CN113416752A - Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，包括以下步骤：步骤一：取野生型AB系斑马鱼若干条，用循环水1000ml进行培养，一般半天光照时长14h，夜晚时长为10h，每早晚各喂食丰年虫一次；步骤二：准备实验器材和实验溶液若干；步骤三：选取六月龄的野生型AB系斑马鱼10条，雌雄各半，对照组用循环水进行培养，处理组光照时间同上，正常喂食，并每隔2d换一次水，本发明通过使用野生型斑马鱼进行实验，斑马鱼与人类基因同源性高达85％，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似。
Description
技术领域
本发明属于基因敲除技术领域，具体涉及Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用。
背景技术
基因(遗传因子)是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。基因支持着生命的基本构造和性能。储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡等过程的全部信息。环境和遗传的互相依赖，演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程。生物体的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关。它也是决定生命健康的内在因素。因此，基因具有双重属性：物质性(存在方式)和信息性(根本属性)。
基因敲除(knockout)是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。
通过采用高分辨率溶解曲线技术对心房颤动患者和正常人进行Mog1基因变异的筛查，结果发现心房颤动患者中有2例Mog1基因产生新变异，因此提出Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，以对心房颤动患者进行治疗。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，以解决上述背景技术中提出的心房颤动患者的Mog1基因产生新变异的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，包括以下步骤：
步骤一：取野生型AB系斑马鱼若干条，用循环水1000ml进行培养，一般半天光照时长14h，夜晚时长为10h，每早晚各喂食丰年虫一次；
步骤二：准备实验器材和实验溶液若干；
步骤三：选取六月龄的野生型AB系斑马鱼10条，雌雄各半，对照组用循环水进行培养，处理组光照时间同上，正常喂食，并每隔2d换一次水；
步骤四：将10条斑马鱼分成5缸，分别交配产卵，收集胚胎，并立即放入Trozal中，并对胚胎进行提取RNA处理；
步骤五：对提取的RNA进行反转录反应，反应分为两部分：基因组去除反应和反转录反应两部分，冰上配置混合液，均匀混合后放入PCR仪中设置程序为42℃，2min；4℃，∞；
步骤六：混合后，放入PCR仪中设置程序为37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞，随后取出样本，对样本进行稀释处理，稀释程度为5倍，零下20℃保存；
步骤七：使用PCR专用八联管，保证同一样本同一引物，重复三次，每个引物添加两个空白对照NTC，不加模板，用ddH2O代替，所有操作在冰上完成，将加好的样品在涡旋仪上均匀混合后，放入PCR仪中，设置程序为95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；42℃，45个循环，95℃，10s；65℃，1min；97℃，1s，处理完成后，将样品取出，并进行暂存处理；
步骤八：通过网站查询斑马鱼Mog1基因组DNA外显子序列及其功能区，对样品内进行预测Mog1靶点，依据NCBI数据库中斑马鱼mog1CDS序列，筛选合适位点，查找的斑马鱼mog1基因cDNA序列，选取的TALEN靶点位于斑马鱼mog1基因的第二号外显子内；
步骤九：确定好TALEN靶点后，利用TALENs质粒构建试剂盒构建TALENs质粒，针对同一靶点分别构建三条左臂和两条右臂，可以有六种不同左右臂组合，提高TALENs识别和敲除效率；
步骤十：用限制性内切酶NotⅠ线性化TALENs质粒，电泳检测，采用快速DNA回收试剂盒回收；SP6体外转录试剂盒进行TALENs体外转录成mRNA，氯化裡沉淀回收，检测mRNA浓度和质量，储存于-80℃备用；
