CN104195177A - 一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法 - Google Patents
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Abstract
一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法，包括：设计特异性识别和切割鱼类基因组指定位点序列的基因组编辑工具、以及与所述指定位点序列相对应、包含敲入外源基因片段的同源供体，使用共显微注射的方法将所述基因组编辑工具、所述同源供体以及在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA导入到鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行胚胎挑选并获得稳定的遗传性状。该方法可以在鱼类基因组的指定位点敲入外源基因片段，获得带有敲入的外源基因片段的子一代鱼类的效率显著高于已有的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法。
背景技术
基因打靶是重要的遗传学技术手段。鱼类是脊椎动物的遗传学模式动物。传统的基因打靶依赖于胚胎干细胞培养和同源重组。多种模式动物和许多经济动物中由于没有建立胚胎干细胞系难以应用基于同源重组的基因打靶。以往，斑马鱼等鱼类中的反向遗传学手段比较有限，需要人为抑制基因表达时，通常用吗啉代寡核苷酸或siRNA进行基因敲降。包括锌指核酸内切酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸内切酶(TALEN)技术和CRISPR/Cas9核酸内切酶技术等的人工内切酶使斑马鱼中任意位点的基因组编辑有可能实现。人工引入的DNA双链断裂可以显著提高断裂位点附近的同源重组发生率。
只有发生在生殖细胞中的遗传学改造会传递到下一代。在秀丽隐杆线虫的遗传学操作中，研究者常将锌指核酸内切酶、转录激活子样效应因子核酸内切酶或CRISPR/Cas9核酸内切酶等工具分子注射到线虫的性腺中，以利于这些分子进入生殖细胞，进行遗传学改造。对于个体较大、不透明的斑马鱼和其他多数鱼类，难以直接将人工内切酶和其他分子注射到性腺中而不会对动物产生显著损伤。
斑马鱼的生殖细胞是由早期的原生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)发育而来的。斑马鱼的原生殖细胞的命运是由一团特殊的称作“生殖质(germ plasm)”的细胞质决定的。nanos基因对于原始生殖细胞的决定及迁移起着关键作用。在线虫、水蛭、家蚕、爪蟾、斑马鱼、小鼠和人类等多个物种中都有果蝇nanos基因同源物存在。nanosmRNA在斑马鱼的PGCs中表达，并通过3’非编码区在PGCs中被稳定化，在体细胞中迅速降解，因此能够作为研究斑马鱼PGCs的一个标记基因。现在已有利用nanos基因的3’非编码区和绿色荧光蛋白融合标记PGCs来研究PGCs的迁移过程的方法。并且，罗非鱼nanos2和nanos3分别表达在雄性和雌性的生殖细胞中。在其他多种物种中nanos3也表达在两性生殖细胞中，但斑马鱼的nanos3的表达未见这种性别差异。由于斑马鱼胚胎发育过程中，细胞质不均等分配，胚胎发育至1K细胞时，生殖质只分布于4个细胞中。胚胎发育到4K细胞时，这些含有生殖质的原生殖细胞开始分裂，此后逐步发育为生殖细胞。这一决定方式在除哺乳动物和爬行动物有尾目之外的许多脊椎动物中存在。原生殖细胞在胚胎中的含量是稀少的，而人工注入的分子如果不进入这少数的原生殖细胞，就难以实现传代的基因组改造。
在利用人工内切酶改造斑马鱼基因组的操作中，注射过的胚胎(G0代，首建者)在生长至足够的规格后，一些研究人员会剪取其鳍进行基因型鉴定，分析鱼鳍中的细胞是否发生预期的基因组改造。但是，鱼鳍并不包含原生殖细胞或生殖细胞，鱼鳍中的基因组改造情况不代表其生殖细胞中的情况，鳍的细胞中有或者没有发生基因组改造，并不能有效地提示预期的改造是否能传递到该个体的下一代。G0代个体相互交配，或者与未改造的(野生型)个体交配，产生的子代(F1代)在生长至足够的规格后，需要鉴定基因型，以确定所需的改造是否传到F1代中。值得注意的是，如果注射后，人工内切酶等分子没有进入G0个体的生殖细胞，后期对该个体的子代进行的鉴定都会得到阴性的结果，而传统的方法中，这部分G0个体及其子代始终都在工作范围中，需要为之投入时间和劳动。
为了提高斑马鱼基因组改造的传代效率，有以下两种方法：1、将注入的分子高效地引入斑马鱼生殖细胞；2、分选注射后的斑马鱼胚胎，选择出在原生殖细胞中含有较高水平的注入分子的胚胎。其中，后者相对易于实现。一般认为，一同注入斑马鱼胚胎的分子会共定位，即分布于同样的细胞中。但是，本领域的研究者们目前没有认识到注入的核酸在胚胎中的不均等分配情况，并对之采取相应的措施以提高基因组编辑的传代效率。
因此，亟需一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法。已有的研究发现，斑马鱼nanos3(曾名为nos1等)基因的3’非翻译区(3’UTR)可以调控所在的信使RNA(mRNA)在原生殖细胞中稳定化，而在其他细胞中不稳定，向斑马鱼1细胞期胚胎中注射构建的YFP-nanos3mRNA，可以将斑马鱼胚胎的原生殖细胞标记上YFP的黄色荧光。发明人使用共显微注射的方法将上述CRISPR/Cas9系统、上述同源供体与可保证在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA(即连接有nanos3基因片段荧光蛋白的mRNA)导入到鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行胚胎挑选并获得稳定的遗传性状。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供了一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法，包括：设计特异性识别和切割鱼类基因组指定位点序列的基因组编辑工具、以及与所述指定位点序列相对应、包含敲入外源基因片段的同源供体，使用共显微注射的方法将所述基因组编辑工具、所述同源供体以及在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA导入到鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行胚胎挑选并获得稳定的遗传性状。
