CN117467709A - 一种弱精症动物模型及其构建方法、应用 - Google Patents

一种弱精症动物模型及其构建方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种弱精症动物模型及其构建方法、应用，采用CRISPR‑Cas9技术敲除目标动物基因组上的目标序列后，经杂交繁殖和自交繁殖，得到弱精症动物模型，其中，敲除的目标序列为lrp2bp基因的起始密码子后的第二外显子序列。本发明通过敲除目标动物基因组上的lrp2bp基因，成功制备了表现出弱精子症典型特征的动物模型。由于斑马鱼lrp2bp基因与人LRP2BP基因的序列结构和表达模式类似，因此该动物模型可用于研究人类弱精子症的发病机理以及筛选治疗该类疾病的药物，从而为弱精症领域的研究和治疗提供重要工具。

Description

一种弱精症动物模型及其构建方法、应用
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，且特别涉及一种弱精症动物模型及其构建方法、应用。
背景技术
男性不育问题在世界范围内广泛存在，而弱精症(Oligoasthenozoospermia)作为其中一种主要原因，影响了大量男性的生育能力。精子的运动能力是评价精液质量好坏的常规指标之一，正常情况下只有具有运动能力的精子才可能具有受精能力。在常规临床检测过程中，精子的动力学参数包括平均路径速度(VAP)、平均曲线速度(VCL)、平均直线速度(VSL)、直线性运动(LIN)、前向性运动(STR)及摆动性运动(WOB)等，其中任何一个动力学参数改变都会引起弱精症，严重者将造成不育。
然而，目前对于弱精症的治疗依然具有挑战性。一部分原因在于我们对该疾病的确切病因和病理机制了解不足，另一方面，我们目前缺乏高质量的弱精症动物模型，这也给深入系统地研究弱精症带来了不便。现有的动物模型主要集中在其他生育问题上，而鲜有能够全面模拟弱精症特征的模型存在。因此，亟需研发一种可靠且与人类弱精症相似的动物模型，以深入探究该疾病的发病机制和治疗方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种弱精症动物模型及其构建方法、应用，通过斑马鱼基因组上lrp2bp基因的突变来模拟弱精症的病理特征，该动物模型可供研究人员深入系统地研究弱精症的发病机制，同时也可用于筛选弱精症相关的药物。这一模型的建立有望为弱精症领域的研究和治疗提供重要工具。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种弱精症动物模型的构建方法，采用CRISPR-Cas9技术敲除目标动物基因组上的目标序列后，经杂交繁殖和自交繁殖，得到弱精症动物模型，其中，所述目标序列为所述目标动物基因组上的lrp2bp基因的起始密码子后的第二外显子序列。
本发明提出一种弱精症动物模型，其根据所述的构建方法构建得到。
本发明提出上述的弱精症动物模型在研究弱精症的发病机制中的应用。
本发明提出上述的弱精症动物模型在筛选治疗弱精症的药物中的应用。
本发明提出上述的弱精症动物模型在制备弱精症临床诊断标志物中的应用。
本发明实施例的弱精症动物模型及其构建方法、应用的有益效果是：
本发明通过针对性地敲除目标动物精巢间质细胞中特异表达的lrp2bp基因序列，成功制备了表现出弱精子症典型特征(如精子活力减弱和受精率下降)的动物模型。鉴于斑马鱼lrp2bp基因与人LRP2BP基因的序列结构和表达模式类似，该动物模型具有广泛的应用前景，其可用于研究人类弱精子症的发病机理以及筛选治疗该类疾病的药物，并为该病的临床诊断提供新的标志物，从而为弱精症领域的研究和治疗提供重要工具。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为斑马鱼lrp2bp基因第二外显子部分序列及gRNA靶位点；
图2为野生型斑马鱼和斑马鱼lrp2bp敲除个体基因型鉴定图；
图3为野生型和lrp2bp突变纯合体雄鱼的精子活力对比图；
图4为野生型和lrp2bp突变纯合体雄鱼的受精比例图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的弱精症动物模型及其构建方法、应用进行具体说明。
本发明实施例提供的一种弱精症动物模型的构建方法，采用CRISPR-Cas9技术敲除目标动物基因组上的目标序列后，经杂交繁殖和自交繁殖，得到弱精症动物模型，其中，所述目标序列为所述目标动物基因组上的lrp2bp基因的起始密码子后的第二外显子序列。本发明通过敲除目标实验动物基因组上的特定基因序列，即lrp2bp基因，可获得首个lrp2bp基因敲除的实验动物，即首建动物。然后通过首建动物与野生型的同类动物进行交配，饲养至性成熟，得到lrp2bp基因敲除的杂合体动物，最后将lrp2bp基因敲除的杂合体动物进行自交，筛选出纯合体lrp2bp基因敲除的动物，即可得到弱精症动物模型。
