CN105132427B - 一种以RNA介导的特异性敲除双基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以RNA介导的特异性敲除双基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA。本发明的sgRNA组合由sgRNAMSTN‑1和sgRNAFGF5‑1组成；sgRNAMSTN‑1为能特异靶向修饰绵羊MSTN基因的sgRNA，为序列6第2至21位核苷酸所示的RNA或具有序列6第2至21位核苷酸的RNA；sgRNAFGF5‑1为能特异靶向修饰绵羊FGF5基因的sgRNA，为序列8第2至21位核苷酸所示的RNA或具有序列8第2至21位核苷酸的RNA。本发明将CRISPR/Cas9基因组编辑技术与显微注射技术相结合，不仅使绵羊打靶效率更高更准确，而且在一个世代内首次实现了绵羊双基因敲除，大大促进了绵羊产肉、产毛双性能的改良，为绵羊新品种培育提供了更为广阔的空间和更有效的技术工具。
Description
技术领域
本发明属于动物基因工程领域，涉及CRISPR/Cas9技术，具体涉及一种以RNA介导的特异性敲除双基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA。
背景技术
基因组操作技术是近年基于基因组和基因信息技术发展起来的通过人工设计实现对特定基因或基因组靶位点进行精确编辑的前沿技术，目前已经成为生物医学、农业动物育种和模式动物等领域的研究热点。在动物育种领域，由于传统育种手段的增产潜力已经发挥到接近极限，利用高效稳定的基因组操作技术创新育种手段和提升现代动物育种效率和技术水平，对于育种新材料的创制和品种培育至关重要而且极为迫切。
近年来，科学家们根据细菌获得性免疫的原理，发明了基于CRISPR/Cas9的基因组编辑新技术，不仅大大降低了对动物进行基因敲除、基因修饰的难度，更是将动物转基因技术由传统的随机整合推向了高度精确的基因组定向删除、突变或插入，开创了转基因动物生产的新时代。CRISPR/Cas9系统是一个由核酸和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，它对靶点的识别依赖于核酸对核酸的识别，通过碱基的互补配对完成。打靶一个位点只需要在原有载体的基础上替换20-30bp的核苷酸，相当于合成一对引物，构建过程相对于ZFN和TALEN更加简单快捷，适合规模化、高通量的组装。相比ZFN和TALEN，Cas9介导的基因组编辑其靶标序列的特异性决定于一段小的与靶标序列互补的RNA。这种基于碱基互补配对原则的识别，相比较于蛋白质与DNA之间的相互作用要更加稳定和简单，能够实现一次操作同时突变两个以上基因或位点，大大提高了基因组编辑技术效率。
由于CRISPR/Cas9系统中发挥活性作用的核心部件为sgRNA和蛋白质，因此可以通过构建载体，体外转录获得RNA后，显微注射动物受精卵而获得打靶动物，在整个打靶过程中不存在外源DNA的整合。而且由于mRNA的不稳定性，不会长期存在生物体内，也不会对环境产生进一步影响，因而可以避免传统转基因导致的生物安全问题。也就是说，CRISPR/Cas9技术修饰的是一个物种自身的基因,采取mRNA或RNA作为基因打靶原材料，没有引入任何筛选用抗性基因，因而不存在生物安全性问题。而且，获得的最终产品是经过了遗传修饰的，但终产品里却可以不包含任何转基因的成分，大大提高了安全性。所以，在目前动植物新品种培育，尤其是转基因动物的制备中，CRISPR/Cas9介导的打靶系统被研究者广为采用。
肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)又称GDF-8，属TGF-β超家族成员，是肌肉生长的一种负调控因子，它的活性的降低或丧失，会引起动物肌肉的过度发育，肌纤维直径变大和(或)数量的增加。研究表明，Myostatin基因突变会导致比利时蓝牛、皮尔蒙特牛和荷兰Texel绵羊等牛羊品种中存在一些肌肉肥大显性性状、产肉量明显增加的现象，从而进一步证明了它能够对肌肉生长起负调控作用，也为人们培育产肉量高的优良品种提供了新途径，即通过突变、缺失、敲除等基因打靶技术将该基因失活，为进一步研究其功能并为畜牧业生产中的实际应用奠定扎实基础。