步骤十一：注射前，按照100pg/nL、160pg/nL、200pg/nL的不同浓度将三条左臂和两条右臂分别混合，共有六种组合方式，三种浓度梯度，分别注射斑马鱼1-2细胞期胚胎，，48hpf，显微镜下取表行正常的胚胎提取DNA，利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，依据测序结果判断不同TALENs组合及不同浓度的基因敲除效率，最终确定注射浓度为160pg/nl的浓度，利用效率最高的一对左右臂组合注射WT斑马鱼胚胎，获得F0代mog1敲除斑马鱼；
步骤十二：将F0代Mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪鱼尾，提DNA,利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，根据测序结果确定有效敲除Mog1基因的F0代斑马鱼个体，分别与WT斑马鱼杂交，获得F1代mog1敲除斑马鱼系，将F1代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F1代中杂合子与WT斑马鱼杂交获得的胚胎为F2代mog1敲除斑马鱼，将F2代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F2代杂合子杂交，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的纯合子获得的纯合子即为F3代mog1敲除斑马鱼，将F3代mog1敲除斑马鱼自交，获得mog1敲除纯合子胚胎，提取基因组DNA，扩增mog1片段，检测mog1在基因组水平是否被有效敲除，依据测序结果，获得两种类型的mog1基因敲除模型，基因组DNA第二号外显子分别缺失5bp和22bp，命名为Δ5和Δ22mog1基因敲除模型。
优选的，所述步骤一中，循环水中包含8.4gCaSO4、75gNaHCO3和18gNaCl，水温为28.5±0.5℃，循坏水的PH值在7.2左右，水质总硬度62mg/L，电导率485μS。
优选的，所述步骤四中，提取RNA的具体步骤为：用电动组织研磨器在液态氮中进行匀浆处理，每50-100ml加入1ml裂解液RZ，样品体积不超过RZ体积的十分之一，研磨后的匀浆放置五分钟，随后分离核酸蛋白复合物，将上清液转入离心机的离心管中，加入200μm氯仿，剧烈震荡15s，随后室温静置三分钟，再取上层水相转入离心管中，加入无水乙醇，打开离心机使无水乙醇和上层水相均匀混合，并转入CR3中，随后丢弃废液，再加入500μL去蛋白液，加入离心机混合后，去除废液，加入500μL漂洗液RW，室温下静置两分钟，加入离心机混合后，去除废液，并重复加入500μL漂洗液RW，室温下静置两分钟，加入离心机混合后，再次去除废液，使用吸附柱放入收集管中，去除残余液体，随后将吸附柱放入新的无RNAase的吸附柱中，加入30μLRNAase-FreeddH2O，静置两分钟，利用多功能酶标仪对溶液的浓度进行检测，并放入零下80℃进行保存。
优选的，所述步骤四中，加入无水乙醇的体积为上层水相的50％。
优选的，所述步骤八中，筛选合适位点，遵从以下原则：
(1)TALEN识别结合位点序列在外显子中或者位于内含子与外显子的交界处，敲除靶点尽量靠近ATG起始翻译位点，但必须在ATG翻译位点后面，左、右臂的长度为12-19bp；
(2)TNAEN左侧识别位点即左臂与右侧识别位点即右臂之间的spacer区域长度为14-21bp；
(3)5’端第0位必须为T，最后一位推荐为T，也可为A、C或G；
TALEN识别结合位点序列经BLAST程序检测，需具有特异性且不位于重复序列中。
与现有技术相比，本发明提供了Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，具备以下有益效果：
1、本发明通过使用野生型斑马鱼进行实验，斑马鱼与人类基因同源性高达85％，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，具有个体小(目前唯一适于进行微孔板高通量药物筛选的脊椎类动物)、发育周期短(24小时器官便可形成)、实验周期短(筛选结果在一周内即可得出)、费用低(约为鼠类的1/10-1/100)、体外受精、透明(可直接观察药物对内部器官的作用)、单次产卵数较高(150-200枚)以及实验用药量小(为小鼠用药量的1/100-1/1000)等优点，作为模式生物的优势很突出；
2、本发明通过对斑马鱼的Mog1基因进行敲除处理，由于Mog1基因关联着心房颤动患者的患病基因，因此对斑马鱼的Mog1基因进行敲除即对人体的心房颤动患病率进行有效的降低，对人类预防先天性疾病具有较为重大的意义。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，包括以下步骤：