进一步地，在本发明较佳实施例中，所述采用CRISPR-Cas9技术敲除目标动物基因组上的lrp2bp基因的步骤为：设计并合成靶向lrp2bp基因的gRNA，接着将所述gRNA与Cas 9蛋白混合，得到混合物，然后将所述混合物注射到1细胞期动物受精卵中，经发育繁殖后，得到首建动物，其中，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
具体地，将Cas 9的RNA与靶标基因gRNA混合后，利用显微注射的方式注射到1细胞期斑马鱼受精卵的动物极中。其中，Cas 9的RNA与靶标基因gRNA的注射最终浓度分别为200ng/μL和30ng/μL，每个受精卵的注射体积为2nL。针对靶基因lrp2bp第二外显子设计靶点gRNA序列(参照图1所示)，其长度为20bp，序列信息为：
CATAGTGTAACTGTCCCAGG(SEQ ID NO：1)。
进一步地，在本发明较佳实施例中，用于扩增所述gRNA的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明基于SEQ ID NO：1设计了一对敲除引物，上下游引物序列分别为：
引物F：GTAATACGACTCACTATAGGCATAGTGTAACTGTCCCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO：2)；
引物R：AAAAGCACCGACTCGGTGCC(SEQ ID NO：3)。
进一步地，在本发明较佳实施例中，所述杂交繁殖和自交繁殖的步骤为：将所述首建动物与野生型的同类动物进行交配，饲养至性成熟，得到lrp2bp基因敲除的杂合体动物，然后将所述lrp2bp基因敲除的杂合体动物进行自交，筛选出纯合体lrp2bp基因敲除的动物，得到所述弱精症动物模型。
本发明于受精后24小时，取注射后表型正常的胚胎(20～30颗/管)，进行碱裂解、PCR和测序，确定靶位点的突变效率。选取突变效率较高的F0代胚胎养大，至性成熟后，将其与野生型成鱼杂交，取受精后24小时的F1代胚胎，检测靶位点的突变情况。选取可产生有效突变的F0代斑马鱼杂交，大量饲养F1代。将F1代饲养至成鱼后，剪尾鳍进行碱裂解，通过测序手段逐条检测突变体的基因类型，筛选出F1代杂合体。将含相同突变基因型的雌雄斑马鱼混养，饲养至性成熟，杂交产生F2代。经过酶切及测序分析，将F2代个体中四分之一的纯合体选出，用于后续的表型分析。
进一步地，在本发明较佳实施例中，所述目标动物为斑马鱼。斑马鱼作为发育生物学的重要模式生物，因其与人类基因相似度高达87％，近年来被广泛用于建立人类疾病模型等实验中。与哺乳动物类似，斑马鱼的精子发生和运动过程也受到多方面因素共同调控。其中，基因表达调控等遗传因素是一个重要方面。人LRP2BP基因大量表达于精巢组织，在各物种中具有较高的保守性。与人类类似，斑马鱼lrp2bp同样大量表达于精巢组织，暗示该基因在从低等脊椎动物鱼类进化到高等动物人的过程中，其功能具有一定的保守性。
本发明通过LRP2BP基因的突变来模拟弱精症的病理特征，从而得到弱精症动物模型。通过构建弱精症动物模型以期填补该领域的研究空白，为研究和治疗弱精症提供新的平台。该模型具有较高的可靠性和生物学相关性，有望帮助我们更深入地了解弱精症的发病机制，为筛选治疗弱精症的药物提供重要平台，以及为弱精症的临床诊断提供新的标志物，从而显著改善男性不育问题的治疗和管理。
本发明还提供了一种弱精症动物模型，其根据所述的构建方法构建得到。
本发明还提供了一种所述的弱精症动物模型在研究弱精症的发病机制中的应用。
本发明还提供了一种所述的弱精症动物模型在筛选治疗弱精症的药物中的应用。
本发明还提供了一种所述的弱精症动物模型在制备弱精症临床诊断标志物中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种弱精症动物模型的构建方法，包括以下步骤：
一、斑马鱼lrp2bp基因gRNA的设计与合成
根据lrp2bp目标基因序列，在目标基因的正义链或反义链上选择靶位点。可参考如下的靶位点预测网站：http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx。将靶点序列在基因组数据库中进行搜索，确认靶位点是斑马鱼基因组中的唯一位点。根据靶位点序列合成转录用靶位点引物。
1、扩增gRNA转录用模板DNA：
常规PCR反应采用2×Taq Master Mix(Vazyme公司)，在ProFlex PCR system(Applied Biosystems公司)中运行。
按照表1所示，在PCR反应管中分别加入表1中的各试剂，然后按照表2所示的PCR反应条件，在95℃预变性3分钟后，按照以下循环条件重复反应36次：95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸20sec，最后在72℃下终延伸5min。