本发明提供了一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法，包括：设计特异性识别和切割鱼类基因组指定位点序列的基因组编辑工具，使用共显微注射的方法将所述基因组编辑工具与在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA导入到鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行胚胎挑选并获得稳定的遗传性状。
在本发明的一个实施例中，提供了一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法，包括：设计特异性识别和切割鱼类基因组指定位点序列的CRISPR/Cas9系统、以及与所述指定位点序列相对应、包含敲入外源基因片段的同源供体，使用共显微注射的方法将所述CRISPR/Cas9系统、所述同源供体与连接有保证在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA导入到鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行胚胎挑选并获得稳定的遗传性状。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法，包括：设计特异性识别和切割鱼类基因组指定位点序列的CRISPR/Cas9系统，使用共显微注射的方法将所述CRISPR/Cas9系统与可保证在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA导入到鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行胚胎挑选并获得稳定的遗传性状。
在本发明的又一个实施例中，提供了一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法，包括：设计特异性识别和切割鱼类基因组指定位点序列的锌指核酸酶(ZFN)、以及与所述指定位点序列相对应、包含敲入外源基因片段的同源供体，使用共显微注射的方法将所述锌指核酸酶mRNA、所述同源供体、可保证在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA导入到鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行挑选胚胎并获得稳定的遗传性状。
在本发明的再一个实施例中，提供了一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法，包括：设计特异性识别和切割鱼类基因组指定位点序列的锌指核酸酶，使用共显微注射的方法将锌指核酸酶mRNA与可保证在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA共注射于鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行挑选并获得稳定的遗传性状。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法，包括：设计特异性识别和切割鱼类基因组指定位点序列的转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、以及与所述指定位点序列相对应、包含敲入外源基因片段的同源供体，使用共显微注射的方法将所述转录激活因子样效应物核酸酶mRNA、所述同源供体、可保证在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA导入到鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行挑选胚胎并获得稳定的遗传性状。
在本发明的此外一个实施例中，还提供了一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法，包括：设计特异性识别和切割鱼类基因组指定位点序列的转录激活因子样效应物核酸酶，使用共显微注射方法将转录激活因子样效应物核酸酶mRNA与在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA导入到鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行胚胎挑选并获得稳定的遗传性状。
本发明所指的显著提高鱼类基因组编辑效率的方法也指高效人工编辑鱼类基因组的方法。
本发明的在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA包括保证在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的基因序列和荧光蛋白的基因序列。在本发明的一个实施例中，所述保证原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的基因序列为nanos3基因。在本发明的另一个实施例中，所述保证在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的基因片段为vasa基因的3’非编码区的片段。但本发明的保证在原生殖细胞特异稳定表达的基因序列并不限于此，只要可以限制基因的mRNA在原生殖细胞稳定即可。
在本发明的一个实施例中，nanos3基因的3’非编码区的片段如SEQ ID No：9所示。在本发明的另一个实施例中，vasa基因的3’非编码区的片段如SEQ ID No：25所示。