步骤一：取野生型AB系斑马鱼若干条，用循环水1000ml进行培养，一般半天光照时长14h，夜晚时长为10h，每早晚各喂食丰年虫一次；
步骤二：准备实验器材和实验溶液若干；
步骤三：选取六月龄的野生型AB系斑马鱼10条，雌雄各半，对照组用循环水进行培养，处理组光照时间同上，正常喂食，并每隔2d换一次水；
步骤四：将10条斑马鱼分成5缸，分别交配产卵，收集胚胎，并立即放入Trozal中，并对胚胎进行提取RNA处理；
步骤五：对提取的RNA进行反转录反应，反应分为两部分：基因组去除反应和反转录反应两部分，冰上配置混合液，均匀混合后放入PCR仪中设置程序为42℃，2min；4℃，∞；
步骤六：混合后，放入PCR仪中设置程序为37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞，随后取出样本，对样本进行稀释处理，稀释程度为5倍，零下20℃保存；
步骤七：使用PCR专用八联管，保证同一样本同一引物，重复三次，每个引物添加两个空白对照NTC，不加模板，用ddH2O代替，所有操作在冰上完成，将加好的样品在涡旋仪上均匀混合后，放入PCR仪中，设置程序为95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；42℃，45个循环，95℃，10s；65℃，1min；97℃，1s，处理完成后，将样品取出，并进行暂存处理；
步骤八：通过网站查询斑马鱼Mog1基因组DNA外显子序列及其功能区，对样品内进行预测Mog1靶点，依据NCBI数据库中斑马鱼mog1CDS序列，筛选合适位点，查找的斑马鱼mog1基因cDNA序列，选取的TALEN靶点位于斑马鱼mog1基因的第二号外显子内；
步骤九：确定好TALEN靶点后，利用TALENs质粒构建试剂盒构建TALENs质粒，针对同一靶点分别构建三条左臂和两条右臂，可以有六种不同左右臂组合，提高TALENs识别和敲除效率；
步骤十：用限制性内切酶NotⅠ线性化TALENs质粒，电泳检测，采用快速DNA回收试剂盒回收；SP6体外转录试剂盒进行TALENs体外转录成mRNA，氯化裡沉淀回收，检测mRNA浓度和质量，储存于-80℃备用；
步骤十一：注射前，按照100pg/nL、160pg/nL、200pg/nL的不同浓度将三条左臂和两条右臂分别混合，共有六种组合方式，三种浓度梯度，分别注射斑马鱼1-2细胞期胚胎，，48hpf，显微镜下取表行正常的胚胎提取DNA，利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，依据测序结果判断不同TALENs组合及不同浓度的基因敲除效率，最终确定注射浓度为160pg/nl的浓度，利用效率最高的一对左右臂组合注射WT斑马鱼胚胎，获得F0代mog1敲除斑马鱼；
步骤十二：将F0代Mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪鱼尾，提DNA,利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，根据测序结果确定有效敲除Mog1基因的F0代斑马鱼个体，分别与WT斑马鱼杂交，获得F1代mog1敲除斑马鱼系，将F1代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F1代中杂合子与WT斑马鱼杂交获得的胚胎为F2代mog1敲除斑马鱼，将F2代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F2代杂合子杂交，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的纯合子获得的纯合子即为F3代mog1敲除斑马鱼，将F3代mog1敲除斑马鱼自交，获得mog1敲除纯合子胚胎，提取基因组DNA，扩增mog1片段，检测mog1在基因组水平是否被有效敲除，依据测序结果，获得两种类型的mog1基因敲除模型，基因组DNA第二号外显子分别缺失5bp和22bp，命名为Δ5和Δ22mog1基因敲除模型。
步骤一中，循环水中包含8.4gCaSO4、75gNaHCO3和18gNaCl，水温为28.5±0.5℃，循坏水的PH值在7.2左右，水质总硬度62mg/L，电导率485μS。
