CN113789352B - 实现xx/xy性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法及应用 - Google Patents

实现xx/xy性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113789352B
CN113789352B CN202110274642.0A CN202110274642A CN113789352B CN 113789352 B CN113789352 B CN 113789352B CN 202110274642 A CN202110274642 A CN 202110274642A CN 113789352 B CN113789352 B CN 113789352B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fish
sex
cyp17a1
gene
realizing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110274642.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113789352A (zh
Inventor
殷战
翟刚
舒婷婷
贺江燕
娄气永
姜冬火
钱雪桥
石闯
黄建飞
贾景怡
金霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Hydrobiology of CAS
Original Assignee
Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Hydrobiology of CAS filed Critical Institute of Hydrobiology of CAS
Priority to CN202110274642.0A priority Critical patent/CN113789352B/zh
Publication of CN113789352A publication Critical patent/CN113789352A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113789352B publication Critical patent/CN113789352B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K61/00—Culture of aquatic animals
    • A01K61/10—Culture of aquatic animals of fish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/40—Fish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法及应用。该方法通过利用CRISPR/Cas9系统特异性切割鱼类的cyp17a1，阻断鱼类的性类固醇激素合成通路，获得有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼(cyp17a1+/‑)，并进行自交，通过性别标记筛选出XX性别遗传型的F2代cyp17a1纯合子(cyp17a1‑/‑XX)的伪雄鱼，并将其与野生型雌鱼(cyp17a1+/+XX)进行杂交，可获得100％雌性鱼群体(cyp17a1+/‑XX)，从而获得全雌养殖鱼的群体养殖，实现性别控制育种的效果。通过生长对比实验显示，本发明提供的全雌群体8月龄体重比野生型对照群体增加6.60％，有效实现鱼类产量的提高，进而提升养殖效率。本发明提供的方法具有很强的应用性，在XX/XY性别遗传决定型的水产养殖经济鱼类中有广泛的适应性和扩展性。

Description

实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法及应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，还涉及鱼类育种领域，尤其涉及一种实现鱼类性别控制育种的方法及应用。
背景技术
性别控制育种是指人为干预目标物种的性别发育过程，使其后代为符合期望性状的技术。动物的性别控制育种在遗传疾病的机制解析和预防治疗、提高产量和品质、提高抗逆能力等方面具有重要意义。近些年，水产业的食物产生量是众多行业中最快速的。在众多水产物种中，有很多是生长上表现出明显的两性异形，即某一个性别的生长速度显著快于另一个性别，例如鲤的雌性生长显著快于雄性。因此，单性群体的养殖将会带来明显的经济效益。
鱼类的性别决定较哺乳动物具有较高的可重塑性，众多外源激素的处理可诱导性别偏离其自身遗传性别决定系统，例如甲基睾酮在诱导XX雌鱼发育为伪雄鱼的过程中被广泛应用。因此，激素诱导性逆转在大规模生产单性群体中是最为常见的办法。例如：申请号为CN201410560624.9的发明专利公开的一种诱导雌核发育黄姑鱼伪雄鱼的方法。但应用该方法的过程中也由此产生了众多的不良效应，例如激素对水体的污染、激素在鱼体的残留、耗时长、激素关联物诱导的亲鱼性别发育不稳定、无法大规模连续生产等。因此，开发基因编辑的手段进行伪雄性及单性群体的创制等性别控制育种和单性群体养殖方法的研发尤为紧迫。
