CN110117620B - 一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法 - Google Patents

一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法，包括以下步骤：(1)质粒载体的构建，所述质粒载体包括第一载体和第二载体：所述第一载体包括Kop‑Cas9‑nos3’UTR，所述Kop‑Cas9‑nos3’UTR的构建包括Kop启动子和nanos1a基因3’端UTR共同使cas9基因特异表达于原始生殖细胞；所述第二载体为gRNA载体，确定靶序列为：TGGGTTTCCTCCGGGTGCTCCGG，所述靶序列在斑马鱼基因组中为重复序列；(2)gRNA的获得；(3)显微注射：将所述Kop‑Cas9‑nos3’UTR和所述gRNA显微共注射。本发明采用不同的特异性启动子控制cas9基因的表达，同时以重复序列为靶位点可以特异剔除鱼类不同组织或细胞的方法，所举例子能够从源头上解决转基因鱼的生殖控制问题。

Description

一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法。
背景技术
生态安全问题是转基因鱼产业化所必需直面和亟待解决的问题。影响转基因鱼生态安全的因素包括两个方面：一是转基因鱼可能形成优势种群；二是转植基因可能通过有性交配在同种或者是异种间发生遗传漂移。因此，控制转基因鱼的生殖力将从根本上解决转基因鱼潜在的生态安全问题，为转基因鱼的产业化提供重要的技术保障。然而，鱼类的生殖细胞由胚胎时期的原始生殖细胞发育而来，如果能够大量获得原始生殖细胞被特异剔除的转基因鱼，将能够从源头上解决转基因鱼的生殖控制问题，但是目前还未发现特异剔除鱼类活体组合或细胞的方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法，采用不同的特异性启动子控制cas9基因的表达，同时以重复序列为靶位点可以特异剔除鱼类不同组织或细胞的方法，所举例子能够从源头上解决转基因鱼的生殖控制问题。
本发明的基础方案：一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法，包括以下步骤：
(1)质粒载体的构建，所述质粒载体包括第一载体和第二载体：
所述第一载体，包括Kop-Cas9-nos3’UTR，所述Kop-Cas9-nos3’UTR的构建包括Kop启动子和nanos1a基因3’端UTR共同使cas9基因特异表达于原始生殖细胞；
所述第二载体为gRNA载体，确定靶序列为：TGGGTTTCCTCCGGGTGCTCCGG，所述靶序列在斑马鱼基因组中为重复序列，其重复100万次以上；
(2)gRNA的获得：
以gRNA-plasmid为模板，以gRNA-F/gRNA-R为引物，gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGGTGGGTTTCCTCCGGGTGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA-R：AGCACCGACTCGGTGCCACT；进行PCR扩增，以测序验证序列PCR产物为模板进行体外转录获得gRNA；
(3)显微注射：
将所述Kop-Cas9-nos3’UTR和所述gRNA显微共注射。
进一步，所述步骤(1)中，所述Kop-Cas9-nos3’UTR的构建包括如下具体方式：
获取基础载体为pkop:KalTA4载体，所述pkop:KalTA4载体的原件为Kop-KalTA4-nos3’UTR；
用DNA限制性内切酶AscI和BspEI将基因KalTA4从所述pkop:KalTA4载体中切除；
获取Cas9基因，设计引物Cas9-F/Cas9-R：
Cas9-F：5’-ACGGCGCGCCACCATGGCTTCTCCACCTAAG-3’；
Cas9-R：5’-AGTCCGGATCACACCTTTCTCTTCTTCTTAGG-3’；
以Cas9质粒为模板，利用KOD PLUS高保真酶进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶AscI和BspEI酶切后，利用T4DNA连接酶与上述切除KalTA4基因的pkop:KalTA4载体骨架连接，获得Kop-Cas9-nos3’UTR。
进一步，所述步骤(2)中，gRNA的获得包括如下具体方式：
通过所述gRNA-plasmid和所述gRNA-F/gRNA-R，首先利用KOD Plus高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体后转化感受态大肠杆菌；
然后挑取5个所述大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，所述质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；
再利用
Figure BDA0002048250760000031
T7Transcription Kit将构建好的含有靶序列的质粒体外逆转录20ul反应体系如下：
10x Reaction Buffer 2ul；
Plasmid DNA 4ul；
T7Enzyme 2ul；
10mmol/L NTP 1ul；