步骤四中，提取RNA的具体步骤为：用电动组织研磨器在液态氮中进行匀浆处理，每50-100ml加入1ml裂解液RZ，样品体积不超过RZ体积的十分之一，研磨后的匀浆放置五分钟，随后分离核酸蛋白复合物，将上清液转入离心机的离心管中，加入200μm氯仿，剧烈震荡15s，随后室温静置三分钟，再取上层水相转入离心管中，加入无水乙醇，打开离心机使无水乙醇和上层水相均匀混合，并转入CR3中，随后丢弃废液，再加入500μL去蛋白液，加入离心机混合后，去除废液，加入500μL漂洗液RW，室温下静置两分钟，加入离心机混合后，去除废液，并重复加入500μL漂洗液RW，室温下静置两分钟，加入离心机混合后，再次去除废液，使用吸附柱放入收集管中，去除残余液体，随后将吸附柱放入新的无RNAase的吸附柱中，加入30μLRNAase-FreeddH2O，静置两分钟，利用多功能酶标仪对溶液的浓度进行检测，并放入零下80℃进行保存。
步骤四中，加入无水乙醇的体积为上层水相的50％。
步骤八中，筛选合适位点，遵从以下原则：
(1)TALEN识别结合位点序列在外显子中或者位于内含子与外显子的交界处，敲除靶点尽量靠近ATG起始翻译位点，但必须在ATG翻译位点后面，左、右臂的长度为12-19bp；
(2)TNAEN左侧识别位点即左臂与右侧识别位点即右臂之间的spacer区域长度为14-21bp；
(3)5’端第0位必须为T，最后一位推荐为T，也可为A、C或G；
TALEN识别结合位点序列经BLAST程序检测，需具有特异性且不位于重复序列中。
实施例一
Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，包括以下步骤：
步骤一：取野生型AB系斑马鱼若干条，用循环水1000ml进行培养，一般半天光照时长14h，夜晚时长为10h，每早晚各喂食丰年虫一次；
步骤二：准备实验器材和实验溶液若干；
步骤三：选取六月龄的野生型AB系斑马鱼10条，雌雄各半，对照组用循环水进行培养，处理组光照时间同上，正常喂食，并每隔2d换一次水；
步骤四：将10条斑马鱼分成5缸，分别交配产卵，收集胚胎，并立即放入Trozal中，并对胚胎进行提取RNA处理；
步骤五：对提取的RNA进行反转录反应，反应分为两部分：基因组去除反应和反转录反应两部分，冰上配置混合液，均匀混合后放入PCR仪中设置程序为42℃，2min；4℃，∞；
步骤六：混合后，放入PCR仪中设置程序为37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞，随后取出样本，对样本进行稀释处理，稀释程度为5倍，零下20℃保存；
步骤七：使用PCR专用八联管，保证同一样本同一引物，重复三次，每个引物添加两个空白对照NTC，不加模板，用ddH2O代替，所有操作在冰上完成，将加好的样品在涡旋仪上均匀混合后，放入PCR仪中，设置程序为95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；42℃，45个循环，95℃，10s；65℃，1min；97℃，1s，处理完成后，将样品取出，并进行暂存处理；
步骤八：通过网站查询斑马鱼Mog1基因组DNA外显子序列及其功能区，对样品内进行预测Mog1靶点，依据NCBI数据库中斑马鱼mog1CDS序列，筛选合适位点，查找的斑马鱼mog1基因cDNA序列，选取的TALEN靶点位于斑马鱼mog1基因的第二号外显子内；
步骤九：确定好TALEN靶点后，利用TALENs质粒构建试剂盒构建TALENs质粒，针对同一靶点分别构建三条左臂和两条右臂，可以有六种不同左右臂组合，提高TALENs识别和敲除效率；
步骤十：用限制性内切酶NotⅠ线性化TALENs质粒，电泳检测，采用快速DNA回收试剂盒回收；SP6体外转录试剂盒进行TALENs体外转录成mRNA，氯化裡沉淀回收，检测mRNA浓度和质量，储存于-80℃备用；
步骤十一：注射前，按照100pg/nL、160pg/nL、200pg/nL的不同浓度将三条左臂和两条右臂分别混合，共有六种组合方式，三种浓度梯度，分别注射斑马鱼1-2细胞期胚胎，，48hpf，显微镜下取表行正常的胚胎提取DNA，利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，依据测序结果判断不同TALENs组合及不同浓度的基因敲除效率，最终确定注射浓度为160pg/nl的浓度，利用效率最高的一对左右臂组合注射WT斑马鱼胚胎，获得F0代mog1敲除斑马鱼；