申请号为CN201910878588.3的发明专利公开了一种在黄颡鱼中双 gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统及应用。所述CRISPR/Cas9 系统包括以下步骤：(1)靶位点1设计在黄颡鱼dmrt1基因第一外显子上，靶位点2设计在第三外显子上；(2)根据步骤(1)的靶位点序列设计引物检测亲鱼中靶位点的准确性，用dmrt1E1F和dmrt1E1R扩增靶位点1及附近序列，用dmrt1E3F和dmrt1E3R扩增靶位点2及附近序列；(3)以 pUC19-gRNA-scaffold质粒为模板，用dmrt1E1gRNA F和gRNA R进行 gRNA1片段的PCR扩增，用dmrt1E3gRNA F和gRNA R进行gRNA2片段的PCR扩增；以上述PCR产物为模板，体外转录并纯化获得gRNA；(4)以pXT7-hCas9线性化质粒为模板，体外转录合成Cas9 mRNA；(5)将Cas9 mRNA 和两个gRNA显微注射到黄颡鱼一细胞期胚胎中；(6)检测突变类型，计算基因编辑率。但是，该方法仅关注了基因编辑的操作和基因编辑率，未进行后代生殖发育方面的表型观察、伪性别的确定、与野生型个体的杂交、以及最终单性群体的构建，即，上述方法未将基因编辑方式与鱼类性别控制以及育种方式之间进行有效结合，所以未能实现鱼类性别控制育种和单性群体养殖。
有鉴于此，有必要设计一种实现鱼类性别控制育种的方法及应用，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法及应用。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法，采用基因编辑技术敲除鱼类中的性类固醇激素合成通路的催化酶编码基因，阻断鱼类的性类固醇激素合成通路，显著降低鱼类雌激素和雄激素的水平，由此制备得到XX性别遗传型的伪雄鱼，再将所述伪雄鱼与野生型雌鱼进行杂交，由此得到全雌群体，实现鱼类性别控制育种和单性群体养殖。
作为本发明的进一步改进，所述性类固醇激素合成通路的催化酶编码基因包括但不限于为cyp17a1、cyp19a1、hsd17b等关键催化酶编码基因中的一种。
作为本发明的进一步改进，所述方法包括如下步骤：
S1，获得cyp17a1基因编辑的注射混合物，并注射至所述鱼类的胚胎中，利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因，得到获得F0代；
S2，将F0代雄鱼与野生型雌鱼进行杂交，获得有效突变的F1代cyp17a1 杂合子鱼，其基因型为cyp17a1+/-；
S3，将所述F1代cyp17a1杂合子鱼进行自交，筛选获得F2代cyp17a1纯合子鱼，其基因型为cyp17a1-/-；
S4，在所述F2代cyp17a1纯合子鱼中，筛选获得无雄性标记的XX性别遗传型的cyp17a1纯合子鱼，其表现为生理雄性，记为伪雄鱼，基因型为cyp17a1-/- XX；
S5，将基因型为cyp17a1+/+XX的野生型雌鱼和基因型为cyp17a1-/-XX的所述伪雄鱼进行人工催产和授精；
S6，经人工催产和授精后，获得的F3代全部是基因型为cyp17a1+/-XX的全雌群体，实现鱼类性别控制育种和单性群体养殖。
作为本发明的进一步改进，所述基因编辑技术为采用CRISPR/Cas9系统特异性切割鱼类的cyp17a1基因，实现鱼类的cyp17a1基因的敲除。
作为本发明的进一步改进，在步骤S1中，所述利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因的具体过程为：
P1，基于CRISPR/Cas9系统，设计鱼类cyp17a1基因编辑靶位点；
P2，根据所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点设计相应的引物，并合成含有所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点的扩增片段的RNA，记为gRNA；
P3，按预定比例配制gRNA、Cas9 mRNA的注射混合物，得到cyp17a1基因编辑的注射混合物，并将所述cyp17a1基因编辑的注射混合物进行鱼类受精卵的显微注射。需要注意的是，此步骤操作也可能由于靶向编辑效率的提升，而直接获得S3所述的cyp17a1纯合子鱼，而省略S2和S3所述的获得cyp17a1+/- 杂合子并自交的步骤。
作为本发明的进一步改进，所述鱼类cyp17a1基因编辑，是利用靶位点设计，将cyp17a1编码的酶功能活性进行破坏；所述编辑靶位点位于cyp17a1基因1号外显子上，分为第一靶位点和第二靶位点，前述两者的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
作为本发明的进一步改进，获得有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼的过程为：对F1代个体进行目的检测片段扩增和测序，检测F1代突变情况，筛选出有效突变的F1代；针对F1代个体进行目的检测片段扩增和测序设计的引物中，正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