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGFs)是一类调节细胞生长的多功能生长因子。FGF5基因是FGF基因家族中的一员,在毛发生长周期中具有重要的调控作用。有研究表明，FGF5突变可以导致毛发生长周期中生长期的延长，从而使毛发的长度增加。近年来的研究表明FGF5基因可作为影响长毛兔产毛量潜在的主效基因，并且在狗、猫、羊等动物中检测FGF5基因的错义突变、多态性分析的研究，上述研究表明动物的长毛性状与FGF5基因的缺失突变相关。
传统的绵羊品种培育主要是通过基于表型选择的杂交改良等常规育种技术，在一定程度上取得了育种效果。但是常规育种周期长、预见性差、选择效率低，通过常规育种方法在品种改良上所获得的遗传增益日趋平缓，尤其在聚合高产、优质、抗逆等多个优良性状的品种选育方面进展不大，培育新品种的难度也越来越大，而且，在大动物基因组上实现修饰和改造的成本和技术要求仍然很高。新型的CRISPR/Cas9基因组编辑技术通过人工设计的核酸酶，既能够在体内基因组的特定位点实现双链断裂而造成定点突变，也可以在基因组特定的多个位点同时造成双链断裂实现长片段序列的删除、翻转与重复，甚至定点的实现染色体之间的易位，能够实现一次操作同时突变两个以上基因或位点，大大缩短育种的时间，加快育种进程，有望实现优良基因重组和聚合，达到定向选育优质、高产动物新品种的目标。
发明内容
本发明的目的是提供一种以RNA介导的特异性敲除双基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA。
本发明首先提供了一种sgRNA组合，由sgRNAMSTN-1和sgRNAFGF5-1组成；所述sgRNAMSTN-1为能够特异的靶向修饰绵羊MSTN基因的sgRNA，为序列表的序列6自5’末端第2至21位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列6自5’末端第2至21位核苷酸的RNA；所述sgRNAFGF5-1为能够特异的靶向修饰绵羊FGF5基因的sgRNA，为序列表的序列8自5’末端第2至21位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列8自5’末端第2至21位核苷酸的RNA。本发明的实施例中，所述sgRNAMSTN-1具体可为序列表的序列6所示的RNA，所述sgRNAFGF5-1具体可为序列表的序列8所示的RNA。
本发明还保护一种DNA分子组合，由编码所述sgRNAMSTN-1的DNA分子和编码所述sgRNAFGF5-1的DNA分子组成。编码所述sgRNAMSTN-1的DNA分子具体可为序列表的序列5所示的DNA分子。编码所述sgRNAFGF5-1的DNA分子具体可为序列表的序列7所示的DNA分子。
本发明还保护一种能够特异的靶向修饰绵羊MSTN基因的靶向序列，为序列表的序列1自5’末端第4722至4741位核苷酸。
本发明还保护一种能够特异的靶向修饰绵羊FGF5基因的靶向序列，为序列表的序列3自5’末端第335至354位核苷酸。
本发明还保护一种特异性敲除绵羊MSTN基因和绵羊FGF5基因的成套核酸分子，包括所述的sgRNA组合。所述成套核酸分子还可包括Cas9mRNA。所述Cas9mRNA为编码序列表的序列10所示Cas9蛋白的RNA。所述Cas9mRNA具体可为具有序列表的序列11自5’末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具体可为序列表的序列11所示的RNA。
本发明还保护一种特异性敲除绵羊MSTN基因和绵羊FGF5基因的成套核酸分子，包括所述的DNA分子组合。所述成套核酸分子还可包括编码Cas9mRNA的DNA分子。所述Cas9mRNA为编码序列表的序列10所示Cas9蛋白的RNA。所述Cas9mRNA具体可为具有序列表的序列11自5’末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具体可为序列表的序列11所示的RNA。编码Cas9mRNA的DNA分子具体可为具有序列表的序列9自5’末端第24至4295位核苷酸的DNA分子，更具体可为序列表的序列9所示的分子。
本发明还保护一种特异性敲除绵羊MSTN基因和绵羊FGF5基因的方法，是将所述sgRNAMSTN-1、所述sgRNAFGF5-1和Cas9mRNA共转染绵羊细胞，从而敲除绵羊MSTN基因和绵羊FGF5基因。所述Cas9mRNA为编码序列表的序列10所示Cas9蛋白的RNA。所述Cas9mRNA具体可为具有序列表的序列11自5’末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具体可为序列表的序列11所示的RNA。所述共转染的方式具体可为共注射。所述绵羊细胞具体可为绵羊受精卵单细胞。