在本发明的一个实施例中，荧光蛋白为黄色荧光蛋白(YFP)。在本发明的一个实施例中，荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。但是本发明中的荧光蛋白并不限于此，可以是红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(mCherry)等荧光蛋白，只要能用于在荧光显微镜下将明显荧光的胚胎挑选出来即可。
在本发明的一个实施例中，所述鱼类为斑马鱼。在本发明的另一个实施例中，所述鱼类为黄颡鱼。但是本发明中的鱼类并不限于此，可以是闪电斑马鱼、泥鳅、金鱼、青鳉鱼、冰虎鱼和青鱼等任何鱼类，只要能够实施本发明即可。
在本发明中，所述基因组编辑工具能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切割，随后细胞利用天然的DNA修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，从而实现基因组编辑。在本发明的一个实施例中，所述基因组编辑工具是CRISPR/Cas9系统。在本发明的另一个实施例中，所述基因组编辑工具是锌指核酸酶mRNA。在本发明的又一个实施例中，所述基因组编辑工具是激活因子样效应物核酸酶mRNA。但是本发明的基因组编辑工具并不限于此，只要能够识别并结合指定的基因序列位点，并有效精确地切割即可。
在本发明中，所述CRISPR/Cas9系统可以是I型、II型和III型的CRISPR/Cas9系统。每种CRISPR/Cas9系统均包含具有核酸酶活性的CRISPR相关(Cas)基因。II型CRISPR/Cas9系统在发挥功能时仅需要一种蛋白，即Cas9核酸酶参与；而I、III型CRISPR/Cas9系统则需要多种蛋白形成复合物才能行使功能。因此，优选地，CRISPR/Cas9系统可以是II型CRISPR/Cas9系统。其中，该II型CRISPR/Cas9系统可以由Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA组成，也可以由Cas9蛋白和sgRNA组成。但是本发明中的CRISPR/Cas9系统并不限于此，只要能够实现识别特定序列并在DNA上进行切割即可。
在本发明的一个实施例中，所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9mRNA和sgRNA。
在本发明的一个实施例中，所述基因组指定位点为aldhla2基因的位点，所述敲入外源基因片段为mloxP基因位点的片段。在本发明的另一个实施例中，所述基因组指定位点为aldhla2基因的位点。在本发明的又一个实施例中，所述基因组指定位点为mstna基因的位点。在本发明的再一个实施例中，所述基因组指定位点为mstnb基因的位点。但是本发明的基因组指定位点并不限于此，可以是任何所需敲入或者敲除的基因。
在本发明的一个实施例中，注射所述Cas9mRNA/所述gRNA/所述同源供体/所述荧光蛋白mRNA注射的质量比例为5:1:1:10。在本发明的又一个实施例中，注射所述锌指核酸酶mRNA/所述荧光蛋白mRNA注射的质量比例为1:5。在本发明的再一个实施例中，注射所述转录激活因子样效应物核酸酶mRNA/所述荧光蛋白mRNA注射的质量比例为1:5。
在本发明的实施例中，所述胚胎处于1细胞期。
在本发明的实施例中，所述胚胎挑选时期为胚胎发育至受精后48小时后进行筛选。
本发明的有益效果：发明人将人工内切酶、同源供体和带有nanos33’UTR的荧光蛋白mRNA共同显微注射到斑马鱼1细胞期胚胎中，胚胎原生殖细胞中的荧光即表示在该原生殖细胞中含有较高水平人工内切酶和同源供体。可以预期，这部分细胞的人工内切酶靶位点被切割的效率较高，因而与同源供体发生同源重组的效率也较高。
类似地，发明人将诸如ZFN、TALEN等人工内切酶和带有nanos33’UTR的荧光蛋白mRNA共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中，胚胎原生殖细胞中的荧光即表示在该原生殖细胞中含有较高水平人工内切酶。可以预期，这部分细胞的人工内切酶靶位点被切割的效率较高，因而产生插入/缺失突变的效率也较高。
在荧光显微镜下将原生殖细胞中有明显荧光的胚胎挑选出来，使之生长至性成熟，不需要鉴定鳍或其他组织中是否发生所需的基因组改造，使G0雌雄个体相互交配，产生F1代，鉴定F1代中是否发生的所需的基因组改造。由于G0个体在1细胞期注射之后已经经过了荧光显微镜下的观察挑选，所有原生殖细胞中不含有注入的分子的胚胎都被弃去，待鉴定的F1代个体中就不存在这些不可能发生传代的基因组改造的G0个体的子代。与传统的方法相比较，不再需要鉴定原生殖细胞中不含有注入的分子的G0的子代，而代之以荧光显微镜下挑选G0代胚胎，工作量大幅减少，子代中获得的传代的基因组改造效率显著提高。
此外，本发明的方法通过用YFP-nanos33’UTR指示含有注入的核酸的原生殖细胞，能够标记带有这样核酸的原生殖细胞的胚胎。并且，理论上，含有注入的核酸的非原生殖细胞不会被荧光标记，而不含有注入的核酸的原生殖细胞也不会被标记。与传统方法中将所有胚胎(称为F0代胚胎，其下一代将繁育出大量的不含有注入核酸的那部分个体和数量极少的含有注入核酸的那部分个体)都用于繁育F1代比较，本发明通过对针对注入的核酸进入原生殖细胞这一指标进行人工挑选，可以极大地减少基因未发生编辑的无效F1代个体，相应地减少筛选F1代突变体所需的时间、人力和费用。
附图说明
图1A示出在原生殖细胞中没有明显黄色荧光蛋白信号的斑马鱼胚胎。
图1B示出在原生殖细胞中明显黄色荧光蛋白信号的斑马鱼胚胎。
具体实施方式
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南(第三版)》(Sambrook等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
以下参照实施例1详细说明本发明的实施方式：
实施例1在斑马鱼aldh1a2基因内含子中定向敲入mloxP
1、构建靶向斑马鱼aldh1a2基因第三内含子与第四内含子的CRISPR/Cas9系统
表1.构建靶向aldh1a2的sgRNA使用的引物和模板序列