作为本发明的进一步改进，在步骤P3，中所述cyp17a1基因编辑的注射混合物中，gRNA浓度为50～150ng/μL；Cas9 mRNA浓度为100～300ng/μL；所述 cyp17a1基因编辑的注射混合物显微注射的体积为0.5～2.0nL。
作为本发明的进一步改进，所述伪雄鱼为具有正常精巢结构和精子发生的雄鱼，但无雄性的第二性征(鳃盖的珠星和胸鳍的结节结构)；所述伪雄鱼的筛选过程为通过性别标记的方式筛选出XX性别遗传型的cyp17a1纯合子鱼。
作为本发明的进一步改进，所述鱼类为水产养殖经济鱼类。
作为本发明的进一步改进，所述鱼类为雄性异配遗传决定型(即，XX/XY 性别遗传决定型)的水产养殖经济鱼类。
作为本发明的进一步改进，所述鱼类为鲤科鱼类。
为实现上述发明目的，本发明还提供了上述实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法的应用。所述实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法在雄性异配遗传决定型水产养殖经济鱼类性别控制育种与单性群体养殖领域中的应用。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供的实现鱼类性别控制育种的方法，采用基因编辑技术敲除鱼类中的性类固醇激素合成通路的催化酶编码基因，阻断鱼类的性类固醇激素合成通路，从而实现其性别控制育种，其中，Cyp17a1是性类固醇激素合成过程中非常重要的催化酶，催化了孕激素到雄激素和雌激素的过程。通过对 Cyp17a1编码基因进行基因编辑，可显著降低雌激素和雄激素的水平；雌激素水平降低，从而阻止其向雌性发育，而雄激素水平仅与雄性的第二性征和生殖行为相关，因此，精巢的发育和精子发生并不会受到影响。通过上述原理，无论其性别遗传型为XX还是XY，cyp17a1纯合子均可发育为具有正常精巢结构和精子发生的雄鱼，但无雄性的第二性征。通过性别标记筛选出XX 性别遗传型的cyp17a1纯合子(cyp17a1-/-XX)，并将其与野生型雌鲤 (cyp17a1+/+XX)杂交，可获得100％雌性群体(cyp17a1+/-XX)，从而达到性别控制育种和单性群体养殖的效果。
2、本发明提供的实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法，将性类固醇激素合成通路的催化酶编码基因在水产养殖鱼类中进行基因编辑，从而实现其性别控制育种和单性群体养殖，以显著提高鱼类的养殖产量，该方法具备可大规模持续获得伪雄亲本，操作简单，能够实现大规模连续生产的优点，有效解决传统鱼类性别控制育种方法所带来的激素对水体的污染、激素在鱼体的残留、耗时长、激素关联物质诱导亲本性别发育不稳定、无法大规模连续生产等的技术问题。同时，本发明提供的方法具有很强的应用性，在水产养殖经济鱼类中有广泛的适应性和扩展性，大大扩展了本发明提供的方法在水产养殖经济鱼类性别控制育种领域中的应用范围。
附图说明
图1为本发明提供的实现鱼类性别控制育种的方法的流程示意图。
图2为本发明提供的cyp17a1基因1号外显子中两个靶位点的示意图(黄色标注序列为靶位点，红色ATG字符为起始密码子)。
图3为本发明提供的cyp17a1基因两个靶位点的gRNA合成后跑胶图(第一个泳道为DNA Marker，第2和3个泳道为合成的gRNA)。
图4为本发明提供的cyp17a1F1代个体突变测序峰图(上图cyp17a1+/+ 为对照组个体突变测序峰图，下图cyp17a1+/-为cyp17a1F1代个体突变测序峰图)。
图5为本发明提供的cyp17a1F2代个体突变测序比对图(cyp17a1+/+为对照组个体突变检测结果，cyp17a1-/-为cyp17a1F2代个体突变检测结果；红色方框为两个靶位点)。
图6为本发明提供的1龄杂合子自交后代中，cyp17a1+/+XY、cyp17a1+/+ XX、cyp17a1-/-XY和cyp17a1-/-XX基因型个体的第二性征观察图(白色箭头和黑色箭头分别为野生型对照组雄鱼鳃盖珠星和胸鳍结节的结构)。
图7为本发明提供的1龄伪雄鲤的解剖图。
图8为本发明提供的对照组和全雌鲤cyp17a1突变检测测序峰图(上图 cyp17a1+/+为对照组突变检测测序峰图，下图cyp17a1+/-为全雌鲤突变检测测序峰图)。
图9为本发明提供的全雌鲤雄性特异基因标记检测图(泳道1-12为野生型对照组样品，泳道13-96为全雌鲤群体样品)。
图10为本发明提供的全雌鲤8月龄性腺组织切片图(共计选取81尾全雌鲤个体进行性腺组织学检测，卵巢结果为100％)。
图11为本发明提供的8月龄全雌群体和野生型对照组同塘养殖的体重对比分析柱状图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本发明提供了一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法，包括如下步骤：
S1，利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因，直接或者间接获得cyp17a1纯合子鱼，其基因型为cyp17a1-/-；