DEPC water 11ul；
以上体系37℃反应一个小时后纯化备用。
进一步，所述步骤(3)中，显微注射系统如下：
Kop-Cas9-nos3’UTR 100ng/ul；
gRNA 30ng/ul；
Phenol-red 0.2ul；
DEPC Water up to 2ul；
将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，不同时间取样检测原始生殖细胞特异表达基因nanos1基因的表达水平和原始生殖细胞的数量变化。
与现有技术相比，本发明有益效果：通过构建原始生殖细胞特异表达cas9基因载体，即Kop-Cas9-nos3’UTR，然后将Kop-Cas9-nos3’UTR和获得的gRNA进行显微共注射，以达到剔除鱼类原始生殖细胞的目的，提高转基因鱼类的生殖力。
所以，本发明采用不同的特异性启动子控制cas9基因的表达，同时以重复序列为靶位点可以特异剔除鱼类不同组织或细胞的方法，所举例子能够从源头上解决转基因鱼的生殖控制问题。
附图说明
图1是本实施例提供的nanos1基因在对照组和实验组胚胎中的mRNA水平；
图2是本实施例提供的vasa探针原位杂交显示原始生殖细胞数量变化(100X)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述：
一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法，包括以下步骤：
(1)质粒载体的构建，质粒载体包括第一载体和第二载体：
第一载体包括Kop-Cas9-nos3’UTR，Kop-Cas9-nos3’UTR的构建包括Kop启动子和nanos1a基因3’端UTR共同使cas9基因特异表达于原始生殖细胞(PGC细胞)，具体构建方式如下：
首先获取基础载体为pkop:KalTA4载体，pkop:KalTA4载体的原件为Kop-KalTA4-nos3’UTR。其中，pkop:KalTA4载体来源于文献“Xiong Feng,Wei ZhiQiang,Zhu ZuoYan,Sun Yonghua(2013).Targeted expression in zebrafish primordial germ cells bycre/loxp and gal4/uas systems.Marine Biotechnology,15(5),526-539.”中。
然后用DNA限制性内切酶AscI和BspEI将基因KalTA4从pkop:KalTA4载体中切除。
再获取Cas9基因，设计引物Cas9-F/Cas9-R：
Cas9-F：5’-AC[GGCGCGCC]ACCATGGCTTCTCCACCTAAG-3’，其中，括号内的[GGCGCGCC]为AscI酶切位点；
Cas9-R：5’-AG[TCCGGA]TCACACCTTTCTCTTCTTCTTAGG-3’，其中，括号内的[TCCGGA]为AscI酶切位点；
以Cas9质粒为模板，其中，Cas9质粒来自AddgeneTM(#63154)。利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶AscI和BspEI酶切后，利用T4DNA连接酶与上述切除KalTA4基因的pkop:KalTA4载体骨架连接，获得Kop-Cas9-nos3’UTR，即为原始生殖细胞特异表达Cas9基因的转基因载体。
第二载体为gRNA载体，确定靶序列为：TGGGTTTCCTCCGGGTGCTC[CGG]，其中，括号内的[CGG]为PAM序列。该靶序列在斑马鱼基因组中为重复序列，其重复100万次以上。
(2)gRNA的获得：
以gRNA-plasmid为模板，以gRNA-F/gRNA-R为引物，gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGGTGGGTTTCCTCCGGGTGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA-R：AGCACCGACTCGGTGCCACT；进行PCR扩增，以测序验证序列PCR产物为模板进行体外转录获得gRNA。
通过gRNA-plasmid和gRNA-F/gRNA-R，首先利用KOD Plus(TAKARA)高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌。
然后挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板。
再利用
Figure BDA0002048250760000051
T7Transcription Kit将构建好的含有靶序列的质粒体外逆转录20ul反应体系如下：
10x Reaction Buffer 2ul；
Plasmid DNA 4ul；
T7Enzyme 2ul；
10mmol/L NTP 1ul；
DEPC water 11ul；
以上体系37℃反应一个小时后纯化备用。
(3)显微注射：
将Kop-Cas9-nos3’UTR和gRNA显微共注射，显微注射系统如下：
Kop-Cas9-nos3’UTR 100ng/ul；
gRNA 30ng/ul；
Phenol-red 0.2ul；
DEPC Water up to 2ul；
将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，不同时间取样检测原始生殖细胞特异表达基因nanos1基因的表达水平和原始生殖细胞的数量变化。