以上任一所述绵羊MSTN基因可为编码序列表的序列2所示的蛋白质的基因。以上任一所述绵羊MSTN基因具体可为序列表的序列1所示的DNA分子或序列表的序列1自5’末端第1至4991位核苷酸所示的DNA分子。
以上任一所述绵羊FGF5基因可为编码序列表的序列4所示的蛋白质的基因。以上任一所述绵羊FGF5基因具体可为序列表的序列3所示的DNA分子或序列表的序列3自5’末端第268至21110位核苷酸所示的DNA分子。
目前在大动物基因组上实现修饰和改造的成本和技术要求仍然很高，因此获得特异、高效的sgRNA成为绵羊基因组编辑培育的关键。本发明提供的sgRNA特异性较高且能够精确靶向修饰绵羊MSTN基因或FGF5基因，实现基因突变。
本发明中，首次采用CRISPR/Cas9技术在绵羊受精卵中实现双基因的精准修饰突变并获得基因编辑绵羊，利用这种方法不仅构建步骤简单，安全性高，而且大大降低了昂贵的实验成本和缩短实验周期，实现了绵羊优良基因重组和聚合，为绵羊大规模功能基因的分析和验证带来了希望，也为目前和今后绵羊分子细胞工程育种提供安全、精准的新方法。
本发明中，将sgRNA和Cas9mRNA显微注射动物受精卵，在整个打靶过程中不存在外源DNA的整合，而且由于mRNA的不稳定性，不会长期存在于生物体内，也不会对环境产生进一步影响，因而可以避免传统转基因导致的生物安全问题。
本发明将新的CRISPR/Cas9基因组编辑技术与显微注射技术相结合，不仅使绵羊打靶效率更高更准确，而且在一个世代内首次实现了绵羊双基因敲除，大大促进了绵羊产肉、产毛双性能的改良，为绵羊新品种培育提供了更为广阔的空间和更有效的技术工具。
附图说明
图1为限制性内切酶BbsI酶单酶切px330质粒后的1％琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为1kbDNA Marker。
图2为体外转录产物sgRNAMSTN-1至sgRNAMSTN-6的凝胶电泳图；泳道M为RNA Marker,泳道1至6依次为sgRNAMSTN-1至sgRNAMSTN-6。
图3为体外转录产物sgRNAFGF5-1和sgRNAFGF5-2的凝胶电泳图；泳道M为RNA Marker,泳道1和2依次为sgRNAFGF5-1和sgRNAFGF5-2。
图4为Cas9体外酶切法检测MSTN-sgRNA靶点效率的酶切电泳结果，泳道1至6依次为sgRNAMSTN-1至sgRNAMSTN-6相应的酶切电泳结果，泳道MSTN DNA为611bp的MSTN DNA片段，泳道M为DNA Marker。
图5为Cas9体外酶切法检测FGF5-sgRNA靶点效率的酶切电泳结果，泳道1和2分别为sgRNAFGF5-1和sgRNAFGF5-2相应的酶切电泳结果，泳道FGF5DNA为411bp的FGF5DNA片段，泳道M为DNA Marker。
图6为采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对进行PCR扩增的PCR扩增产物的电泳图；泳道M为1kb DNA Marker。
图7为Cas9mRNA的凝胶电泳图；泳道M为RNA Marker。
图8为绵羊胚胎MSTN基因巣式PCR产物和T7EN1酶切的电泳图；A中，1M-62M为试验处理组各个样本靶标基因MSTN的PCR扩增产物，Con1-7为对照处理组各个样本靶标基因MSTN的PCR扩增产物，CK1为裂解液对照，CK2为水对照，泳道M为150bp DNA Marker；B中，1M-62M为试验处理组各个样本靶标基因MSTN的T7EN1酶切产物，Con1-5为对照处理组各个样本靶标基因MSTN的T7EN1酶切产物，CK1为裂解液的T7EN1酶切产物，Positive为靶标基因MSTN的T7EN1酶切产物，Negative为靶标基因MSTN的非T7EN1酶切产物，泳道M为150bp DNAMarker。
图9为绵羊胚胎FGF5基因巣式PCR产物和T7EN1酶切的电泳图；A中，1F-62F为试验处理组各个样本靶标基因FGF5的PCR扩增产物，Con1-2为对照处理组各个样本靶标基因FGF5的PCR扩增产物，CK1为裂解液对照，CK2为水对照，泳道M为150bp DNA Marker；B中，1F-62F为试验处理组各个样本靶标基因FGF5的T7EN1酶切产物，Con1-2为对照处理组各个样本靶标基因FGF5的T7EN1酶切产物，CK1为裂解液的T7EN1酶切产物，Positive为靶标基因FGF5的T7EN1酶切产物，Negative为靶标基因FGF5的非T7EN1酶切产物，泳道M为150bp DNAMarker。