S2，在所述cyp17a1纯合子鱼中，筛选获得XX性别遗传型的cyp17a1纯合子鱼，其表现为生理雄性，记为伪雄鱼，基因型为cyp17a1-/-XX；
S3，将基因型为cyp17a1+/+XX的野生型雌鱼和基因型为cyp17a1-/-XX的所述伪雄鱼进行人工催产和授精；
S4，经人工催产和授精后，获得的F3代全部是基因型为cyp17a1+/-XX的全雌群体，实现鱼类性别控制育种与单性群体的养殖。
优选的，所述基因编辑技术为采用CRISPR/Cas9系统特异性切割鱼类的 cyp17a1基因，实现鱼类cyp17a1基因的敲除；
所述S1中，间接获得cyp17a1纯合子鱼的具体过程为：
S11，利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因，获得F0代；
S12，将F0代雄鱼与野生型雌鱼进行杂交，获得有效突变的F1代cyp17a1 杂合子鱼，其基因型为cyp17a1+/-；
S13，将所述F1代cyp17a1杂合子鱼进行自交，筛选获得F2代cyp17a1纯合子鱼，其基因型为cyp17a1-/-。
优选的，在步骤S1中，所述利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因的具体过程为：
P1，基于CRISPR/Cas9系统，设计鱼类cyp17a1基因编辑靶位点；
P2，根据所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点设计相应的引物，并合成含有所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点的扩增片段的RNA，记为gRNA；
P3，按预定比例配制gRNA、Cas9 mRNA的注射混合物，得到cyp17a1基因编辑的注射混合物，并将所述cyp17a1基因编辑的注射混合物进行鱼类受精卵的显微注射。
优选的，所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点位于cyp17a1基因1号外显子上，分为第一靶位点和第二靶位点，前述两者的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
优选的，获得有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼的过程为：对F1代个体进行目的检测片段扩增和测序，检测F1代突变情况，筛选出有效突变的F1代；针对F1代个体进行目的检测片段扩增和测序设计的引物中，正向引物的序列如 SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，在步骤P3中，所述cyp17a1基因编辑的注射混合物中，gRNA浓度为50～150ng/μL；Cas9 mRNA浓度为100～300ng/μL，cyp17a1基因编辑的注射混合物显微注射的体积为0.5～2.0nL。
优选的，所述伪雄鱼为具有正常精巢结构和精子发生的雄鱼，但无雄性的第二性征；所述伪雄鱼的筛选过程为通过性别标记的方式筛选出XX性别遗传型的cyp17a1纯合子鱼。
优选的，所述鱼类为水产养殖经济鱼类。
优选的，所述鱼类为XX/XY性别遗传决定型的的水产养殖经济鱼类。
优选的，所述鱼类为鲤科鱼类。
实施例1
请参阅图1所示，本发明实施例1提供了一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法，采用鲤鱼为实施鱼类，包括如下步骤：
S1，获得cyp17a1基因编辑的注射混合物，并注射至所述鱼类的胚胎中，利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因，得到获得F0代；具体过程为：
S11，通过应用http://zifit.partners.org/ZiFiT/Disclaimer.aspx在线工具寻找 cyp17a1基因编辑靶位点，基因靶位点位于cyp17a1基因1号外显子上，分为第一靶位点和第二靶位点，前述两者的序列分别为TGGCTTTTCTGTTCATGCC和 CCAAGCCTCCCATCACTCCC(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和图2中标注的序列所示)；
S12，根据所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点设计相应的引物(如表1所示)。利用该引物以pUC19-gRNA-scaffold质粒为模板，合成含有所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点的扩增片段，合成RNA，记为gRNA1和gRNA2；具体为：利用 Thermo公司的TranscriptAid T7HighYield Transcription Kit合成包含上述2个 cyp17a1靶位点的gRNA，分别记为gRNA1和gRNA2，合成后跑琼脂糖凝胶进行检测(如图3所示)，测浓度后，稀释为500ng/μL，置于-80℃备用；
表1为合成cyp17a1的靶位点gRNA1和gRNA2的引物