上述的检测方法如下：
一、nanos1基因mRNA水平变化检测：
分别收集0hpf(受精后0小时)、10hpf、20hpf发育阶段胚胎TRIzol法提取总RNA，反转录后获得cDNA作为定量检测Nanos1基因mRNA水平变化的模板，所用参考基因、引物和反应条件均参考文献“Kedde,M.,Strasser,M.J.,Boldajipour,B.,et al.2007.RNA-bindingprotein Dnd1inhibits microRNA access to target mRNA.Cell,131(7):1273-1286.”结果如图1：随着发育的进行，nanos1mRNA水平相比对照逐渐减少，到受精后20小时实验组中几乎检测不到nanos1mRNA，说明针对重复序列的敲除设计可以很好的剔除原始生殖细胞。
二、为了更直观的检测PGC数量的变化，我们利用vasa探针检测斑马鱼胚胎中PGC数量，方法如下：
(1)制备模板
将带有目的基因的PCS2-vasa载体用限制性内切酶线性化后作为模板。
(2)探针合成
反应体系如下：
5x transcriptionbuffer 2ul
DIG-RNA labeling mix 1ul
DTT 0.5ul
模版DNA 0.5-1ug
RNAsein 0.5ul
T7或T3RNA聚合酶 1ul
RNase-free水补足10ul
反应条件：37℃水浴2h。
(3)加入2ul RNase-free的DNA酶和18ul RNase-free水，37℃孵育15min，然后再加入1ul EDTA(1M，pH 8.0)终止反应。
(4)用Sigma公司spinPost Reaction柱回收探针
操作步骤如下：
a)将回收柱放在2ml离心管上，750g离心15秒。
b)去掉回收柱的盖和尾，750g离心2min。
c)把回收柱置于一个干净的1.5ml EP管，将含有探针的反应液加到回收柱上，750g离心4min。
d)向探针溶液中加入1ul EDTA(1M，pH 8.0)和9ul RNA Later(可用RNase-free水代替)。取1ul电泳检测。余下分装后-80℃保存。
本实验中使用的枪头、离心管和水都是RNase-free的。
(5)收集胚胎
斑马鱼胚胎受精后，用Pronas(10mg/ml)进行脱模处理，按照发育时期收取胚胎，用4％多聚甲醛(PFA)溶液4℃固定过夜。4％PFA配制方法为4克多聚甲醛粉末溶于100ml 1xPBS溶液。配好的PFA溶液使用时间不要超过7天。
胚胎脱水步骤如下：
25％甲醇-75％PBS(vol/vol) 5min
50％甲醇-50％PBS(vol/vol) 5min
75％甲醇-25％PBS(vol/vol) 5min
100％甲醇10min
胚胎于100％甲醇中保存于-20℃，在进行下一步处理前，胚胎要在-20℃保存2h以上。
(6)第一天：
(在24孔板中做，使用的枪头和EP管均是RNase–free的)
a)复水。尼龙篓子放在24孔板中，孔中有相应的溶液。用吸管将甲醇中胚胎转移到尼龙篓子溶液中。复水流程如下：
25％PBS-75％甲醇(vol/vol) 5min
50％PBS-50％甲醇(vol/vol) 5min
75％PBS-25％甲醇(vol/vol) 5min
100％PBT 5min，(重复4次)
b)消化。将盛有胚胎的尼龙篓子转移到含有10ug/ml蛋白酶K的PBT溶液中，室温消化10min。
c)终止消化。把消化好的胚胎立即转入4％PFA溶液，室温孵育20min。
d)100％PBT/四次，每次5min。
e)预杂交。把胚胎转入RNase-free的1.5ml EP管，加入0.7ml杂交缓冲液，放于杂交炉内，70℃，20rpm，2-5h。
杂交缓冲液的配方如下：
去离子甲酰胺50ml，20x SSC 25ml，吐温200.1％，1M柠檬酸0.92ml，肝素50ug/ml，酵母tRNA 500ug/ml，DEPC处理水补足100ml。
f)杂交。弃杂交缓冲液，加入0.2ml 70℃预热的杂交缓冲液，加入探针(终浓度40-50ng/ml最适)。置于70℃杂交炉内，10rpm，杂交过夜。
第二天：
(所用枪头、EP管及溶液为非RNase–free)
a)探针回收。将含有探针的杂交缓冲液中保存于-80℃，可重复使用3次。
b)探针洗脱。(洗脱溶液均70℃预热，30rpm下进行)
先用1ml不含肝素和tRNA的杂交缓冲液快速洗胚胎一次。把尼龙篓子放在下面的溶液中，再把胚胎转移到篓子中，洗脱步骤如下：
75％杂交缓冲液-25％2x SSC(vol/vol) 10min
50％杂交缓冲液-50％2x SSC(vol/vol) 10min
25％杂交缓冲液-75％2x SSC(vol/vol) 10min
100％2x SSC 10min
100％0.2x SSC 30min/2次
c)室温下将胚胎从SSC中过渡到PBT中(30rpm摇动)，步骤如下：
25％PBT-75％0.2x SSC(vol/vol) 15min
50％PBT-50％0.2x SSC(vol/vol) 15min
75％PBT-25％0.2x SSC(vol/vol) 15min
100％PBT 15min
d)封闭。封闭缓冲液为含有2％山羊血清和2mg/ml BSA的PBT溶液。室温，30rpm，3-4h。