步骤十二：将F0代Mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪鱼尾，提DNA,利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，根据测序结果确定有效敲除Mog1基因的F0代斑马鱼个体，分别与WT斑马鱼杂交，获得F1代mog1敲除斑马鱼系，将F1代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F1代中杂合子与WT斑马鱼杂交获得的胚胎为F2代mog1敲除斑马鱼，将F2代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F2代杂合子杂交，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的纯合子获得的纯合子即为F3代mog1敲除斑马鱼，将F3代mog1敲除斑马鱼自交，获得mog1敲除纯合子胚胎，提取基因组DNA，扩增mog1片段，检测mog1在基因组水平是否被有效敲除，依据测序结果，获得两种类型的mog1基因敲除模型，基因组DNA第二号外显子分别缺失5bp和22bp，命名为Δ5和Δ22mog1基因敲除模型。
步骤一中，循环水中包含8.4gCaSO4、75gNaHCO3和18gNaCl，水温为28.5±0.5℃，循坏水的PH值在7.2左右，水质总硬度62mg/L，电导率485μS。
步骤四中，提取RNA的具体步骤为：用电动组织研磨器在液态氮中进行匀浆处理，每50加入1ml裂解液RZ，样品体积不超过RZ体积的十分之一，研磨后的匀浆放置五分钟，随后分离核酸蛋白复合物，将上清液转入离心机的离心管中，加入200μm氯仿，剧烈震荡15s，随后室温静置三分钟，再取上层水相转入离心管中，加入无水乙醇，打开离心机使无水乙醇和上层水相均匀混合，并转入CR3中，随后丢弃废液，再加入500μL去蛋白液，加入离心机混合后，去除废液，加入500μL漂洗液RW，室温下静置两分钟，加入离心机混合后，去除废液，并重复加入500μL漂洗液RW，室温下静置两分钟，加入离心机混合后，再次去除废液，使用吸附柱放入收集管中，去除残余液体，随后将吸附柱放入新的无RNAase的吸附柱中，加入30μLRNAase-FreeddH2O，静置两分钟，利用多功能酶标仪对溶液的浓度进行检测，并放入零下80℃进行保存。
步骤四中，加入无水乙醇的体积为上层水相的50％。
步骤八中，筛选合适位点，遵从以下原则：
(1)TALEN识别结合位点序列在外显子中或者位于内含子与外显子的交界处，敲除靶点尽量靠近ATG起始翻译位点，但必须在ATG翻译位点后面，左、右臂的长度为12-19bp；
(2)TNAEN左侧识别位点即左臂与右侧识别位点即右臂之间的spacer区域长度为14-21bp；
(3)5’端第0位必须为T，最后一位推荐为T，也可为A、C或G；
TALEN识别结合位点序列经BLAST程序检测，需具有特异性且不位于重复序列中。
实施例二
Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，包括以下步骤：
步骤一：取野生型AB系斑马鱼若干条，用循环水1000ml进行培养，一般半天光照时长14h，夜晚时长为10h，每早晚各喂食丰年虫一次；
步骤二：准备实验器材和实验溶液若干；
步骤三：选取六月龄的野生型AB系斑马鱼10条，雌雄各半，对照组用循环水进行培养，处理组光照时间同上，正常喂食，并每隔2d换一次水；
步骤四：将10条斑马鱼分成5缸，分别交配产卵，收集胚胎，并立即放入Trozal中，并对胚胎进行提取RNA处理；
步骤五：对提取的RNA进行反转录反应，反应分为两部分：基因组去除反应和反转录反应两部分，冰上配置混合液，均匀混合后放入PCR仪中设置程序为42℃，2min；4℃，∞；
步骤六：混合后，放入PCR仪中设置程序为37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞，随后取出样本，对样本进行稀释处理，稀释程度为5倍，零下20℃保存；
步骤七：使用PCR专用八联管，保证同一样本同一引物，重复三次，每个引物添加两个空白对照NTC，不加模板，用ddH2O代替，所有操作在冰上完成，将加好的样品在涡旋仪上均匀混合后，放入PCR仪中，设置程序为95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；42℃，45个循环，95℃，10s；65℃，1min；97℃，1s，处理完成后，将样品取出，并进行暂存处理；
步骤八：通过网站查询斑马鱼Mog1基因组DNA外显子序列及其功能区，对样品内进行预测Mog1靶点，依据NCBI数据库中斑马鱼mog1CDS序列，筛选合适位点，查找的斑马鱼mog1基因cDNA序列，选取的TALEN靶点位于斑马鱼mog1基因的第二号外显子内；
步骤九：确定好TALEN靶点后，利用TALENs质粒构建试剂盒构建TALENs质粒，针对同一靶点分别构建三条左臂和两条右臂，可以有六种不同左右臂组合，提高TALENs识别和敲除效率；
步骤十：用限制性内切酶NotⅠ线性化TALENs质粒，电泳检测，采用快速DNA回收试剂盒回收；SP6体外转录试剂盒进行TALENs体外转录成mRNA，氯化裡沉淀回收，检测mRNA浓度和质量，储存于-80℃备用；