Figure BDA0002976085980000091
S13，Cas9 mRNA转录自pXT7-Cas9载体，具体为：利用Invitrogen公司的 mMESSAGEmMACHINE mRNA转录合成试剂盒合成Cas9加帽mRNA。测浓度后，稀释为500ng/μL，置于-80℃备用；
S14，配制gRNA和Cas9 mRNA的注射混合物，配制比例如表2所示；
表2为gRNA和Cas9 mRNA的注射混合物
样品 体积(μL)
gRNA1(500ng/μL) 2
gRNA2(500ng/μL) 2
Cas9 mRNA(500ng/μL) 4
水 2
共计 10
S15，将cyp17a1基因编辑的注射混合物利用显微注射仪注射进入1-或2- 细胞的鲤胚胎中，注射体积为1.0nL；
S16，注射后的鱼卵养至性成熟，得到F0代，通过对cyp17a1基因进行特异性切割，实现cyp17a1的基因编辑，造成cyp17a1基因突变。
S2，用注射用复方绒促性素B型将F0代雄鲤鱼与野生型雌鲤鱼催产后人工授精，进行杂交，获得F1代，对F1代基因组进行PCR，检测子代突变情况，引物序列见表3(正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示)；获得有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼，其基因型为cyp17a1+/-，测序结果为在第一个靶点开始产生双峰(如图4所示)。
表3为cyp17a1的靶点突变检测引物
引物名称 引物序列(5’-3’)
Commoncarp-cyp17a1F CCGATGACACTTAGATAGTTG
CommonCarp-cyp17a1R CATGTTGGCTGCAGTGATACTC
S3，将含有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼进行自交，筛选获得F2代 cyp17a1纯合子鱼，其基因型为cyp17a1-/-，测序结果可见在两个靶点均产生有效的基因编辑(如图5所示的方框部分)。
S4，在所述F2代cyp17a1纯合子鱼中均未观察到对照组雄鱼鳃盖珠星和胸鳍结节等雄性第二性征标志(如图6所示)；筛选获得XX性别遗传型的cyp17a1 纯合子鱼，其表现为生理雄性，记为伪雄鱼，基因型为cyp17a1-/-XX；将F2 代中的cyp17a1-/-XX个体进行解剖分析，可见明显精巢结构，发现其已明显发育为雄鱼(如图7所示)。
S5，将基因型为cyp17a1+/+XX的野生型雌鲤鱼和基因型为cyp17a1-/-XX 的所述伪雄鱼进行人工催产和授精。
S6，将人工催产和授精后获得的F3代群体饲养至5日龄可检测到100％为cyp17a1+/-XX基因型的雌鲤(如图8、图9所示)，饲养至8月龄可检测到性腺结构均为卵巢(100％)(如图10所示)，即，得到F3代全雌鲤群体。
对比例1
选择野生型对照群体为对照组，进行生长对比测试。
请参阅图11所示，通过对实施例1提供的全雌群体和对比例1提供的野生型群体进行同塘养殖的生长对比实验，结果表明，在8月龄时检测，实施例1提供的全雌群体组的平均体重比对比例1提供的野生型群体对照组的平均体重高6.60％。
需要注意的是，本领域技术人员应当理解，本发明所提供的方法不仅适用于实施例1中二倍体鲤的育种，还能够适用于其他倍性的水产养殖经济鱼类的性别控制育种和单性群体养殖，尤其是XX/XY性别遗传型的养殖鱼类的性别控制应用，在此不进行穷举。
需要注意的是，本领域技术人员还应当理解，在其他实施方式中，所述性类固醇激素合成通路的催化酶编码基因还可以为cyp19a1、hsd17b等其他关键催化酶编码基因中的一种。通过基因编辑技术对其进行敲除，均能够达到阻断鱼类的性类固醇激素合成通路用以实现鱼类性别控制育种与单性群体养殖的功能，在此不进行穷举。
综上所述，本发明提供了一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法及应用。该方法通过利用CRISPR/Cas9系统特异性切割鱼类的 cyp17a1基因，阻断性类固醇激素信号通路，获得有效突变的F1代cyp17a1 杂合子鱼，并进行自交，或通过提高CRISPR/Cas9系统的工作效率直接获得通过性别标记筛选出的XX遗传决定型的cyp17a1纯合子(cyp17a1-/-XX) 的伪雄鱼，并将其与野生型雌鱼(cyp17a1+/+XX)进行杂交，可获得100％雌性鱼群体(cyp17a1+/-XX)，从而达到性别控制育种和全雌群体养殖的效果。且通过生长对比实验显示，本发明提供的实施案例中，全雌群体8月龄体重比野生型对照群体增加6.60％，有效实现鱼类产量的提高，进而提升生产效率。本发明提供的方法具有很强的应用性，在水产养殖经济鱼类中有广泛的适应性和扩展性，大大扩展了本发明提供的方法在水产养殖经济鱼类性别控制育种领域中的应用范围。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQ ID NO.1
TGGCTTTTCTGTTCATGCC
SEQ ID NO.2
CCAAGCCTCCCATCACTCCC
SEQ ID NO.3
CCGATGACACTTAGATAGTTG
SEQ ID NO.4
