcaaccgca ctcaaaaaca 4560

aaccctttca tgcttatttg gtaaatacaa tgtgtgttta gtcctccttt taaatgtcag 4620

attttatggt gttgtattta aacaaaaaat tcaatgttaa tatttagatt ttagtgattt 4680

tattattgaa aacggcttgt tttgtataag taacctttaa aaaaagtttt ctccattgca 4740

tttaaattca gtttgacaaa cataatcgcc atattttcat gtcgcttgct aaaattcatg 4800

tactactttc atcattttat gtcagtgtgt gatttttgac ttgtgatgga gtgaaaaatg 4860

tgaggaaaat ataaacattt tctctagact taacgctcga ggtaccaact cgagaaaagc 4920

ttaaacaaga atctctagtt ttctttcttg cttttacttt tacttcctta atactcaagt 4980

acaattttaa tggagtactt ttttactttt actcaagtaa gattctagcc agatactttt 5040

acttttaatt gagtaaaatt ttccctaagt acttgtactt tcacttgagt aaaatttttg 5100

agtacttttt acacctctga attcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 5160

ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 5220

tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 5280

gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 5340

gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 5400

gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 5460

taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 5520

cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 5580

ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 5640

aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 5700

tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 5760

gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 5820

cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 5880

ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 5940

cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 6000

gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 6060

cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 6120

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 6180

ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 6240

aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 6300

atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 6360

ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 6420

tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 6480

agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 6540

taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 6600

tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 6660

cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 6720

ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 6780

tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 6840

tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 6900

cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 6960

tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 7020

gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 7080

tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 7140

atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 7200

tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 7260

cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 7320

ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 7380

aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 7440

gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa 7500

ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgagaacca gaggtgtaaa 7560

gtacttgagt aattttactt gattactgta cttaagtatt atttttgggg atttttactt 7620

tacttgagta caattaaaaa tcaatacttt tacttttact taattacatt tttttagaaa 7680

aaaaagtact ttttactcct tacaatttta tttacagtca aaaagtactt attttttgga 7740

gatcacttag atctaactgc agaacgtacg aacccgggaa acgcgtactt agatctaact 7800

gcagcggagt actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga 7860

gcggagtact gtcctccgag tctagagggt atataatgga tcccatcgcg tctcagcctc 7920

actttgagct cctccacacg aattcgcca 7949

<210> 2

<211> 2880

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agaaccagag gtgtaaagta cttgagtaat tttacttgat tactgtactt aagtattatt 60

tttggggatt tttactttac ttgagtacaa ttaaaaatca atacttttac ttttacttaa 120

ttacattttt ttagaaaaaa aagtactttt tactccttac aattttattt acagtcaaaa 180

agtacttatt ttttggagat cacttagatc taactgcaga acgtacgaac ccgggaaacg 240

cgtaactcga gaaaagctta aacaagaatc tctagttttc tttcttgctt ttacttttac 300

ttccttaata ctcaagtaca attttaatgg agtacttttt tacttttact caagtaagat 360

tctagccaga tacttttact tttaattgag taaaattttc cctaagtact tgtactttca 420

cttgagtaaa atttttgagt actttttaca cctctgaatt cgtaatcatg gtcatagctg 480

tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 540

aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 600

ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 660

gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 720

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 780

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 840

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 900

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 960

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 1020

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 1080

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 1140

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 1200

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 1260

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 1320

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 1380

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 1440

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 1500

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 1560

tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 1620

tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 1680

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 1740

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 1800

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 1860

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 1920

agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 1980

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 2040

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 2100

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 2160

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 2220

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 2280

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 2340

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 2400

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 2460

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 2520

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 2580

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt 2640

attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt 2700

ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt 2760

ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg 2820

tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg 2880

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taaacgcgta cttagatcta actgcagcgg agtact 36

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttgtaatcc atggtggcga attcgtgtgg agga 34

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cacgaattcg ccaccatgga ttacaaggac cacgac 36

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caatgtccgc tccggatcat ttcttctttt tggcctgacc 40

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaagaaatga tccggagcgg acattgatgc tccgg 35

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tttctcgagc gttaagtcta gagaaaatgt ttat 34

Claims (6)

1.一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体pTol2(UAS:Cas9)，其为SEQ ID NO.1所示的多核苷酸。

2.权利要求1所述转基因载体pTol2(UAS:Cas9)构建方法，包括下述步骤：

1)重组基因片段的获得：

以UAS_F和UAS_R引物对UAS序列进行扩增获得UAS；以Cas9_F和Cas9_R引物对Cas9编码区进行扩增获得Cas9编码区；以nos_F和nos_R引物对nanos3 3’UTR序列进行扩增获得nanos3 3’UTR；以UAS，Cas9编码区和nanos3 3’UTR，这3个DNA片段共同为模板，以UAS_F和nos_R为引物，PCR扩增出由UAS，Cas9编码区和nanos3 3’UTR这3段DNA分子片段拼接成的重组基因片段，即UAS:Cas9-UTRnos3表达框序列；

UAS_F:TAAACGCGTACTTAGATCTAACTGCAGCGGAGTACT；

UAS_R:CTTGTAATCCATGGTGGCGAATTCGTGTGGAGGA；

Cas9_F:CACGAATTCGCCACCATGGATTACAAGGACCACGAC；

Cas9_R:CAATGTCCGCTCCGGATCATTTCTTCTTTTTGGCCTGACC；

nos_F:GAAGAAATGATCCGGAGCGGACATTGATGCTCCGG；

nos_R:TTTCTCGAGCGTTAAGTCTAGAGAAAATGTTTAT；

2)在载体pMD18-T基础上，人工合成包含Tol2转座子序列左臂和右臂的载体pTol2-MCS，其序列为SEQ ID NO.2所示；

3)将获得的重组基因片段及载体pTol2-MCS连接成转基因载体pTol2(UAS:Cas9)。

3.一种转基因斑马鱼Tg(UAS:Cas9)品系的制备方法，包括将权利要求1所述的转基因载体pTol2(UAS:Cas9)与Tol2转座酶mRNA，通过显微注射的方式导入单细胞期斑马鱼胚胎，将检测阳性个体的P0代与野生型斑马鱼测 交繁殖F1代，将阳性F1代个体作为亲本，与野生型个体配对繁殖F2代，检测转基因阳性的子代即为Tg(UAS:Cas9)品系。

4.权利要求1所述载体pTol2(UAS:Cas9)或权利要求3所述方法制备得到的斑马鱼Tg(UAS:Cas9)品系在制备斑马鱼原始生殖细胞特异表达Cas9胚胎中的应用。

5.权利要求1所述载体pTol2(UAS:Cas9)或权利要求3所述方法制备得到的斑马鱼Tg(UAS:Cas9)品系在制备斑马鱼突变品系中的应用。

6.权利要求1所述载体pTol2(UAS:Cas9)或权利要求3所述方法制备得到的斑马鱼Tg(UAS:Cas9)品系在制备斑马鱼早期发育必须基因突变品系中的应用。