步骤十一：注射前，按照100pg/nL、160pg/nL、200pg/nL的不同浓度将三条左臂和两条右臂分别混合，共有六种组合方式，三种浓度梯度，分别注射斑马鱼1-2细胞期胚胎，，48hpf，显微镜下取表行正常的胚胎提取DNA，利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，依据测序结果判断不同TALENs组合及不同浓度的基因敲除效率，最终确定注射浓度为160pg/nl的浓度，利用效率最高的一对左右臂组合注射WT斑马鱼胚胎，获得F0代mog1敲除斑马鱼；
步骤十二：将F0代Mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪鱼尾，提DNA,利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，根据测序结果确定有效敲除Mog1基因的F0代斑马鱼个体，分别与WT斑马鱼杂交，获得F1代mog1敲除斑马鱼系，将F1代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F1代中杂合子与WT斑马鱼杂交获得的胚胎为F2代mog1敲除斑马鱼，将F2代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F2代杂合子杂交，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的纯合子获得的纯合子即为F3代mog1敲除斑马鱼，将F3代mog1敲除斑马鱼自交，获得mog1敲除纯合子胚胎，提取基因组DNA，扩增mog1片段，检测mog1在基因组水平是否被有效敲除，依据测序结果，获得两种类型的mog1基因敲除模型，基因组DNA第二号外显子分别缺失5bp和22bp，命名为Δ5和Δ22mog1基因敲除模型。
步骤一中，循环水中包含8.4gCaSO4、75gNaHCO3和18gNaCl，水温为28.5±0.5℃，循坏水的PH值在7.2左右，水质总硬度62mg/L，电导率485μS。
步骤四中，提取RNA的具体步骤为：用电动组织研磨器在液态氮中进行匀浆处理，每75ml加入1ml裂解液RZ，样品体积不超过RZ体积的十分之一，研磨后的匀浆放置五分钟，随后分离核酸蛋白复合物，将上清液转入离心机的离心管中，加入200μm氯仿，剧烈震荡15s，随后室温静置三分钟，再取上层水相转入离心管中，加入无水乙醇，打开离心机使无水乙醇和上层水相均匀混合，并转入CR3中，随后丢弃废液，再加入500μL去蛋白液，加入离心机混合后，去除废液，加入500μL漂洗液RW，室温下静置两分钟，加入离心机混合后，去除废液，并重复加入500μL漂洗液RW，室温下静置两分钟，加入离心机混合后，再次去除废液，使用吸附柱放入收集管中，去除残余液体，随后将吸附柱放入新的无RNAase的吸附柱中，加入30μLRNAase-FreeddH2O，静置两分钟，利用多功能酶标仪对溶液的浓度进行检测，并放入零下80℃进行保存。
步骤四中，加入无水乙醇的体积为上层水相的50％。
步骤八中，筛选合适位点，遵从以下原则：
(1)TALEN识别结合位点序列在外显子中或者位于内含子与外显子的交界处，敲除靶点尽量靠近ATG起始翻译位点，但必须在ATG翻译位点后面，左、右臂的长度为12-19bp；
(2)TNAEN左侧识别位点即左臂与右侧识别位点即右臂之间的spacer区域长度为14-21bp；
(3)5’端第0位必须为T，最后一位推荐为T，也可为A、C或G；
TALEN识别结合位点序列经BLAST程序检测，需具有特异性且不位于重复序列中。
实施例三
Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，包括以下步骤：
步骤一：取野生型AB系斑马鱼若干条，用循环水1000ml进行培养，一般半天光照时长14h，夜晚时长为10h，每早晚各喂食丰年虫一次；
步骤二：准备实验器材和实验溶液若干；
步骤三：选取六月龄的野生型AB系斑马鱼10条，雌雄各半，对照组用循环水进行培养，处理组光照时间同上，正常喂食，并每隔2d换一次水；
步骤四：将10条斑马鱼分成5缸，分别交配产卵，收集胚胎，并立即放入Trozal中，并对胚胎进行提取RNA处理；
步骤五：对提取的RNA进行反转录反应，反应分为两部分：基因组去除反应和反转录反应两部分，冰上配置混合液，均匀混合后放入PCR仪中设置程序为42℃，2min；4℃，∞；
步骤六：混合后，放入PCR仪中设置程序为37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞，随后取出样本，对样本进行稀释处理，稀释程度为5倍，零下20℃保存；