用引物ali3gRF11(Seq ID No：1)和sgRNAR(Seq ID No：3)扩增包含sgRNA骨架的质粒模板，PCR条件为：95℃2分钟，35个循环(94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒)，最后72℃延伸5分钟。用同样的方法用引物ali4gRF5(Seq ID No：2)和sgRNAR(Seq ID No：3)扩增包含sgRNA骨架(Seq ID No：4)的质粒模板。用MEGAscriptKit(Ambion，美国)将上述PCR产物转录为RNA，产物分别为ali3gR11和ali4gR5。用TRIzol试剂抽提斑马鱼24hpf胚胎的总RNA，将RNA用PrimeScript RT Reagent Kit(宝生物，日本)反转录为cDNA。用引物YFPF(Seq ID No：5)和nos3'U-YFPR(Seq ID No：6)扩增包含YFP的质粒；用引物YFP-nos3'UF(Seq ID No：7)和nos3'UR(Seq IDNo：8)扩增由24hpf斑马鱼胚胎的总RNA反转录获得的cDNA(被扩增的nanos33’UTR序列为Seq ID No：9)，PCR条件为：95℃2分钟，35个循环(94℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟)，最后72℃延伸5分钟。将上述两次PCR的产物混合后用引物YFPF(Seq ID No：5)和nos3'UR(Seq ID No：8)再次进行扩增，PCR条件相同，将产物(SeqID No：10)克隆到pGEM-T easy载体中，使用mMessage mMachine T7Ultra Kit转录为YFP-nanos3mRNA。将质粒p-T7-Cas9(编码序列为Seq ID No：11)用mMessage mMachine T7Ultra Kit转录为Cas9mRNA。
2、在斑马鱼胚胎中进行显微注射，导入CRISPR/Cas9系统、同源供体和YFP-nanos3mRNA
在1细胞期斑马鱼胚胎中共注射Cas9mRNA、sgRNA(ali3gR11和ali4gR5)、单链供体(ali3gR11ssDmloxP)Seq ID No：13和ali4gR05ssDmloxP(Seq ID No：14)和YFP-nanos3mRNA，Cas9mRNA注射量为250pg,sgRNA为50pg，同源供体为50pg，YFP-nanos mRNA为500pg。
表2.同源供体序列
3、在荧光显微镜下挑选PGC细胞中有黄色荧光信号的胚胎
由于注射入斑马鱼胚胎的核酸是不均匀分布的，有部分胚胎的原生殖细胞中含有较高水平注入的核酸，而其他含有较低水平的注入的核酸。每一批次注射的胚胎发育至48hpf时挑选能在原生殖细胞中观察到YFP荧光信号的胚胎。经过挑选后，我们发现注射后15±8％的胚胎原生殖细胞中可检测到荧光，将它们作为首建者饲养至性成熟。然后收集它们的后代检测可遗传的基因打靶效率。
4、令首建者相互交配获取子一代斑马鱼
将首建者雌雄各一尾放置于交配缸中，使其自然交配，将产出的受精卵收集到10cm培养皿中，在28.5℃下按标准的斑马鱼饲养方案饲养。
5、子一代斑马鱼的基因型鉴定和品系建立
收取首建者相互交配产生的胚胎，饲养至1月龄后剪取尾鳍，用微量基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
对于在aldh1a2基因第三内含子和第四内含子中通过同源重组整合mloxP位点的研究，采取巢式PCR的方法检测mloxP位点在基因组上的整合情况。提取待测的斑马鱼的基因组DNA，取1μl作为模板，用引物ali3F2(Seq ID No：15)和ali3R2(Seq ID No：16)，扩增第三内含子的片段。PCR条件为：95℃2分钟，35个循环(94℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟)，最后72℃延伸5分钟。吸取第一轮PCR产物1μl作为模板，用引物mloxPf(Seq ID No：14)和ali3R3(Seq ID No：17)进行PCR反应，检测mloxP位点在基因组上的整合情况。PCR条件为：95℃2分钟，30个循环(94℃30秒，57℃30秒，72℃1分钟)，最后72℃延伸5分钟。如果存在整合的mloxP，预期的产物分子量为215bp。将产物在含0.02％溴化乙锭(EB)的1％琼脂糖中的水平电泳槽中进行电泳。电泳15分种后，在254nm波长的紫外灯下观察电泳胶。将存在整合的mloxP的基因组DNA的第一轮PCR产物进行测序验证。
第四内含子中mloxP的鉴定方法基本同上，第一轮PCR使用引物ali4F3(Seq ID No：18)和ali4R3(Seq ID No：19)，第二轮PCR使用引物mloxPf(Seq ID No：14)和ali4R12(Seq ID No：20)，如果存在整合的mloxP，预期的产物分子量为555bp。将产物在含0.02％溴化乙锭(EB)的1％琼脂糖中的水平电泳槽中进行电泳。电泳15分种后，在254nm波长的紫外灯下观察电泳胶。将存在整合的mloxP的基因组DNA的第一轮PCR产物进行测序验证。
表3.鉴定同源重组分子使用的引物
将鉴定得到的带有mloxP敲入的子一代斑马鱼饲养至性成熟，使其相互交配，获得纯合突变的子二代斑马鱼。在子一代斑马鱼的受精卵上重复进行上述操作，可获得在同一基因的两个内含子中都敲入mloxP的等位基因，即成为条件性等位基因，可用于aldh1a2基因的条件性敲除研究。
本实施例鉴定了对照组和荧光PGC挑选后G0代卵巢中的卵细胞，和G0相互自由交配生育的F1代中，CRISPR/Cas9造成的插入/缺失突变和CRISPR/Cas9及同源供体造成的同源重组的频率。
在卵细胞中检测的结果为：在测试的aldh1a2基因第三内含子和第四内含子两个位点上，荧光PGC挑选后同源重组频率分别是对照组的9倍和2倍。
在F1代个体中检测的结果为：第三内含子，荧光PGC挑选组同源重组率达6.3％(1/16)，插入/缺失突变率为38％(6/16)，对照组同源重组率为0％(0/93)，插入/缺失突变率为11％(10/93)；第四内含子，荧光PGC挑选组同源重组率达12.5％(2/16)，插入/缺失突变率为50％(8/16)，对照组同源重组率为2％(2/93)，插入/缺失突变率为23％(21/93)。通过荧光PGC挑选，同源重组率提升至6倍以上，插入/缺失突变率提升至2-3倍。