CATGTTGGCTGCAGTGATACTC。
序列表
<110> 中国科学院水生生物研究所
<120> 实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法及应用
<141> 2021-03-15
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcttttct gttcatgcc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaagcctcc catcactccc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgatgacac ttagatagtt g 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catgttggct gcagtgatac tc 22

Claims (9)

1.一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法，其特征在于：所述实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法通过阻断鱼类的性类固醇激素合成通路，获得XX性别遗传型的伪雄鱼，再将所述伪雄鱼与野生型雌鱼进行杂交，得到全雌群体，实现鱼类性别控制育种；
所述阻断鱼类的性类固醇激素合成通路的具体方法为：采用基因编辑技术敲除鱼类的性类固醇激素合成通路催化酶编码基因，来阻断鱼类性类固醇激素的合成；
所述性类固醇激素合成通路催化酶编码基因为cyp17a1催化酶编码基因；
所述实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法包括如下步骤：
S1，利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因，直接或者间接获得cyp17a1纯合子鱼，其基因型为cyp17a1-/-；
S2，在所述cyp17a1纯合子鱼中，筛选获得XX性别遗传型的cyp17a1纯合子鱼，其表现为生理雄性，记为伪雄鱼，基因型为cyp17a1-/- XX；
S3，将基因型为cyp17a1+/+ XX的野生型雌鱼和基因型为cyp17a1-/- XX的所述伪雄鱼进行人工催产和授精；
S4，经人工催产和授精后，获得的F3代全部是基因型为cyp17a1+/- XX的全雌群体，实现鱼类性别控制育种与单性群体的养殖；
所述鱼类为雄性异配遗传决定型的水产养殖经济鱼类。
2.根据权利要求1所述的一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法，其特征在于：所述基因编辑技术为采用CRISPR/Cas9系统特异性切割鱼类的cyp17a1基因，实现鱼类cyp17a1基因的敲除；
所述S1中，间接获得cyp17a1纯合子鱼的具体过程为：
S11，利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因，获得F0代；
S12，将F0代雄鱼与野生型雌鱼进行杂交，获得有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼，其基因型为cyp17a1+/-；
S13，将所述F1代cyp17a1杂合子鱼进行自交，筛选获得F2代cyp17a1纯合子鱼，其基因型为cyp17a1-/-。
3.根据权利要求2所述的一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法，其特征在于：在步骤S1中，所述利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因的具体过程为：
P1，基于CRISPR/Cas9系统，设计鱼类cyp17a1基因编辑靶位点；
P2，根据所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点设计相应的引物，并合成含有所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点的扩增片段，记为gRNA；
P3，按预定比例配制gRNA、Cas9 mRNA的注射混合物，得到cyp17a1基因编辑的注射混合物，并将所述cyp17a1基因编辑的注射混合物进行鱼类受精卵的显微注射。
4.根据权利要求3所述的一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法，其特征在于：所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点位于cyp17a1基因1号外显子上，分为第一靶位点和第二靶位点，前述两者的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述鱼类为鲤科鱼类。