图10为突变胚胎的编辑形式；黑色方框中碱基序列为sgRNA序列，下划线TGG为MSTN基因Cas9打靶的PAM序列；下划线GGG为FGF5基因Cas9打靶的PAM序列。
图11为羔羊MSTN基因巣式PCR产物和T7EN1酶切的电泳图；A为试验处理组出生的18只羔羊靶标基因MSTN的PCR扩增产物和对照处理组出生的羔羊(Con)靶标基因MSTN的PCR扩增产物，泳道M为150bp DNA Marker；B中为试验处理组出生的18只羔羊靶标基因MSTN的T7EN1酶切产物，Positive为靶标基因MSTN的T7EN1酶切产物，Negative为靶标基因MSTN的非T7EN1酶切产物；泳道M为150bp DNA Marker。
图12为羔羊FGF5基因巣式PCR产物和T7EN1酶切的电泳图；A为试验处理组出生的18只羔羊靶标基因MSTN的PCR扩增产物和对照处理组出生的羔羊(Con)靶标基因FGF5的PCR扩增产物，泳道M为150bp DNA Marker；B中为试验处理组出生的18只羔羊靶标基因FGF5的T7EN1酶切产物，Positive为靶标基因FGF5的T7EN1酶切产物，Negative为靶标基因FGF5的非T7EN1酶切产物；泳道M为150bp DNA Marker。
图13为突变羔羊的编辑形式；黑色方框中序列为sgRNA序列，下划线TGG为MSTN基因Cas9打靶的PAM序列；下划线GGG为FGF5基因Cas9打靶的PAM序列。
图14为获得的基因编辑羔羊群体照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明，此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，详见《分子克隆(第三版)》。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。px330质粒：Addgene公司，货号为42330。RNA纯化试剂盒：Life Technologies公司，货号为AM1908。实施例中的相关引物的核苷酸序列见表1和表2(各引物均为单链DNA分子)。
表1MSTN基因相关引物的核苷酸序列
| 引物 | 核苷酸序列(5’→3’) |
| MSTN-CF1 | CACCgACTGTGGATTTTGAAGCTTT |
| MSTN-CR1 | AAACAAAGCTTCAAAATCCACAGTc |
| MSTN-CF2 | CACCgACGACAGCATCGAGATTCTG |
| MSTN-CR2 | AAACCAGAATCTCGATGCTGTCGTc |
| MSTN-CF3 | CACCgCAGACACACCAAAAAGATCT |
| MSTN-CR3 | AAACAGATCTTTTTGGTGTGTCTGc |
| MSTN-CF4 | CACCgGTTACCTTGACTTCTAAAAA |
| MSTN-CR4 | AAACTTTTTAGAAGTCAAGGTAACc |
| MSTN-CF5 | CACCgCTGTCGTTACCCTCTAACTG |
| MSTN-CR5 | AAACCAGTTAGAGGGTAACGACAGc |
| MSTN-CF6 | CACCgTATAAGGCCAATTACTGCTC |
| MSTN-CR6 | AAACGAGCAGTAATTGGCCTTATAc |
| MSTN-TF1 | TTAATACGACTCACTATAGACTGTGGATTTTGAAGCTTT |
| MSTN-TR1 | AAAAGCACCGACTCGGTGCC |
| MSTN-TF2 | TTAATACGACTCACTATAGACGACAGCATCGAGATTCTG |
| MSTN-TR2 | AAAAGCACCGACTCGGTGCC |
| MSTN-TF3 | TTAATACGACTCACTATAGCAGACACACCAAAAAGATCT |
| MSTN-TR3 | AAAAGCACCGACTCGGTGCC |
| MSTN-TF4 | TTAATACGACTCACTATAGGTTACCTTGACTTCTAAAAA |
| MSTN-TR4 | AAAAGCACCGACTCGGTGCC |
| MSTN-TF5 | TTAATACGACTCACTATAGCTGTCGTTACCCTCTAACTG |
| MSTN-TR5 | AAAAGCACCGACTCGGTGCC |