使用该方法进行基因定向敲入不仅限于斑马鱼，本领域技术人员能够参照Saito等Int.J.Dev.Biol.50:691-700(2006)中的记载，通过简单调整的条件和步骤将该方法应用到其他鱼类中，例如黄颡鱼、闪电斑马鱼(Danio albolineatus)、泥鳅、金鱼、青鳉鱼(medaka)、冰虎鱼(ice goby)、青鱼(herring)。
实施例2在斑马鱼aldh1a2基因内含子中引入插入缺失突变
1、构建靶向斑马鱼aldh1a2基因第三内含子与第四内含子的CRISPR/Cas9系统
表1.构建靶向aldh1a2的sgRNA使用的引物和模板序列
用引物ali3gRF11(Seq ID No：1)和sgRNAR(Seq ID No：3)扩增包含sgRNA骨架的质粒模板，PCR条件为：95℃2分钟，35个循环(94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒)，最后72℃延伸5分钟。用同样的方法用引物ali4gRF5(Seq ID No：2)和sgRNAR(Seq ID No：3)扩增包含sgRNA骨架(Seq ID No：4)的质粒模板。用MEGAscriptKit(Ambion，美国)将上述PCR产物转录为RNA，产物分别为ali3gR11和ali4gR5。用TRIzol试剂抽提斑马鱼24hpf胚胎的总RNA，将RNA用PrimeScript RT Reagent Kit(宝生物，日本)反转录为cDNA。用引物GFPF(Seq ID No：21)和vasa3'U-GFPR(Seq ID No：22)扩增包含GFP的质粒；用引物GFP-vasa3'UF(Seq ID No：23)和vasa3'UR(Seq ID No：24)扩增由24hpf斑马鱼胚胎的总RNA反转录获得的cDNA(被扩增的vasa 3’UTR序列为Seq ID No：25)，PCR条件为：95℃2分钟，35个循环(94℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟)，最后72℃延伸5分钟。将上述两次PCR的产物混合后用引物GFPF(Seq IDNo：21)和vasa3'UR(Seq ID No：24)再次进行扩增，PCR条件相同，将产物(Seq ID No：26)克隆到pGEM-T easy载体中，使用mMessagemMachine T7Ultra Kit转录为GFP-vasa mRNA。将质粒p-T7-Cas9(编码序列为Seq ID No：11)用mMessage mMachine T7Ultra Kit转录为Cas9mRNA。
2、在斑马鱼胚胎中进行显微注射，导入CRISPR/Cas9系统和GFP-vasa mRNA
在1细胞期斑马鱼胚胎中共注射Cas9mRNA、sgRNA(ali3gR11和ali4gR5)和GFP-vasa mRNA，Cas9mRNA注射量为250pg,sgRNA为50pg，GFP-vasa mRNA为500pg。
3、在荧光显微镜下挑选PGC细胞中有黄色荧光信号的胚胎
由于注射入斑马鱼胚胎的核酸是不均匀分布的，有部分胚胎的原生殖细胞中含有较高水平注入的核酸，而其他含有较低水平的注入的核酸。每一批次注射的胚胎发育至48hpf时挑选能在原生殖细胞中观察到GFP荧光信号的胚胎。经过挑选后，我们发现注射后15±8％的胚胎原生殖细胞中可检测到荧光，将它们作为首建者饲养至性成熟。然后收集它们的后代检测可遗传的突变效率。
4、令首建者相互交配获取子一代斑马鱼
将首建者雌雄各一尾放置于交配缸中，使其自然交配，将产出的受精卵收集到10cm培养皿中，在28.5℃下按标准的斑马鱼饲养方案饲养。
5、子一代斑马鱼的基因型鉴定和品系建立
收取首建者相互交配产生的胚胎，饲养至1月龄后剪取尾鳍，用微量基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
对于在aldh1a2基因第三内含子和第四内含子中引入插入缺失突变的研究，采取DNA测序的方法检测靶位点发生插入缺失突变的情况。提取待测的斑马鱼的基因组DNA，取1μl作为模板，用引物ali3F2(SeqID No：15)和ali3R2(Seq ID No：16)，扩增第三内含子的片段。PCR条件为：95℃2分钟，35个循环(94℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟)，最后72℃延伸5分钟。PCR产物进行测序验证。
第四内含子中插入缺失突变的鉴定方法基本同上，PCR使用引物ali4F3(Seq ID No：18)和ali4R3(Seq ID No：19)，将PCR产物进行测序验证。
将鉴定得到的带有插入缺失突变的子一代斑马鱼饲养至性成熟，使其相互交配，获得纯合突变的子二代斑马鱼。
本实施例鉴定了对照组和荧光PGC挑选后G0代卵巢中的卵细胞，和G0相互自由交配生育的F1代中，CRISPR/Cas9造成的插入/缺失突变。
在F1代个体中检测的结果为：第三内含子，荧光PGC挑选组插入/缺失突变率为38％(6/16)，对照组插入/缺失突变率为11％(10/93)；第四内含子，荧光PGC挑选组插入/缺失突变率为50％(8/16)，对照组插入/缺失突变率为23％(21/93)。通过荧光PGC挑选，插入/缺失突变率提升至2-3倍。
使用该方法进行基因定向突变不仅限于斑马鱼，本领域技术人员能够参照Saito等Int.J.Dev.Biol.50:691-700(2006)中的记载，通过简单调整的条件和步骤将该方法应用到其他鱼类中，例如黄颡鱼、闪电斑马鱼(Danio albolineatus)、泥鳅、金鱼、青鳉鱼(medaka)、冰虎鱼(ice goby)、青鱼(herring)。
实施例3在黄颡鱼mstna基因与mstnb基因中引入插入缺失突变
锌指核酸酶和转录激活子样效应因子核酸酶作为两个独立的基因组编辑工具，可以分别完成对特定序列的识别和切割。在实验中，可以根据实验的需要选择是分别或者一起对基因组进行编辑。为使本发明简明，本实施例中将特异性识别和切割mstna基因指定位点序列的锌指核酸酶mRNA、特异性识别和切割mstnb基因指定位点序列的转录激活因子样效应物核酸酶mRNA共注射入黄颡鱼胚胎来实施本发明，但是分别用特异性识别和切割mstna基因指定位点序列的锌指核酸酶mRNA或者特异性识别和切割mstnb基因指定位点序列的转录激活因子样效应物核酸酶mRNA对鱼类基因组编辑也是可以的。