表1 PCR反应体系(50μL)
表2 PCR反应条件
2、gRNA合成与注射：
将PCR产物加入适量上样缓冲液，使用2％琼脂糖凝胶进行电泳，然后用凝胶成像系统拍照并进行切胶纯化。使用高产率转录试剂盒(Thermo Scientific公司)对胶回收产物进行转录，转录后对RNA样品进行定量，然后将Cas 9的RNA和gRNA以一定的剂量混合，注射到1细胞期斑马鱼胚胎中。
二、lrp2bp基因敲除纯合体的获得
1、于受精后24小时，取注射后表型正常的胚胎(20～30颗/管)，加入50mM氢氧化钠50μL，置于95℃反应20min进行碱裂解，取碱裂解产物作为PCR反应的模板，进行PCR反应，经电泳、切胶纯化后送去测序公司进行测序，以检测靶位点突变效率。
2、选取突变效率较高的F0代胚胎养大，用于后期检测和筛选突变体。将F0代胚胎饲养至性成熟后，将其与野生型成鱼杂交，取受精后24小时的F1代胚胎，进行碱裂解、PCR及切胶纯化以检测靶位点的突变情况。
3、选取可产生有效突变的F0代斑马鱼杂交，大量饲养F1代。将F1代饲养至成鱼后，经剪尾鳍、碱裂解、PCR和切胶纯化过程，并通过测序逐条检测这些突变体的基因类型，筛选出F1代杂合体。将含相同突变基因型的雌雄斑马鱼个体混养，饲养至性成熟后，杂交产生F2代。同样，经上述实验和测序分析过程筛选出F2代个体中的四分之一的纯合个体，用于后续的表型分析。野生型斑马鱼和斑马鱼lrp2bp敲除个体基因型鉴定图如表2所示，其中，WT代表野生型个体基因型，KO代表基因敲除纯合体基因型。
试验例1
本试验例分别对实施例1的lrp2bp基因敲除纯合体的精子活力进行检测，具体步骤为：
随机捞取野生型和突变体雄鱼，用润湿的纱布包住鱼体，同时用纸巾将鱼体生殖孔附近的水分擦拭干净；轻轻挤压鱼体腹部，有白色精液流出后，用枪头吸取精液。在显微镜下观察精液的浓度，并用缓冲液稀释精液，使精子分布均匀。吸取1μL稀释后的精液滴加在干净的载玻片上，加入1μL水激活精子，然后立即将盖玻片盖上，置于显微镜下用仪器配套的辅助精液分析软件记录并分析精子的运动轨迹和精子活力。
如图3所示为野生型和lrp2bp突变纯合体雄鱼的精子活力对比图，图3中，VAP为平均路径速度；VSL为平均直线速度。从图3可以看出，在lrp2bp基因敲除后，VAP和VSL两种精子的运动速度显著下降。
试验例2
本试验例分别对实施例1的lrp2bp基因敲除纯合体的受精能力进行检测，具体步骤为：
随机选取性成熟野生型和突变体斑马鱼个体，置于交配盒中过夜，于第二个光周期灯亮时取下隔板，让雄鱼追逐雌鱼使其自然产卵，并于产卵后30min左右收取受精卵，清水将受精卵洗干净后置于28℃培养箱中培养。在受精后2～3小时内，将受精卵置于体视显微镜下，观察并记录其受精情况。
如图4所示为野生型和lrp2bp突变纯合体雄鱼的受精比例图。从图4可以看出，野生型后代能够完成受精过程，多数胚胎已分裂。然而，在lrp2bp基因敲除后，多数胚胎无法受精。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种弱精症动物模型的构建方法，其特征在于，采用CRISPR-Cas9技术敲除目标动物基因组上的目标序列后，经杂交繁殖和自交繁殖，得到弱精症动物模型，其中，所述目标序列为所述目标动物基因组上的lrp2bp基因的起始密码子后的第二外显子序列。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述采用CRISPR-Cas9技术敲除目标动物基因组上的lrp2bp基因的步骤为：设计并合成靶向lrp2bp基因的gRNA，接着将所述gRNA与Cas 9蛋白混合，得到混合物，然后将所述混合物注射到1细胞期动物受精卵中，经发育繁殖，得到首建动物，其中，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，用于扩增所述gRNA的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述杂交繁殖和自交繁殖的步骤为：将所述首建动物与野生型的同类动物进行交配，饲养至性成熟，得到lrp2bp基因敲除的杂合体动物，然后将所述lrp2bp基因敲除的杂合体动物进行自交，筛选出纯合体lrp2bp基因敲除的动物，得到所述弱精症动物模型。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述目标动物为斑马鱼。
6.一种弱精症动物模型，其特征在于，根据权利要求1～5任意一项所述的构建方法构建得到。
7.一种如权利要求6所述的弱精症动物模型在研究弱精症的发病机制中的应用。
8.一种如权利要求6所述的弱精症动物模型在筛选治疗弱精症的药物中的应用。
9.一种如权利要求6所述的弱精症动物模型在制备弱精症临床诊断标志物中的应用。
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