5.根据权利要求2述的一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法，其特征在于：获得有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼的过程为：对F1代个体进行目的检测片段扩增和测序，检测F1代突变情况，筛选出有效突变的F1代；针对F1代个体进行目的检测片段扩增和测序设计的引物中，正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ IDNO.4所示。
6.根据权利要求3所述的一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法，其特征在于：在步骤P3中，所述cyp17a1基因编辑的注射混合物中，gRNA浓度为50~150ng/µL；Cas9 mRNA浓度为100~300 ng/µL；所述cyp17a1基因编辑的注射混合物显微注射的体积为0.5~2.0nL。
7.根据权利要求1所述的一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法，其特征在于：所述伪雄鱼为具有正常精巢结构和精子发生的雄鱼，但无雄性的第二性征；所述伪雄鱼的筛选过程为：通过性别标记的方式筛选出XX性别遗传型的cyp17a1纯合子鱼。
8.根据权利要求1所述的一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法，其特征在于：所述鱼类为鲤科鱼类。
9.权利要求1至8中任一项权利要求所述的一种实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法的应用，其特征在于：所述实现XX/XY性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法在雄性异配遗传决定型的水产养殖经济鱼类性别控制育种领域中的应用。
CN202110274642.0A 2021-03-15 2021-03-15 实现xx/xy性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法及应用 Active CN113789352B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110274642.0A CN113789352B (zh) 2021-03-15 2021-03-15 实现xx/xy性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110274642.0A CN113789352B (zh) 2021-03-15 2021-03-15 实现xx/xy性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113789352A CN113789352A (zh) 2021-12-14
CN113789352B true CN113789352B (zh) 2023-03-28

Family

ID=78876834

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110274642.0A Active CN113789352B (zh) 2021-03-15 2021-03-15 实现xx/xy性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113789352B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114686524B (zh) * 2022-06-01 2022-09-30 中山大学 一种利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103798173A (zh) * 2014-03-12 2014-05-21 佛山市南海百容水产良种有限公司 用于黄颡鱼及乌鳢超雄鱼及全雄鱼开发的后裔测定方法
CN109402170A (zh) * 2018-11-01 2019-03-01 湖南文理学院 一种鱼类雄性不育模型的建立方法
CN109964858A (zh) * 2018-02-04 2019-07-05 射阳康余水产技术有限公司 一种诱导黄颡鱼间性鱼产生超雄鱼和全雌配套系的育种方法
WO2020033940A1 (en) * 2018-08-10 2020-02-13 Center For Aquaculture Technologies, Inc. A method of generating sterile and monosex progeny
CN110938626A (zh) * 2019-12-12 2020-03-31 西南大学 奥利亚罗非鱼性染色体特异分子标记及基于该分子标记的遗传性别鉴定和单性鱼生产方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103798173A (zh) * 2014-03-12 2014-05-21 佛山市南海百容水产良种有限公司 用于黄颡鱼及乌鳢超雄鱼及全雄鱼开发的后裔测定方法
CN109964858A (zh) * 2018-02-04 2019-07-05 射阳康余水产技术有限公司 一种诱导黄颡鱼间性鱼产生超雄鱼和全雌配套系的育种方法