1、构建靶向黄颡鱼mstna基因的锌指核酸酶(ZFN)与靶向mstnb基因的转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)
表3.1.构建靶向mstna与mstnb的人工内切酶靶位点序列
mstna-ZFN1左臂cDNA序列(Seq ID No：29)：
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mstna-ZFN1右臂cDNA序列(Seq ID No：30)：
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mstnb-TALEN1左臂cDNA序列(Seq ID No：31)：
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mstnb-TALEN1右臂cDNA序列(Seq ID No：32)：
atggctccaaagaagaagcgtaaggtatacccatacgatgttcctgactatgcgggctatccctatgacgtcccggactatgcaggatcgtatccatatgacgttccagattacgctgctcatggtaccgtggatctacgcacgctcggctacagccagcagcaacaggagaagatcaaaccgaaggttcgttcgacagtggcgcagcaccacgaggcactggtcggccatgggtttacacacgcgcacatcgttgcgctcagccaacacccggcagcgttagggaccgtcgctgtcaagtatcaggacatgatcgcagcgttgccagaggcgacacacgaagcgatcgttggcgtcggcaaacagtggtccggcgcacgcgctctggaggccttgctcacggtggcgggagagttgagaggtccaccgttacagttggacacaggccaacttctcaagattgcaaaacgtggcggcgtgaccgcagtggaggcagtgcatgcatggcgcaatgcactgacgggtgcccccctgaacctgaccccggagcaggtggtggccatcgctAGTCATGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACCGTCCAACGCCTTCTACCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGACTAACCCCAGCGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTAATGGGGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACTGTTCAGCGCCTTCTACCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGCCTGACGCCCGAGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTAACAATGGTGGCAAACAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGCCTACTGCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGTCTGACTCCGGAGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTCATGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACCGTCCAACGCCTTCTACCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGACTAACCCCAGCGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTCATGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACCGTCCAACGCCTTCTACCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGACTAACCCCAGCGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTAATATTGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGCGCCTCCTTCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGACTCACCCCAGATCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTCATGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACCGTCCAACGCCTTCTACCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGACTAACCCCAGCGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTAACAATGGTGGCAAACAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGCCTACTGCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGTCTGACTCCGGAGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTAACAATGGTGGCAAACAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGCCTACTGCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGTCTGACTCCGGAGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTAACAATGGTGGCAAACAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGCCTACTGCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGTCTGACTCCGGAGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTAATGGGGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACTGTTCAGCGCCTTCTACCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGCCTGACGCCCGAGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTAATGGGGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACTGTTCAGCGCCTTCTACCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGCCTGACGCCCGAGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTAACAATGGTGGCAAACAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGCCTACTGCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGTCTGACTCCGGAGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTAACAATGGTGGCAAACAGGCTCTTGAAACCGTACAGCGCCTACTGCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGTCTGACTCCGGAGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTAATGGGGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACTGTTCAGCGCCTTCTACCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGCCTGACGCCCGAGCAAGTTGTAGCGATTGCTAGTCATGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACCGTCCAACGCCTTCTACCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGACTAACCCCAGCGCAAGTTGTAGCGATTGCTagcaatggcggcggcaggccggcgctggagagcattgttgcccagttatctcgccctgatccggcgttggccgcgttgaccaacgaccacctcgtcgccttggcctgcctcggcggacgtcctgcgctggatgcagtgaaaaagggattgccgcacgcgccggccttgatcaaaagaaccaatcgccgtattcccgaacgcacatcccatcgcgttgccggatcccaactagtcaaaagtgaactggaggagaagaaatctgaacttcgtcataaattgaaatatgtgcctcatgaatatattgaattaattgaaattgccagaaatcccactcaggatagaattcttgaaatgaaggtaatggaattttttatgaaagtttatggatatagaggtgagcatttgggtggatcaaggaaaccggacggagcaatttatactgtcggatctcctattgattacggtgtgatcgtggatactaaagcttatagcggaggttataatctgccaattggccaagcacgagaaatgcaacgatatgtcgaagaaaatcaaacacgaaacaaacatatcaaccctaatgaatggtggaaagtctatccatcttctgtaacggaatttaagtttttatttgtgagtggtcactttaaaggaaactacaaagctcagcttacacgattaaatcatatcactaattgtaatggagctgttcttagtgtagaagagcttttaattggtggagaaatgattaaagccggcacattaaccttagaggaagtgagacggaaatttaataacggcgagataaacttttaa
采用实施例1中所述方法制备YFP-nanos3mRNA。使用mMessagemMachine T7Ultra Kit按说明书所述方法分别以mstna-ZFN1左臂cDNA序列、mstna-ZFN1右臂cDNA序列、mstnb-TALEN1左臂cDNA序列和mstnb-TALEN1右臂cDNA序列为模板，体外转录出mstna-ZFN1左臂mRNA、mstna-ZFN1右臂mRNA、mstnb-TALEN1左臂mRNA和mstnb-TALEN1右臂mRNA。
2、在黄颡鱼胚胎中进行显微注射，导入ZFN、TALEN和YFP-nanos3mRNA
在1细胞期黄颡鱼胚胎中共注射mstna-ZFN1、mstnb-TALEN1和YFP-nanos3mRNA，mstna-ZFN1左右臂各100pg,mstnb-TALEN1左右臂各100pg，YFP-nanos mRNA为500pg。
3、在荧光显微镜下挑选PGC细胞中有黄色荧光信号的胚胎