e)抗体孵育。把胚胎转移到含有1/10000的碱性磷酸酶地高辛抗体的封闭缓冲液中，10rpm，4℃过夜。
第三天：
(所用枪头、EP管及溶液为非RNase–free)
a)抗体洗脱。用100％PBT，室温，30rpm，洗胚胎6次/15min。
b)滤纸吸去多余的PBT，碱性Tris缓冲液洗胚胎3次/5min。碱性Tris缓冲液的配方：0.1％吐温20，100mM NaCl，50mM MgCl2，100mM Tris-Cl pH9.5。
c)显色。把胚胎转移到1.5ml EP管中，加入0.8ml染色缓冲液(每ml碱性Tris缓冲液中加入20ul NBT/BCIP Stocking Solution配成)。再把胚胎连同染色缓冲液转移到免疫反应板，避光显色。
d)终止显色。当胚胎出现足够强的染色信号后，移去染色缓冲液，用染色终止液洗三次，每次15min。染色终止液配方：1x PBS pH4.5，1mM EDTA，0.1％吐温20。
e)胚胎转移到100％甘油中，避光4℃保存1-2天后利用安装在荧光镜(olympusMVX10)上的数码相机(Nikon，Digital sight DS-SMC)拍照。
根据上述检测方法，结果如图2，A处表示受精后20小时对照斑马鱼胚胎(100X)，B处受精后20h实验鱼斑马鱼胚胎(100X)：相比对照胚胎，受精后20小时的实验组胚胎中几乎检测不到原始生殖细胞的存在，直接证明了我们设计的针对原始生殖细胞的剔除实验效果非常好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种特异剔除斑马鱼原始生殖细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)质粒载体的构建，所述质粒载体包括第一载体和第二载体：
所述第一载体为Kop-Cas9-nos3’UTR，所述Kop-Cas9-nos3’UTR的构建包括Kop启动子和nanos1基因3’端UTR共同使cas9基因特异表达于原始生殖细胞；
所述第二载体为gRNA载体，确定靶序列为：TGGGTTTCCTCCGGGTGCTCCGG，所述靶序列在斑马鱼基因组中为重复序列，其重复100万次以上；
(2)gRNA的获得：
以gRNA-plasmid为模板，以gRNA-F/gRNA-R为引物，gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGGTGGGTTTCCTCCGGGTGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA-R：AGCACCGACTCGGTGCCACT；进行PCR扩增，以测序验证PCR产物为模板进行体外转录获得gRNA；
(3)显微注射：
将所述Kop-Cas9-nos3’UTR和所述gRNA显微共注射；
所述步骤(1)中，所述Kop-Cas9-nos3’UTR的构建包括如下具体方式：
获取基础载体为pkop:KalTA4载体，所述pkop:KalTA4载体的元件为Kop-KalTA4-nos3’UTR；
用DNA限制性内切酶AscI和BspEI将基因KalTA4从所述pkop:KalTA4载体中切除；
获取Cas9基因，设计引物Cas9-F/Cas9-R：
Cas9-F：5’-ACGGCGCGCCACCATGGCTTCTCCACCTAAG-3’；
Cas9-R：5’-AGTCCGGATCACACCTTTCTCTTCTTCTTAGG-3’；
以Cas9质粒为模板，利用KOD PLUS高保真酶进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶AscI和BspEI酶切后，利用T4 DNA连接酶与上述切除KalTA4 基因的pkop:KalTA4载体骨架连接，获得Kop-Cas9-nos3’UTR；
所述步骤(2)中，gRNA的获得包括如下具体方式：
通过所述gRNA-plasmid和所述gRNA-F/gRNA-R，首先利用KOD Plus高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体后转化感受态大肠杆菌；
然后挑取5个所述大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，所述质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；
再利用MEGAscript® T7Transcription Kit将构建好的含有靶序列的质粒体外转录，20μl反应体系如下：
10x Reaction Buffer 2μl；
Plasmid DNA 4μl；
T7 Enzyme 2μl；
10mmol/L NTP 1μl；
DEPC water 11μl；
以上体系37℃反应一个小时后纯化备用；
所述步骤(3)中，显微注射体系如下：
Kop-Cas9-nos3’UTR 100ng/μl；
gRNA 30ng/μl；
Phenol-red 0.2μl；
DEPC Water up to 2μl；
将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，不同时间取样检测原始生殖细胞特异表达基因nanos1基因的表达水平和原始生殖细胞的数量变化。
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