步骤七：使用PCR专用八联管，保证同一样本同一引物，重复三次，每个引物添加两个空白对照NTC，不加模板，用ddH2O代替，所有操作在冰上完成，将加好的样品在涡旋仪上均匀混合后，放入PCR仪中，设置程序为95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；42℃，45个循环，95℃，10s；65℃，1min；97℃，1s，处理完成后，将样品取出，并进行暂存处理；
步骤八：通过网站查询斑马鱼Mog1基因组DNA外显子序列及其功能区，对样品内进行预测Mog1靶点，依据NCBI数据库中斑马鱼mog1CDS序列，筛选合适位点，查找的斑马鱼mog1基因cDNA序列，选取的TALEN靶点位于斑马鱼mog1基因的第二号外显子内；
步骤九：确定好TALEN靶点后，利用TALENs质粒构建试剂盒构建TALENs质粒，针对同一靶点分别构建三条左臂和两条右臂，可以有六种不同左右臂组合，提高TALENs识别和敲除效率；
步骤十：用限制性内切酶NotⅠ线性化TALENs质粒，电泳检测，采用快速DNA回收试剂盒回收；SP6体外转录试剂盒进行TALENs体外转录成mRNA，氯化裡沉淀回收，检测mRNA浓度和质量，储存于-80℃备用；
步骤十一：注射前，按照100pg/nL、160pg/nL、200pg/nL的不同浓度将三条左臂和两条右臂分别混合，共有六种组合方式，三种浓度梯度，分别注射斑马鱼1-2细胞期胚胎，，48hpf，显微镜下取表行正常的胚胎提取DNA，利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，依据测序结果判断不同TALENs组合及不同浓度的基因敲除效率，最终确定注射浓度为160pg/nl的浓度，利用效率最高的一对左右臂组合注射WT斑马鱼胚胎，获得F0代mog1敲除斑马鱼；
步骤十二：将F0代Mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪鱼尾，提DNA,利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，根据测序结果确定有效敲除Mog1基因的F0代斑马鱼个体，分别与WT斑马鱼杂交，获得F1代mog1敲除斑马鱼系，将F1代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F1代中杂合子与WT斑马鱼杂交获得的胚胎为F2代mog1敲除斑马鱼，将F2代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F2代杂合子杂交，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的纯合子获得的纯合子即为F3代mog1敲除斑马鱼，将F3代mog1敲除斑马鱼自交，获得mog1敲除纯合子胚胎，提取基因组DNA，扩增mog1片段，检测mog1在基因组水平是否被有效敲除，依据测序结果，获得两种类型的mog1基因敲除模型，基因组DNA第二号外显子分别缺失5bp和22bp，命名为Δ5和Δ22mog1基因敲除模型。
步骤一中，循环水中包含8.4gCaSO4、75gNaHCO3和18gNaCl，水温为28.5±0.5℃，循坏水的PH值在7.2左右，水质总硬度62mg/L，电导率485μS。
步骤四中，提取RNA的具体步骤为：用电动组织研磨器在液态氮中进行匀浆处理，每100ml加入1ml裂解液RZ，样品体积不超过RZ体积的十分之一，研磨后的匀浆放置五分钟，随后分离核酸蛋白复合物，将上清液转入离心机的离心管中，加入200μm氯仿，剧烈震荡15s，随后室温静置三分钟，再取上层水相转入离心管中，加入无水乙醇，打开离心机使无水乙醇和上层水相均匀混合，并转入CR3中，随后丢弃废液，再加入500μL去蛋白液，加入离心机混合后，去除废液，加入500μL漂洗液RW，室温下静置两分钟，加入离心机混合后，去除废液，并重复加入500μL漂洗液RW，室温下静置两分钟，加入离心机混合后，再次去除废液，使用吸附柱放入收集管中，去除残余液体，随后将吸附柱放入新的无RNAase的吸附柱中，加入30μLRNAase-FreeddH2O，静置两分钟，利用多功能酶标仪对溶液的浓度进行检测，并放入零下80℃进行保存。
步骤四中，加入无水乙醇的体积为上层水相的50％。
步骤八中，筛选合适位点，遵从以下原则：
(1)TALEN识别结合位点序列在外显子中或者位于内含子与外显子的交界处，敲除靶点尽量靠近ATG起始翻译位点，但必须在ATG翻译位点后面，左、右臂的长度为12-19bp；
(2)TNAEN左侧识别位点即左臂与右侧识别位点即右臂之间的spacer区域长度为14-21bp；