| MSTN-TF6 | TTAATACGACTCACTATAGTATAAGGCCAATTACTGCTC |
| MSTN-TR6 | AAAAGCACCGACTCGGTGCC |
| MSTN-F1 | GTGTCAGGCATTCAGATATTC |
| MSTN-R1 | GCTTGTGCTTAAGTGACTGTAGC |
| MSTN-F2 | AGCGATAAACAAGACAAAGC |
| MSTN-R2 | ATGAGCACCCACAGCGATCTACT |
表2FGF5基因相关引物的核苷酸序列
实施例1、制备sgRNA和Cas9mRNA
一、设计靶序列以及识别靶序列的sgRNA
1、设计绵羊MSTN基因靶序列以及识别靶序列的sgRNA
绵羊MSTN基因部分序列如序列表的序列1所示，自5’末端第1至3位核苷酸为起始密码子，第4989至4991位核苷酸为终止密码子,第4611至4991位核苷酸为外显子3。绵羊MSTN基因编码的蛋白质如序列表的序列2所示。
设计6条sgRNA针对绵羊MSTN基因的靶序列(该靶序列在绵羊MSTN基因的外显子3上)，见表1中MSTN-TF1至MSTN-TF6中斜体部分。
2、设计绵羊FGF5基因靶序列以及识别靶序列的sgRNA
绵羊FGF5基因全长序列如序列表的序列3所示，自5’末端第268至270位核苷酸为起始密码子，第21108至21110位核苷酸为终止密码子,第328至629位核苷酸为外显子1。绵羊FGF5基因编码的蛋白质如序列表的序列4所示。
设计2条sgRNA针对绵羊FGF5基因的靶序列(该靶序列在绵羊FGF5基因的外显子1上)，见表2中FGF5-TF1和FGF5-TF2中斜体部分。
二、制备sgRNAMSTN
1、用限制性内切酶BbsI酶单酶切px330质粒，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳(酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳图见图1)，然后回收并纯化线性化的质粒。
2、将步骤1的纯化产物进行去磷酸化。
3、将引物MSTN-CF1和引物MSTN-CR1退火，得到两端均为粘末端的双链DNA分子。
4、将步骤2的产物与步骤3得到的双链DNA分子连接，得到重组质粒。
5、以步骤4得到的重组质粒为模板，采用引物MSTN-TF1和引物MSTN-TR1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。经测序，PCR扩增产物如序列表的序列5所示。
6、取步骤5得到的PCR扩增产物，利用体外转录试剂盒( T7Kit，Life Technologies公司，货号为AM1354)进行体外转录，然后采用RNA纯化试剂盒纯化回收，得到sgRNAMSTN-1。sgRNAMSTN-1的凝胶电泳图见图2。sgRNAMSTN-1如序列表的序列6所示。
7、参照步骤1至6，
利用引物MSTN-CF2、MSTN-CR2、MSTN-TF2、MSTN-TR2制备sgRNAMSTN-2；
利用引物MSTN-CF3、MSTN-CR3、MSTN-TF3、MSTN-TR3制备sgRNAMSTN-3；
利用引物MSTN-CF4、MSTN-CR4、MSTN-TF4、MSTN-TR4制备sgRNAMSTN-4；
利用引物MSTN-CF5、MSTN-CR5、MSTN-TF5、MSTN-TR5制备sgRNAMSTN-5；
利用引物MSTN-CF6、MSTN-CR6、MSTN-TF6、MSTN-TR6制备sgRNAMSTN-6。
8、采用Cas9体外酶切法检测gRNA靶点效率试剂盒(北京唯尚立德生物科技有限公司，货号为VK007-10-VK007-22)在体外无细胞系统对作用MSTN靶序列的6条sgRNA(sgRNAMSTN-1至sgRNAMSTN-6)的突变效率进行评估预测,结果见图4，筛选到效果最好的sgRNAMSTN-1。
三、制备sgRNAFGF5
1、用限制性内切酶BbsI酶单酶切px330质粒，进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后回收并纯化线性化的质粒。
2、将步骤1的纯化产物进行去磷酸化。
3、将引物FGF5-CF1和引物FGF5-CR1退火，得到两端均为粘末端的双链DNA分子。
4、将步骤2的产物与步骤3得到的双链DNA分子连接，得到重组质粒。
5、以步骤4得到的重组质粒为模板，采用FGF5-TF1和FGF5-TR1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。经测序，PCR扩增产物如序列表的序列7所示。
6、取步骤5得到的PCR扩增产物，利用体外转录试剂盒( T7Kit，Life Technologies公司，货号为AM1354)进行体外转录，然后采用RNA纯化试剂盒纯化回收，得到sgRNAFGF5-1。sgRNAFGF5-1的凝胶电泳图见图3。sgRNAFGF5-1如序列表的序列8所示。
7、参照步骤1至6，
利用引物FGF5-CF1、FGF5-CR1、FGF5-TF1、FGF5-TR1制备sgRNAFGF5-1；
利用引物FGF5-CF2、FGF5-CR2、FGF5-TF2、FGF5-TR2制备sgRNAFGF5-2。
8、采用Cas9体外酶切法检测gRNA靶点效率试剂盒(北京唯尚立德生物科技有限公司，货号为VK007-10-VK007-22)在体外无细胞系统对作用FGF5靶序列的2条sgRNA(sgRNAFGF5-1和sgRNAFGF5-2)的突变效率进行评估预测,结果见图5，筛选到效果最好的sgRNAFGF5-1。
四、制备Cas9mRNA
1、以px330质粒为模板，采用Cas9-F(下划线标注T7启动子)和Cas9-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(4311bp)。PCR扩增产物的电泳图见图6。经测序，PCR扩增产物如序列表的序列9所示。序列表的序列9中，自5’末端第24-4295为Cas9的开放阅读框，编码序列表的序列10所示的Cas9蛋白。
Cas9-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC-3’；
Cas9-R：5’-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3’。
2、取步骤1得到的PCR扩增产物，利用体外转录试剂盒(Life Technologies公司的 T7 Ultra Kit,货号为AM1345)进行体外转录，然后采用RNA纯化试剂盒纯化回收，得到Cas9 mRNA。Cas9 mRNA的凝胶电泳图见图7。Cas9 mRNA如序列表的序列11所示。Cas9 mRNA自5’末端第7至4278位核苷酸为编码区。
实施例2、sgRNA/Cas9 mRNA突变效率检测
一、绵羊受精卵的获得
1、卵母细胞的成熟
从屠宰场采集绵羊卵巢(卵巢来自哈萨克羊)，用生理盐水灭菌清洗3-4次，抽取卵母细胞，用成熟液洗涤3-4次，然后滴入平衡好的成熟液滴(成熟液滴的体积为75-78μl，每滴滴入25-30枚卵母细胞)，放入含5％CO2的38.6℃培养箱中培养(以下培养箱培养均为该相同条件)。
平衡成熟液：将成熟液滴在培养箱中放置2h。成熟液：TCM199培养液+体积百分含量为10％的FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素。
2、卵母细胞的体外受精
(1)将体外成熟24-26h的卵母细胞取出，用0.1％透明质酸酶轻轻吹打以除去颗粒细胞，再用受精液洗涤3次，然后放入平衡好的受精液滴内(每个受精液滴为50-70μl体外受精液，放入20-30枚卵母细胞)。
平衡受精液：将受精液滴在培养箱中放置3-4h。受精液：SOF液+体积百分含量为20％发情羊血清+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素。SOF液：含6.29mg/ml NaCl、0.534mg/ml KCl、0.162mg/ml KH2PO4、0.6μl/ml乳酸钠、0.089mg/ml MgSO4、2.1mg/ml NaHCO3、0.0357mg/ml丙酮酸钠和0.299mg/ml CaCL2·2H2O，溶剂为水。
(2)取冷冻的精液(精液来自哈萨克羊)，水浴解冻，移入平衡好的受精液中，放入培养箱中20-25min(有活力的精子会向上游)，然后吸取上部的精液，以1500rpm的转速离心4-5min，弃去上清液，得到精子沉淀(进行精子计数)。
(3)将步骤(2)得到的精子加入完成步骤(1)的受精液滴中，使精子的浓度为(2-4)×106个/ml，38.6℃静置孵育12-18h，用平衡好的培养液反复吹吸受精卵，然后按50-70枚/孔的密度移入四孔培养板内。
平衡好的培养液的制备方法：将培养液在培养箱中，放置3-4h。培养液：SOF液+3mg/ml BSA。
受精后48h统计卵裂率，第8d统计囊胚率。
二、单细胞期受精卵的显微注射
1、将实施例1制备的sgRNAMSTN-1、sgRNAFGF5-1和Cas9mRNA混合(用Nuclease-freeWater调整终浓度分别为25ng/μL，25ng/μL和100ng/μL)。
2、试验处理：采用NIKON公司的显微注射仪将步骤1得到的混合液注射入步骤一得到的处于单细胞期的受精卵的胞质内(每个受精卵注射80-100pL混合液)，置于培养箱中培养。对照处理：采用NIKON公司的显微注射仪将Nuclease-free Water注射入步骤一得到的处于单细胞期的受精卵胞质内，置于培养箱中培养。
3、胚胎中靶基因编辑效率检测
(1)胚胎样品收集
步骤2中培养7d后，取胚胎，用PBS缓冲液洗涤2遍，然后置于5μL裂解液中，瞬时离心后37℃孵育3h。裂解液：溶剂为Tris-HCl(50mM、pH8.0)，含0.5％(V/V)Triton X-100和1mg/mL Proteinase K。
(2)PCR扩增
以步骤(1)的裂解产物为模板进行巢式PCR。靶序列位于MSTN基因的巣式PCR中，第一轮PCR扩增采用MSTN-F1和MSTN-R1组成的引物对，第二轮PCR扩增采用MSTN-F2和MSTN-R2组成的引物对，巣式PCR产物的电泳图见图8-A(片段长度为611bp)。靶序列位于FGF5基因的巣式PCR中，第一轮PCR扩增采用FGF5-F1和FGF5-R1组成的引物对，第二轮PCR扩增采用FGF5-F1和FGF5-R2组成的引物对，巣式PCR产物的电泳图见图9-A(片段长度为411bp)。
(3)T7核酸内切酶(T7E1)鉴定
分别将步骤(2)得到的对照组和处理组PCR产物等量混合，进行变性退火，形成异源杂交双链。退火程序：95℃ 10min；85℃、75℃、65℃、55℃、45℃、35℃、25℃各1min(降温速率0.3℃/s)；10℃ Pause。
在退火产物中加入T7E1酶(NEB)，37℃孵育30min，酶切产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳。
靶序列位于MSTN基因的结果见图8-B，处理组中发生突变的样品出现两种片段(大约360bp和251bp)，而未发生突变的样品和对照组仅一种片段(611bp)。靶序列位于FGF5基因的结果见图9-B，处理组中发生突变的样品出现两种片段(大约140bp和271bp)，而未发生突变的样品和对照组仅一种片段(411bp)。T7EN1酶切结果表明(见表3)：绵羊胚胎发生MSTN单基因删除/插入突变效率为16.4％，绵羊胚胎发生FGF5单基因删除/插入突变效率为17.2％，绵羊胚胎发生同时发生MSTN和FGF5双基因删除/插入突变效率为42.6％，且双基因敲除对绵羊胚胎发育无致死性，证明DNA分子被Cas9和sgRNA特异性编辑。
表3绵羊受精卵显微注射CRISPR/Cas9mRNA胚胎中MSTN/FGF5基因编辑效率
注：2cell、4cell、8cell、>16cell均代表胚胎发育的不同阶段，具体如下：2cell代表2细胞时期、4cell代表4细胞时期、8cell代表8细胞时期，>16cell代表16细胞时期以后。
(4)TA克隆测序比对
将上述酶切为阳性的PCR产物分别克隆至pMD-19T载体，随机挑取9-10个单克隆测序来精确定位突变位点。发生突变的胚胎的编辑形式见表4(突变类型指的是存在几种突变形式)和图10(序列后的注释形式为“n/m”，n表示该编辑形式数量，m表示所挑取的单克隆总数)。分析结果表明：在绵羊胚胎中能高效特异地靶向修饰MSTN基因、FGF5基因，而且突变的类型主要以大于9bp碱基的删除为主；MSTN基因的突变形式中，100个单克隆中50个克隆发生了突变且切割位点均毗邻PAM序列，50个突变克隆中包含10种突变形式，最长、最短的删除片段分别为54bp、1bp，也有少部分克隆含有单碱基插入，其类型主要以9bp碱基删除为主；FGF5基因的突变形式中,89个单克隆中69个克隆发生了突变且切割位点均毗邻PAM序列，69个突变克隆中包含15种突变形式，其类型主要以大于28bp碱基删除为主。
表4CRISPR/Cas9靶向删除MSTN+FGF5基因胚胎单克隆测序比对结果
实施例3、基因编辑羊的生产
1、实验羊选择
选取体况优良、无繁殖疾病且在2-4岁的新疆细毛羊做供体母羊。选取体重在50kg以上，年龄为2-4岁，膘情好、无繁殖疾病的阿勒泰羊做受体母羊。选取体重在70-85kg，精液检测优良且在1-3岁纯种新疆细毛羊做采精公羊。
2、同期发情与超数排卵
绵羊发情周期内，供体母羊阴道放入CIDR阴道栓，放入CIDR阴道栓的第10天开始以递减的方式连续注射FSH(中国宁波三生公司)，每隔12h注射一次，共3天，总剂量为240单位/只，在第12天早上取出CIDR栓,清洗阴道，并肌肉注射PG 0.1mg(中国宁波三生公司)。撤栓12h后开始用公羊试情，早晚各试情一次，间隔12h，供体母羊发情时注射LH 200IU/只(中国宁波三生公司)。
受体母羊与供体母羊同步埋植CIDR，在供体母羊撤栓前12h撤除CIDR，每只注射330IU PMSG(中国宁波三生公司)，撤栓12h后每天早晚各2次用试情公羊试情，详细记录发情时间。
3、人工授精
人工采精公羊的精液,镜检,活率达0.8以上方可用于输精。对发情12-19h的供体母羊进行人工授精。
4、原核胚的获得
供体母羊输精后19-21h,手术法从输卵管中冲取原核胚。挑选出胞质均匀、形态规则、完整且致密的未卵裂的原核胚(单细胞期)。
5、将实施例1制备的sgRNAMSTN-1、sgRNAFGF5-1和Cas9mRNA混合(用Nuclease-freeWater调整终浓度分别为25ng/μL，25ng/μL和100ng/μL)。
6、试验处理：采用NIKON公司的显微注射仪将步骤5得到的混合液注射入步骤4得到的处于单细胞期的受精卵的胞质内(每个受精卵注射80-100pL混合液)，置于培养箱中培养。
7、胚胎移植及妊娠检测
原核胚卵裂至2-4细胞时，将胚胎移植到同期发情处理的受体母羊的输卵管中，每侧输卵管移植1-2枚胚胎，移植60天后对受体母羊进行B超妊娠诊断。
8、靶向删除MSTN、FGF5基因编辑羊的鉴定
(1)DNA提取及PCR扩增
羔羊出生后一周左右，采集羔羊尾组织样品，提取基因组DNA，以步骤(1)的裂解产物为模板进行PCR。靶序列位于MSTN基因的PCR中，采用MSTN-F2和MSTN-R2组成的引物对。靶序列位于FGF5基因的PCR中，采用FGF5-F1和FGF5-R2组成的引物对。靶序列位于MSTN基因的PCR产物的电泳图见图11-A(片段长度为611bp)。靶序列位于FGF5基因的PCR产物的电泳图见图12-A(片段长度为411bp)。基因编辑羔羊群体照片见图14。
(2)T7核酸内切酶(T7E1)鉴定
方法同实施例2的步骤二的3的(3)。
靶序列位于MSTN基因的结果见图11-B。靶序列位于FGF5基因的结果见图12-B。
(3)PCR产物测序及TA克隆测序比对
方法同实施例2的步骤二的3的(4)。
T7EN1酶切及测序结果表明(见表5)：在生产的18只羔羊中有12只羔羊发生MSTN/FGF5基因删除/插入突变,阳性率高达66.67％，且目前长势良好。
表5绵羊显微注射CRISPR/Cas9mRNA靶向删除MSTN+FGF5产生基因编辑统计结果
发生突变的羔羊测序的结果见图13(序列后的注释形式为“n/m”，n表示该编辑形式数量，m表示所挑取的单克隆总数)。5只羔羊仅发生FGF5基因突变，突变的类型主要以碱基删除为主。7只羔羊同时发生MSTN/FGF5基因突变，MSTN基因的突变形式中，以删除9bp碱基和单碱基插入为主，最长、最短的删除片段分别为9bp、21bp，也有少部分克隆含有单碱基“T”插入。FGF5基因的突变形式中，主要以大于28bp碱基删除为主。上述羔羊检测结果与胚胎检测结果具有一致性，且证实首次获得MSTN、FGF5双基因编辑的绵羊。
Claims (7)
1.sgRNA组合，由sgRNAMSTN-1和sgRNAFGF5-1组成；所述sgRNAMSTN-1为序列表的序列6所示的RNA；所述sgRNAFGF5-1为序列表的序列8所示的RNA。
2.DNA组合，由编码权利要求1中所述sgRNAMSTN-1的DNA分子和编码权利要求1中所述sgRNAFGF5-1的DNA分子组成。
3.如权利要求2所述的DNA组合，其特征在于：
编码权利要求1中所述sgRNAMSTN-1的DNA分子为序列表的序列5所示的DNA分子；
编码权利要求1中所述sgRNAFGF5-1的DNA分子为序列表的序列7所示的DNA分子。
4.一种特异性敲除绵羊MSTN基因和绵羊FGF5基因的成套核酸分子，包括权利要求1所述的sgRNA组合。
5.一种特异性敲除绵羊MSTN基因和绵羊FGF5基因的成套核酸分子，包括权利要求1所述的sgRNA组合和Cas9 mRNA。
6.一种特异性敲除绵羊MSTN基因和绵羊FGF5基因的成套核酸分子，包括权利要求2或3所述的DNA组合。
7.一种特异性敲除绵羊MSTN基因和绵羊FGF5基因的方法，是将权利要求1所述的sgRNA组合和Cas9 mRNA共转染绵羊细胞，从而敲除绵羊的MSTN基因和绵羊FGF5基因。
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