由于注射入黄颡鱼胚胎的核酸是不均匀分布的，有部分胚胎的原生殖细胞中含有较高水平注入的核酸，而其他含有较低水平的注入的核酸。每一批次注射的胚胎发育至48hpf时挑选能在原生殖细胞中观察到YFP荧光信号的胚胎。经过挑选后，我们发现注射后17±9％的胚胎原生殖细胞中可检测到荧光，将它们作为首建者饲养至性成熟。然后收集它们的后代检测可遗传的突变效率。
4、令首建者相互交配获取子一代黄颡鱼
将首建者雌雄各一尾，采用人工授精方法制备受精卵，将获得的受精卵收集到10cm培养皿中，在28.5℃下按标准的黄颡鱼胚胎饲养方案饲养。
5、子一代黄颡鱼的基因型鉴定和品系建立
收取首建者相互交配产生的胚胎，饲养至1月龄后剪取尾鳍，用微量基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
对于在mstna基因与mstnb基因中引入插入缺失突变的研究，采取DNA测序的方法检测靶位点发生插入缺失突变的情况。提取待测的黄颡鱼的基因组DNA，取1μl作为模板，用引物mstna3F(Seq ID No：33)和mstna3R(Seq ID No：34)，扩增mstna的片段。PCR条件为：95℃2分钟，35个循环(94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒)，最后72℃延伸5分钟。PCR产物进行测序验证。
mstnb基因中插入缺失突变的鉴定方法基本同上，PCR使用引物mstnbe2F2(Seq ID No：35)和mstnbe2R2(Seq ID No：36)，将PCR产物进行测序验证。
表3.2.鉴定mstna与mstnb插入缺失突变所用的引物
将鉴定得到的带有插入缺失突变的子一代黄颡鱼饲养至性成熟，使其相互交配，获得纯合突变的子二代黄颡鱼。
在F1代个体中检测的结果为：mstna，荧光PGC挑选组插入/缺失突变率为2％(2/96)，对照组插入/缺失突变率为0.2％(1/500)；mstnb，荧光PGC挑选组插入/缺失突变率为14％(14/96)，对照组插入/缺失突变率为2％(2/96)。通过荧光PGC挑选，插入/缺失突变率提升至7-10倍。
使用该方法进行基因定向突变不仅限于黄颡鱼，本领域技术人员能够参照Saito等Int.J.Dev.Biol.50:691-700(2006)中的记载，通过简单调整的条件和步骤将该方法应用到其他鱼类中，例如斑马鱼、闪电斑马鱼(Danio albolineatus)、泥鳅、金鱼、青鳉鱼、冰虎鱼(ice goby)、青鱼。
以上，基于本发明的实施方式进行了说明，但本发明不限定于此，本领域的技术人员应该明白，在本发明的主旨的范围内能够以进行变形和变更的方式实施，这样的变形和变更的方式，理应属于本发明的保护范围。
Claims (15)
1.一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法，包括：设计特异性识别和切割鱼类基因组指定位点序列的基因组编辑工具、以及与所述指定位点序列相对应、包含敲入外源基因片段的同源供体，使用共显微注射的方法将所述基因组编辑工具、所述同源供体以及在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA导入到鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行胚胎挑选并获得稳定的遗传性状。
2.一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法，包括：设计特异性识别和切割鱼类基因组指定位点序列的基因组编辑工具，使用共显微注射的方法将所述基因组编辑工具与在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA导入到鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行胚胎挑选并获得稳定的遗传性状。
3.如权利要求1-2所述的方法，其中，所述在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA包括保证在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的基因序列和荧光蛋白的基因序列，所述保证原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的基因序列为nanos3基因或者vasa基因的3’非编码区的片段序列。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述nanos3基因的3’非编码区的片段序列如SEQ ID No：9所示，所述vasa基因的3’非编码区的片段序列如SEQ ID No：25所示。
5.如权利要求1-2所述的方法，其中，所述鱼类为斑马鱼、黄颡鱼、闪电斑马鱼、泥鳅、金鱼、青鳉鱼、冰虎鱼和青鱼。
6.如权利要求1-2所述的方法，其中，所述基因组编辑工具是CRISPR/Cas9系统。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9mRNA和sgRNA。
8.如权利要求7所述的方法，其中，注射所述Cas9mRNA/所述sgRNA/所述荧光蛋白mRNA注射的质量比例为5:1:10。
9.如权利要求1-2所述的方法，其中，所述基因组编辑工具是锌指核酸酶mRNA。
10.如权利要求9所述的方法，其中，注射所述锌指核酸酶mRNA与所述荧光蛋白mRNA注射的质量比例为1:5。
11.如权利要求1-2所述的方法，其中，所述基因组编辑工具是激活因子样效应物核酸酶mRNA。
12.如权利要求11所述的方法，其中，注射所述转录激活因子样效应物核酸酶mRNA与所述荧光蛋白mRNA注射的质量比例为1:5。
13.如权利要求1所述的方法，其中，所述基因组指定位点为aldhla2基因的位点，所述敲入外源基因片段为mloxP基因位点的片段。
14.如权利要求1-2所述的方法，其中，所述胚胎处于1细胞期。
15.如权利要求1-2所述的方法，其中，所述胚胎挑选时期为胚胎发育至受精后48小时后进行筛选。
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