WO2020033940A1 (en) * 2018-08-10 2020-02-13 Center For Aquaculture Technologies, Inc. A method of generating sterile and monosex progeny
CN109402170A (zh) * 2018-11-01 2019-03-01 湖南文理学院 一种鱼类雄性不育模型的建立方法
CN110938626A (zh) * 2019-12-12 2020-03-31 西南大学 奥利亚罗非鱼性染色体特异分子标记及基于该分子标记的遗传性别鉴定和单性鱼生产方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lanying Yang 等.Cyp17a1 is Required for Female Sex Determination and Male Fertility by Regulating Sex Steroid Biosynthesis in Fish.《Endocrinology》.2021,第第162卷卷(第第162卷期),1-20. *
梅洁 ; 桂建芳 ; .鱼类性别异形和性别决定的遗传基础及其生物技术操控.中国科学:生命科学.2014,第44卷(第12期),1198-1212. *
郑尧 ; 瞿建宏 ; 邴旭文 ; 陈家长 ; 王在照 ; .高密度养殖彭泽鲫造成雄鱼较多的分子机制及成因分析.上海海洋大学学报.2015,第24卷(第06期),826-833. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113789352A (zh) 2021-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kim et al. CRISPR/Cas9-mediated myostatin disruption enhances muscle mass in the olive flounder Paralichthys olivaceus
CN113817779B (zh) 规模化获得xx/xy性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法及其应用
Abe et al. Retrotransposable elements on the W chromosome of the silkworm, Bombyx mori
CN104195177B (zh) 一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法
JP2021533754A (ja) 不妊および単性子孫の生成方法
JP2010029219A (ja) 動物モデルの開発のための方法
WO2022227692A1 (zh) 一种无肌间刺鲫品系及其培育方法
CN110129455B (zh) 一种生长相关的分子标记在凡纳滨对虾遗传育种中的应用
CN109207607B (zh) 一种与长江水系邗江、瑞昌草鱼生长相关的snp标记
CN111926017A (zh) 一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用
CN110541002A (zh) 一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法
CN111154758A (zh) 敲除斑马鱼slc26a4基因的方法
CN113789352B (zh) 实现xx/xy性别遗传决定型鱼类性别控制育种的方法及应用
CN114774413A (zh) 斑马鱼排卵障碍模型的构建方法、检测方法及应用
CN114438132A (zh) 尼罗罗非鱼mstnb纯合敲除系的建立方法及以此获得的快速生长品系
Wang et al. Artificial gynogenesis and sex control in large yellow croaker
CN106554996B (zh) 一种团头鲂转铁蛋白受体基因snp分子标记及其应用
CN115807037A (zh) 一种遗传可控的四倍体鱼的选育方法及三倍体鱼的制备方法
CN115725746A (zh) 一种乌鳢性别特异分子标记、基于该分子标记的遗传性别鉴定方法和应用
WO1999062333A1 (en) Bacteriophage-based transgenic fish for mutation detection
CN115896176A (zh) 一种多靶位点基因组编辑获得原代100%基因突变黄鳝的方法及应用
CN114686524B (zh) 一种利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法
CN117467709A (zh) 一种弱精症动物模型及其构建方法、应用
JP2004065040A (ja) マウスナノス様遺伝子
Hayes et al. Modern biotechnology and aquaculture

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant