CN112889755A - 一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，包括以下步骤：步骤一：在实验前一天晚上20：00，将两条雄性斑马鱼与两条词性斑马鱼或一对一置于同一个交配盒中，用隔板将两者分开，第二天早上8：30，待到试验药剂准备好后，将隔板打开，将交配盒的水位下降，收集受精的斑马鱼胚胎至培养皿中，用于显微注射或置于28.5℃恒温生化培养箱中培养，每天吸走死卵换水，胚胎的收集一般根据受精的时间，实时的发育阶段进行，用于原位杂交的斑马鱼胚胎须在24hpf左右换入含0.03g/L PTU eggwater，以达到抑制黑色素生成的目的，对要养殖的鱼来说，一般在4pdf在交配盒中饲养，待一个月大，放置系统进行饲养。
Description
技术领域
本发明属于动物模型技术领域，具体涉及一种心血管疾病药物筛选斑马 鱼动物模型的构建方法。
背景技术
Heg1(heart of glass)基因是一种跨膜受体，2003年由John D.Mably在 斑马鱼ENU筛选中鉴定出的一种胚胎隐性致死突变，具有心房心室特异性增 大、血流迟滞的心血管疾病表型，Heg1主要调控心脏与血管细胞—细胞间的 粘附性，在小鼠中研究显示heg1基因突变会导致内皮屏障减弱，引发败血症、 动脉粥样硬化和多发性硬化等心血管疾病，在人类、小鼠和大鼠中均能检测 到heg1的同源基因，这就使得heg1突变体中得到的实验数据应用于人类临 床提供了可能性，CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种精确便捷的基因编辑方式，用于目标基因片段的定点插入、删除、激活，1987年，日本学者首次在 Escherichiacoli染色体上发现的了CRISPR，CRISPR/Cas9是一种由RNA引 导的核酸内切酶，通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的 定点编辑，CRISPR序列在前导区的调控下，转录出RNA前体经一系列加工为 的crRNA，同时转录出反式激活crRNA，与RNaseⅢ—同形成成熟的crRNA， 其中crRNA和tracrRNA部分互补配对形成双链RNA，由于其作用是引导Cas9 靶向切割DNA，随后gRNA和Cas9形成切割复合体，Cas9蛋白识别目的DNA 的PAM位点，gRNA上的序列与基因组DNA序列进行碱基互补配对，随后，复 合体上的Cas9蛋白将gRNA所识别的序列进行切割，造成DNA双链的断裂； RuvC则参与另一条链的切割，最终导致双键断裂，在DNA修复过程中，随机 插入或缺失一部分碱基，产生移码突变或错误修复，从而完成对敲除靶基因 的目的。
但是其在实际使用时，难以得到遗传稳定的心血管畸形斑马鱼突变体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种心血管疾病药物 筛选斑马鱼动物模型的构建方法，以解决上述背景技术中提出的难以得到遗 传稳定的心血管畸形斑马鱼突变体的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种心血管疾病药物筛选 斑马鱼动物模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤一：在实验前一天晚上20：00，将两条雄性斑马鱼与两条词性斑马 鱼或一对一置于同一个交配盒中，用隔板将两者分开，第二天早上8：30，待 到试验药剂准备好后，将隔板打开，将交配盒的水位下降，收集受精的斑马 鱼胚胎至培养皿中，用于显微注射或置于28.5℃恒温生化培养箱中培养，每 天吸走死卵换水，胚胎的收集一般根据受精的时间，实时的发育阶段进行， 用于原位杂交的斑马鱼胚胎须在24hpf左右换入含0.03g/L PTUegg water， 以达到抑制黑色素生成的目的，对要养殖的鱼来说，一般在4pdf在交配盒中饲养，待一个月大，放置系统进行饲养；
步骤二：在显微注射之前，根据实验需要，将体外合成的mRNA， morpholino，DEPC处理水或质粒与适当比例的酚红按照设置好的浓度配置好；
步骤三：将3％的琼脂糖溶于鱼卵水中，在微波炉里融化，冷却至60摄氏 度左右，将大约30ml琼脂糖溶液导入培养皿中，然后将一个特制带有小楔形 孔或带有长条的模具置于琼脂糖溶液上面，待其自然冷却，将磨具在琼脂糖 表面移走，制得用于单细胞显微注射的平板；
步骤四：先用毛刷将胚胎刷入琼脂糖平板的楔形槽中，在显微镜下用毛 刷将胚胎的动物极拨到朝向楔形孔的竖面，显微注射时，将枕头在卵黄一侧 刺入，穿过卵黄，直到细胞中心，然后通过脚踩压力板，将溶液注入细胞中， 依次将朝向排列正确的胚胎注射完毕，将注射后的胚胎收集在鱼卵水中，培 养箱中饲养；
步骤五：将相应时间点的胚胎放入胚胎裂解液中，加入1/40体积的蛋白 酶K，混匀后放入55℃杂交炉14小时，然后在94℃变形蛋白K20分钟，吸取 1ul作为PCR的模板；
步骤六：诱导系统质粒与Tol2mRNA共注射单细胞时期斑马鱼胚胎，构建 转基因鱼群体，然后与野生型斑马鱼交配，进行转基因群体的鉴定，转基因 鱼即为F0群体，然后转基因F0群体与野生型交配产生F1群体，在该群体中， 部分带有绿色荧光，部分为野生型，将F1群体分成两份，一份加入强力霉素 诱导，在胚胎发育时期进行筛选突变体，另一份F1胚胎正常饲养，作为对照 组，并饲养成鱼，用于成鱼再生突变体的筛选，在成鱼尾鳍再生突变体筛选 过程中，首先将各个品系≥10条转基因鱼药物处理15天，隔天换水，在第十 六天进行尾鳍切除手术，并在药物处理下再生10天，筛选再生障碍突变体；
步骤七：最后，突变体的重复及确认，经过F1代胚胎与成鱼突变体的筛 选，我们在F2代进行了重复与确认，大致为：F1代具有潜在表型的转基因鱼 品系，与野生型交配，产生F2胚胎，利用相同的筛选方法在F2代进行胚胎 与成鱼尾鳍再生突变体筛选，对F1代突变体进行确认，并通过其他实验方法 验证。
优选的，所述步骤一中，为了防止霉菌产生，在鱼卵水中加入0.03mM亚 甲基蓝。
优选的，所述步骤一中，在交配盒中饲养斑马鱼时，向交配盒中的斑马 鱼喂食草履虫。
优选的，所述步骤一中，为了降低强力霉素对斑马鱼胚胎的伤害，在该 研究中，所有胚胎处理时间为12hpf，药物处理浓度为20-40ug/ml，并置于黑 暗处培养，成鱼诱导处理：3个月左右大小的成鱼，在药物浓度60ug/ml的浓 度下至少处理15天，并且置于黑暗处饲养，隔天换水，15dpa，取样进行各种 实验。
优选的，所述步骤二中，酚红的作用主要是对注射过的胚胎进行标记， 避免重复注射。
优选的，所述的一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法， 其特征在于：所述步骤六中，在F1胚胎筛选过程中，当筛选到表型时，将转 基因鱼挑出，提取基因组，利用LM-PCR方法鉴定插入位置，并进行后续验证 工作。
与现有技术相比，本发明提供了一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模 型的构建方法，具备以下有益效果：
1、本发明通过使用斑马鱼作为模式生物，斑马鱼的成鱼个体小，占用空 间小，便于大规模养殖，斑马鱼的成鱼体长3-4厘米，雄鱼修长健硕，雌鱼圆 润肥大，一升水中可以饲养5条成鱼，占用空间小，并且便于饲养；
2、本发明通过使用斑马鱼作为模式生物，斑马鱼的发育速度快，性成熟 时间短，产卵多，繁殖能力强，斑马鱼胚胎发育速度快，24小时，主要的各 个组织、器官原基已经形成，在适宜的温度，饲养条件好的情况下，从出生 到性成熟只需要3个月的时间，雌雄鱼交配受光刺激，因此可以通过控制光周 期来控制斑马鱼的产卵，一条雌鱼可以产卵多达200-300枚，能够满足各个学 科实验上的需求；
3、本发明通过使用斑马鱼作为模式生物，斑马鱼的胚胎体外透明发育， 易于观察操作，斑马鱼属于体外受精，胚胎体外发育并且透明，便于观察胚 胎发育的各个时期，受精卵较大，方便进行显微注射，较成熟完善的遗传操 作技术，针对斑马鱼模式生物，研究学者已经设计研究出了很多比较完善的 操作仪器，并且在功能基因组学方面，一系列的技术，如显微注射技术、转 基因技术、过表达技术、反义寡核苷酸抑制基因表达技术，定点突变技术已 经成熟；
4、本发明通过使用斑马鱼作为模式生物，斑马鱼的基因组测序已经完成， 多种成熟有效的正向遗传学手段应用于突变体的筛选，便于研究基因功能， 品系资源丰富，正因为以上优点，斑马鱼已经成为发育生物学、分子生物学、 神经生物学不可或缺的一种脊椎动物模型。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显 然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施 例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性 劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的 构建方法，包括以下步骤：
步骤一：在实验前一天晚上20：00，将两条雄性斑马鱼与两条词性斑马 鱼或一对一置于同一个交配盒中，用隔板将两者分开，第二天早上8：30，待 到试验药剂准备好后，将隔板打开，将交配盒的水位下降，收集受精的斑马 鱼胚胎至培养皿中，用于显微注射或置于28.5℃恒温生化培养箱中培养，每 天吸走死卵换水，胚胎的收集一般根据受精的时间，实时的发育阶段进行， 用于原位杂交的斑马鱼胚胎须在24hpf左右换入含0.03g/L PTUegg water， 以达到抑制黑色素生成的目的，对要养殖的鱼来说，一般在4pdf在交配盒中饲养，待一个月大，放置系统进行饲养；
步骤二：在显微注射之前，根据实验需要，将体外合成的mRNA， morpholino，DEPC处理水或质粒与适当比例的酚红按照设置好的浓度配置好；
步骤三：将3％的琼脂糖溶于鱼卵水中，在微波炉里融化，冷却至60摄氏 度左右，将大约30ml琼脂糖溶液导入培养皿中，然后将一个特制带有小楔形 孔或带有长条的模具置于琼脂糖溶液上面，待其自然冷却，将磨具在琼脂糖 表面移走，制得用于单细胞显微注射的平板；
步骤四：先用毛刷将胚胎刷入琼脂糖平板的楔形槽中，在显微镜下用毛 刷将胚胎的动物极拨到朝向楔形孔的竖面，显微注射时，将枕头在卵黄一侧 刺入，穿过卵黄，直到细胞中心，然后通过脚踩压力板，将溶液注入细胞中， 依次将朝向排列正确的胚胎注射完毕，将注射后的胚胎收集在鱼卵水中，培 养箱中饲养；
步骤五：将相应时间点的胚胎放入胚胎裂解液中，加入1/40体积的蛋白 酶K，混匀后放入55℃杂交炉14小时，然后在94℃变形蛋白K20分钟，吸取 1ul作为PCR的模板；
步骤六：诱导系统质粒与Tol2mRNA共注射单细胞时期斑马鱼胚胎，构建 转基因鱼群体，然后与野生型斑马鱼交配，进行转基因群体的鉴定，转基因 鱼即为F0群体，然后转基因F0群体与野生型交配产生F1群体，在该群体中， 部分带有绿色荧光，部分为野生型，将F1群体分成两份，一份加入强力霉素 诱导，在胚胎发育时期进行筛选突变体，另一份F1胚胎正常饲养，作为对照 组，并饲养成鱼，用于成鱼再生突变体的筛选，在成鱼尾鳍再生突变体筛选 过程中，首先将各个品系≥10条转基因鱼药物处理15天，隔天换水，在第十 六天进行尾鳍切除手术，并在药物处理下再生10天，筛选再生障碍突变体；
步骤七：最后，突变体的重复及确认，经过F1代胚胎与成鱼突变体的筛 选，我们在F2代进行了重复与确认，大致为：F1代具有潜在表型的转基因鱼 品系，与野生型交配，产生F2胚胎，利用相同的筛选方法在F2代进行胚胎 与成鱼尾鳍再生突变体筛选，对F1代突变体进行确认，并通过其他实验方法 验证。
本发明中，优选的，步骤一中，为了防止霉菌产生，在鱼卵水中加入0.03mM 亚甲基蓝。
本发明中，优选的，步骤一中，在交配盒中饲养斑马鱼时，向交配盒中 的斑马鱼喂食草履虫。
本发明中，优选的，步骤一中，为了降低强力霉素对斑马鱼胚胎的伤害， 在该研究中，所有胚胎处理时间为12hpf，药物处理浓度为20-40ug/ml，并 置于黑暗处培养，成鱼诱导处理：3个月左右大小的成鱼，在药物浓度60ug/ml 的浓度下至少处理15天，并且置于黑暗处饲养，隔天换水，15dpa，取样进 行各种实验。
本发明中，优选的，步骤二中，酚红的作用主要是对注射过的胚胎进行 标记，避免重复注射。
本发明中，优选的，的一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建 方法，其特征在于：所述步骤六中，在F1胚胎筛选过程中，当筛选到表型时， 将转基因鱼挑出，提取基因组，利用LM-PCR方法鉴定插入位置，并进行后续 验证工作。
实施例一
一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤一：在实验前一天晚上20：00，将两条雄性斑马鱼与两条词性斑马 鱼或一对一置于同一个交配盒中，用隔板将两者分开，第二天早上8：30，待 到试验药剂准备好后，将隔板打开，将交配盒的水位下降，收集受精的斑马 鱼胚胎至培养皿中，用于显微注射或置于28.5℃恒温生化培养箱中培养，每 天吸走死卵换水，胚胎的收集一般根据受精的时间，实时的发育阶段进行， 用于原位杂交的斑马鱼胚胎须在24hpf左右换入含0.03g/L PTUegg water， 以达到抑制黑色素生成的目的，对要养殖的鱼来说，一般在4pdf在交配盒中饲养，待一个月大，放置系统进行饲养；
步骤二：在显微注射之前，根据实验需要，将体外合成的mRNA， morpholino，DEPC处理水或质粒与适当比例的酚红按照设置好的浓度配置好；
步骤三：将3％的琼脂糖溶于鱼卵水中，在微波炉里融化，冷却至60摄氏 度左右，将大约30ml琼脂糖溶液导入培养皿中，然后将一个特制带有小楔形 孔或带有长条的模具置于琼脂糖溶液上面，待其自然冷却，将磨具在琼脂糖 表面移走，制得用于单细胞显微注射的平板；
步骤四：先用毛刷将胚胎刷入琼脂糖平板的楔形槽中，在显微镜下用毛 刷将胚胎的动物极拨到朝向楔形孔的竖面，显微注射时，将枕头在卵黄一侧 刺入，穿过卵黄，直到细胞中心，然后通过脚踩压力板，将溶液注入细胞中， 依次将朝向排列正确的胚胎注射完毕，将注射后的胚胎收集在鱼卵水中，培 养箱中饲养；
步骤五：将相应时间点的胚胎放入胚胎裂解液中，加入1/40体积的蛋白 酶K，混匀后放入55℃杂交炉14小时，然后在94℃变形蛋白K20分钟，吸取 1ul作为PCR的模板；
步骤六：诱导系统质粒与Tol2mRNA共注射单细胞时期斑马鱼胚胎，构建 转基因鱼群体，然后与野生型斑马鱼交配，进行转基因群体的鉴定，转基因 鱼即为F0群体，然后转基因F0群体与野生型交配产生F1群体，在该群体中， 部分带有绿色荧光，部分为野生型，将F1群体分成两份，一份加入强力霉素 诱导，在胚胎发育时期进行筛选突变体，另一份F1胚胎正常饲养，作为对照 组，并饲养成鱼，用于成鱼再生突变体的筛选，在成鱼尾鳍再生突变体筛选 过程中，首先将各个品系≥10条转基因鱼药物处理15天，隔天换水，在第十 六天进行尾鳍切除手术，并在药物处理下再生10天，筛选再生障碍突变体；
步骤七：最后，突变体的重复及确认，经过F1代胚胎与成鱼突变体的筛 选，我们在F2代进行了重复与确认，大致为：F1代具有潜在表型的转基因鱼 品系，与野生型交配，产生F2胚胎，利用相同的筛选方法在F2代进行胚胎 与成鱼尾鳍再生突变体筛选，对F1代突变体进行确认，并通过其他实验方法 验证。
步骤一中，为了防止霉菌产生，在鱼卵水中加入0.03mM亚甲基蓝。
步骤一中，在交配盒中饲养斑马鱼时，向交配盒中的斑马鱼喂食草履虫。
步骤一中，为了降低强力霉素对斑马鱼胚胎的伤害，在该研究中，所有 胚胎处理时间为12hpf，药物处理浓度为20ug/ml，并置于黑暗处培养，成鱼 诱导处理：3个月左右大小的成鱼，在药物浓度60ug/ml的浓度下至少处理 15天，并且置于黑暗处饲养，隔天换水，15dpa，取样进行各种实验。
步骤二中，酚红的作用主要是对注射过的胚胎进行标记，避免重复注射。
步骤六中，在F1胚胎筛选过程中，当筛选到表型时，将转基因鱼挑出， 提取基因组，利用LM-PCR方法鉴定插入位置，并进行后续验证工作。
实施例二
一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤一：在实验前一天晚上20：00，将两条雄性斑马鱼与两条词性斑马 鱼或一对一置于同一个交配盒中，用隔板将两者分开，第二天早上8：30，待 到试验药剂准备好后，将隔板打开，将交配盒的水位下降，收集受精的斑马 鱼胚胎至培养皿中，用于显微注射或置于28.5℃恒温生化培养箱中培养，每 天吸走死卵换水，胚胎的收集一般根据受精的时间，实时的发育阶段进行， 用于原位杂交的斑马鱼胚胎须在24hpf左右换入含0.03g/L PTUegg water， 以达到抑制黑色素生成的目的，对要养殖的鱼来说，一般在4pdf在交配盒中饲养，待一个月大，放置系统进行饲养；
步骤二：在显微注射之前，根据实验需要，将体外合成的mRNA， morpholino，DEPC处理水或质粒与适当比例的酚红按照设置好的浓度配置好；
步骤三：将3％的琼脂糖溶于鱼卵水中，在微波炉里融化，冷却至60摄氏 度左右，将大约30ml琼脂糖溶液导入培养皿中，然后将一个特制带有小楔形 孔或带有长条的模具置于琼脂糖溶液上面，待其自然冷却，将磨具在琼脂糖 表面移走，制得用于单细胞显微注射的平板；
步骤四：先用毛刷将胚胎刷入琼脂糖平板的楔形槽中，在显微镜下用毛 刷将胚胎的动物极拨到朝向楔形孔的竖面，显微注射时，将枕头在卵黄一侧 刺入，穿过卵黄，直到细胞中心，然后通过脚踩压力板，将溶液注入细胞中， 依次将朝向排列正确的胚胎注射完毕，将注射后的胚胎收集在鱼卵水中，培 养箱中饲养；
步骤五：将相应时间点的胚胎放入胚胎裂解液中，加入1/40体积的蛋白 酶K，混匀后放入55℃杂交炉14小时，然后在94℃变形蛋白K20分钟，吸取 1ul作为PCR的模板；
步骤六：诱导系统质粒与Tol2mRNA共注射单细胞时期斑马鱼胚胎，构建 转基因鱼群体，然后与野生型斑马鱼交配，进行转基因群体的鉴定，转基因 鱼即为F0群体，然后转基因F0群体与野生型交配产生F1群体，在该群体中， 部分带有绿色荧光，部分为野生型，将F1群体分成两份，一份加入强力霉素 诱导，在胚胎发育时期进行筛选突变体，另一份F1胚胎正常饲养，作为对照 组，并饲养成鱼，用于成鱼再生突变体的筛选，在成鱼尾鳍再生突变体筛选 过程中，首先将各个品系≥10条转基因鱼药物处理15天，隔天换水，在第十 六天进行尾鳍切除手术，并在药物处理下再生10天，筛选再生障碍突变体；
步骤七：最后，突变体的重复及确认，经过F1代胚胎与成鱼突变体的筛 选，我们在F2代进行了重复与确认，大致为：F1代具有潜在表型的转基因鱼 品系，与野生型交配，产生F2胚胎，利用相同的筛选方法在F2代进行胚胎 与成鱼尾鳍再生突变体筛选，对F1代突变体进行确认，并通过其他实验方法 验证。
步骤一中，为了防止霉菌产生，在鱼卵水中加入0.03mM亚甲基蓝。
步骤一中，在交配盒中饲养斑马鱼时，向交配盒中的斑马鱼喂食草履虫。
步骤一中，为了降低强力霉素对斑马鱼胚胎的伤害，在该研究中，所有 胚胎处理时间为12hpf，药物处理浓度为30ug/ml，并置于黑暗处培养，成鱼 诱导处理：3个月左右大小的成鱼，在药物浓度60ug/ml的浓度下至少处理 15天，并且置于黑暗处饲养，隔天换水，15dpa，取样进行各种实验。
步骤二中，酚红的作用主要是对注射过的胚胎进行标记，避免重复注射。
步骤六中，在F1胚胎筛选过程中，当筛选到表型时，将转基因鱼挑出， 提取基因组，利用LM-PCR方法鉴定插入位置，并进行后续验证工作。
实施例三
一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤一：在实验前一天晚上20：00，将两条雄性斑马鱼与两条词性斑马 鱼或一对一置于同一个交配盒中，用隔板将两者分开，第二天早上8：30，待 到试验药剂准备好后，将隔板打开，将交配盒的水位下降，收集受精的斑马 鱼胚胎至培养皿中，用于显微注射或置于28.5℃恒温生化培养箱中培养，每 天吸走死卵换水，胚胎的收集一般根据受精的时间，实时的发育阶段进行， 用于原位杂交的斑马鱼胚胎须在24hpf左右换入含0.03g/L PTUegg water， 以达到抑制黑色素生成的目的，对要养殖的鱼来说，一般在4pdf在交配盒中饲养，待一个月大，放置系统进行饲养；
步骤二：在显微注射之前，根据实验需要，将体外合成的mRNA， morpholino，DEPC处理水或质粒与适当比例的酚红按照设置好的浓度配置好；
步骤三：将3％的琼脂糖溶于鱼卵水中，在微波炉里融化，冷却至60摄氏 度左右，将大约30ml琼脂糖溶液导入培养皿中，然后将一个特制带有小楔形 孔或带有长条的模具置于琼脂糖溶液上面，待其自然冷却，将磨具在琼脂糖 表面移走，制得用于单细胞显微注射的平板；
步骤四：先用毛刷将胚胎刷入琼脂糖平板的楔形槽中，在显微镜下用毛 刷将胚胎的动物极拨到朝向楔形孔的竖面，显微注射时，将枕头在卵黄一侧 刺入，穿过卵黄，直到细胞中心，然后通过脚踩压力板，将溶液注入细胞中， 依次将朝向排列正确的胚胎注射完毕，将注射后的胚胎收集在鱼卵水中，培 养箱中饲养；
步骤五：将相应时间点的胚胎放入胚胎裂解液中，加入1/40体积的蛋白 酶K，混匀后放入55℃杂交炉14小时，然后在94℃变形蛋白K20分钟，吸取1ul作为PCR的模板；
步骤六：诱导系统质粒与Tol2mRNA共注射单细胞时期斑马鱼胚胎，构建 转基因鱼群体，然后与野生型斑马鱼交配，进行转基因群体的鉴定，转基因 鱼即为F0群体，然后转基因F0群体与野生型交配产生F1群体，在该群体中， 部分带有绿色荧光，部分为野生型，将F1群体分成两份，一份加入强力霉素 诱导，在胚胎发育时期进行筛选突变体，另一份F1胚胎正常饲养，作为对照 组，并饲养成鱼，用于成鱼再生突变体的筛选，在成鱼尾鳍再生突变体筛选 过程中，首先将各个品系≥10条转基因鱼药物处理15天，隔天换水，在第十 六天进行尾鳍切除手术，并在药物处理下再生10天，筛选再生障碍突变体；
步骤七：最后，突变体的重复及确认，经过F1代胚胎与成鱼突变体的筛 选，我们在F2代进行了重复与确认，大致为：F1代具有潜在表型的转基因鱼 品系，与野生型交配，产生F2胚胎，利用相同的筛选方法在F2代进行胚胎 与成鱼尾鳍再生突变体筛选，对F1代突变体进行确认，并通过其他实验方法 验证。
步骤一中，为了防止霉菌产生，在鱼卵水中加入0.03mM亚甲基蓝。
步骤一中，在交配盒中饲养斑马鱼时，向交配盒中的斑马鱼喂食草履虫。
步骤一中，为了降低强力霉素对斑马鱼胚胎的伤害，在该研究中，所有 胚胎处理时间为12hpf，药物处理浓度为40ug/ml，并置于黑暗处培养，成鱼 诱导处理：3个月左右大小的成鱼，在药物浓度60ug/ml的浓度下至少处理 15天，并且置于黑暗处饲养，隔天换水，15dpa，取样进行各种实验。
步骤二中，酚红的作用主要是对注射过的胚胎进行标记，避免重复注射。
步骤六中，在F1胚胎筛选过程中，当筛选到表型时，将转基因鱼挑出， 提取基因组，利用LM-PCR方法鉴定插入位置，并进行后续验证工作。
综上所述，当药物处理浓度为30ug/ml时，筛选出的一穿稳定的心血管 畸形斑马鱼突变体最多，最多为4个。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而 言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限 定。
Claims (6)
1.一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：在实验前一天晚上20：00，将两条雄性斑马鱼与两条词性斑马鱼或一对一置于同一个交配盒中，用隔板将两者分开，第二天早上8：30，待到试验药剂准备好后，将隔板打开，将交配盒的水位下降，收集受精的斑马鱼胚胎至培养皿中，用于显微注射或置于28.5℃恒温生化培养箱中培养，每天吸走死卵换水，胚胎的收集一般根据受精的时间，实时的发育阶段进行，用于原位杂交的斑马鱼胚胎须在24hpf左右换入含0.03g/L PTU egg water，以达到抑制黑色素生成的目的，对要养殖的鱼来说，一般在4pdf在交配盒中饲养，待一个月大，放置系统进行饲养；
步骤二：在显微注射之前，根据实验需要，将体外合成的mRNA，morpholino，DEPC处理水或质粒与适当比例的酚红按照设置好的浓度配置好；
步骤三：将3％的琼脂糖溶于鱼卵水中，在微波炉里融化，冷却至60摄氏度左右，将大约30ml琼脂糖溶液导入培养皿中，然后将一个特制带有小楔形孔或带有长条的模具置于琼脂糖溶液上面，待其自然冷却，将磨具在琼脂糖表面移走，制得用于单细胞显微注射的平板；
步骤四：先用毛刷将胚胎刷入琼脂糖平板的楔形槽中，在显微镜下用毛刷将胚胎的动物极拨到朝向楔形孔的竖面，显微注射时，将枕头在卵黄一侧刺入，穿过卵黄，直到细胞中心，然后通过脚踩压力板，将溶液注入细胞中，依次将朝向排列正确的胚胎注射完毕，将注射后的胚胎收集在鱼卵水中，培养箱中饲养；
步骤五：将相应时间点的胚胎放入胚胎裂解液中，加入1/40体积的蛋白酶K，混匀后放入55℃杂交炉14小时，然后在94℃变形蛋白K20分钟，吸取1ul作为PCR的模板；
步骤六：诱导系统质粒与Tol2mRNA共注射单细胞时期斑马鱼胚胎，构建转基因鱼群体，然后与野生型斑马鱼交配，进行转基因群体的鉴定，转基因鱼即为F0群体，然后转基因F0群体与野生型交配产生F1群体，在该群体中，部分带有绿色荧光，部分为野生型，将F1群体分成两份，一份加入强力霉素诱导，在胚胎发育时期进行筛选突变体，另一份F1胚胎正常饲养，作为对照组，并饲养成鱼，用于成鱼再生突变体的筛选，在成鱼尾鳍再生突变体筛选过程中，首先将各个品系≥10条转基因鱼药物处理15天，隔天换水，在第十六天进行尾鳍切除手术，并在药物处理下再生10天，筛选再生障碍突变体；
步骤七：最后，突变体的重复及确认，经过F1代胚胎与成鱼突变体的筛选，我们在F2代进行了重复与确认，大致为：F1代具有潜在表型的转基因鱼品系，与野生型交配，产生F2胚胎，利用相同的筛选方法在F2代进行胚胎与成鱼尾鳍再生突变体筛选，对F1代突变体进行确认，并通过其他实验方法验证。
2.根据权利要求1所述的一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤一中，为了防止霉菌产生，在鱼卵水中加入0.03mM亚甲基蓝。
3.根据权利要求1所述的一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤一中，在交配盒中饲养斑马鱼时，向交配盒中的斑马鱼喂食草履虫。
4.根据权利要求1所述的一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤一中，为了降低强力霉素对斑马鱼胚胎的伤害，在该研究中，所有胚胎处理时间为12hpf，药物处理浓度为20-40ug/ml，并置于黑暗处培养，成鱼诱导处理：3个月左右大小的成鱼，在药物浓度60ug/ml的浓度下至少处理15天，并且置于黑暗处饲养，隔天换水，15dpa，取样进行各种实验。
5.根据权利要求1所述的一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤二中，酚红的作用主要是对注射过的胚胎进行标记，避免重复注射。
6.根据权利要求1所述的一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤六中，在F1胚胎筛选过程中，当筛选到表型时，将转基因鱼挑出，提取基因组，利用LM-PCR方法鉴定插入位置，并进行后续验证工作。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113416752A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-09-21 | 周娟 | Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102041316A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-05-04 | 华东师范大学 | miRNA-219化合物作为脑胶质瘤标志物的应用 |
| CN102392073A (zh) * | 2011-11-03 | 2012-03-28 | 温州医学院 | 一种斑马鱼胚胎dna错配修复功能活性的分析方法及其应用 |
| EP2740353A1 (en) * | 2012-12-06 | 2014-06-11 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Novel inducible animal models of stress behavior |
| CN109280666A (zh) * | 2018-10-25 | 2019-01-29 | 湖南师范大学 | 一种基因敲除选育bai2基因缺失型斑马鱼的方法 |
-
2021
- 2021-01-21 CN CN202110084359.1A patent/CN112889755A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102041316A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-05-04 | 华东师范大学 | miRNA-219化合物作为脑胶质瘤标志物的应用 |
| CN102392073A (zh) * | 2011-11-03 | 2012-03-28 | 温州医学院 | 一种斑马鱼胚胎dna错配修复功能活性的分析方法及其应用 |
| EP2740353A1 (en) * | 2012-12-06 | 2014-06-11 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Novel inducible animal models of stress behavior |
| CN109280666A (zh) * | 2018-10-25 | 2019-01-29 | 湖南师范大学 | 一种基因敲除选育bai2基因缺失型斑马鱼的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 马志鹏: ""采用斑马鱼建立可诱导显性突变体筛选体系"", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113416752A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-09-21 | 周娟 | Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210604 |
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