(3)5’端第0位必须为T，最后一位推荐为T，也可为A、C或G；
TALEN识别结合位点序列经BLAST程序检测，需具有特异性且不位于重复序列中。
综上所述，在步骤四中，用电动组织研磨器在液态氮中进行匀浆处理，每75ml加入1ml裂解液RZ，所得到的F3代斑马鱼的Mog1基因敲除率最高，最高为90％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：取野生型AB系斑马鱼若干条，用循环水1000ml进行培养，一般半天光照时长14h，夜晚时长为10h，每早晚各喂食丰年虫一次；
步骤二：准备实验器材和实验溶液若干；
步骤三：选取六月龄的野生型AB系斑马鱼10条，雌雄各半，对照组用循环水进行培养，处理组光照时间同上，正常喂食，并每隔2d换一次水；
步骤四：将10条斑马鱼分成5缸，分别交配产卵，收集胚胎，并立即放入Trozal中，并对胚胎进行提取RNA处理；
步骤五：对提取的RNA进行反转录反应，反应分为两部分：基因组去除反应和反转录反应两部分，冰上配置混合液，均匀混合后放入PCR仪中设置程序为42℃，2min；4℃，∞；
步骤六：混合后，放入PCR仪中设置程序为37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞，随后取出样本，对样本进行稀释处理，稀释程度为5倍，零下20℃保存；
步骤七：使用PCR专用八联管，保证同一样本同一引物，重复三次，每个引物添加两个空白对照NTC，不加模板，用ddH2O代替，所有操作在冰上完成，将加好的样品在涡旋仪上均匀混合后，放入PCR仪中，设置程序为95℃，5min；95℃，10s；60℃，30s；42℃，45个循环，95℃，10s；65℃，1min；97℃，1s，处理完成后，将样品取出，并进行暂存处理；
步骤八：通过网站查询斑马鱼Mog1基因组DNA外显子序列及其功能区，对样品内进行预测Mog1靶点，依据NCBI数据库中斑马鱼mog1CDS序列，筛选合适位点，查找的斑马鱼mog1基因cDNA序列，选取的TALEN靶点位于斑马鱼mog1基因的第二号外显子内；
步骤九：确定好TALEN靶点后，利用TALENs质粒构建试剂盒构建TALENs质粒，针对同一靶点分别构建三条左臂和两条右臂，可以有六种不同左右臂组合，提高TALENs识别和敲除效率；
步骤十：用限制性内切酶NotⅠ线性化TALENs质粒，电泳检测，采用快速DNA回收试剂盒回收；SP6体外转录试剂盒进行TALENs体外转录成mRNA，氯化裡沉淀回收，检测mRNA浓度和质量，储存于-80℃备用；
步骤十一：注射前，按照100pg/nL、160pg/nL、200pg/nL的不同浓度将三条左臂和两条右臂分别混合，共有六种组合方式，三种浓度梯度，分别注射斑马鱼1-2细胞期胚胎，，48hpf，显微镜下取表行正常的胚胎提取DNA，利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，依据测序结果判断不同TALENs组合及不同浓度的基因敲除效率，最终确定注射浓度为160pg/nl的浓度，利用效率最高的一对左右臂组合注射WT斑马鱼胚胎，获得F0代mog1敲除斑马鱼；
步骤十二：将F0代Mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪鱼尾，提DNA,利用引物mog1-F-1和mog1-R-1进行PCR扩增，扩增WT片段长度为455bp，利用引物mog1-F-2测序，根据测序结果确定有效敲除Mog1基因的F0代斑马鱼个体，分别与WT斑马鱼杂交，获得F1代mog1敲除斑马鱼系，将F1代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F1代中杂合子与WT斑马鱼杂交获得的胚胎为F2代mog1敲除斑马鱼，将F2代mog1敲除斑马鱼饲养至3月龄，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的杂合子，F2代杂合子杂交，剪尾鳍提取DNA进行PCR扩增，测序确定是否是mog1敲除的纯合子获得的纯合子即为F3代mog1敲除斑马鱼，将F3代mog1敲除斑马鱼自交，获得mog1敲除纯合子胚胎，提取基因组DNA，扩增mog1片段，检测mog1在基因组水平是否被有效敲除，依据测序结果，获得两种类型的mog1基因敲除模型，基因组DNA第二号外显子分别缺失5bp和22bp，命名为Δ5和Δ22mog1基因敲除模型。
2.根据权利要求1所述的Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，其特征在于：所述步骤一中，循环水中包含8.4gCaSO4、75gNaHCO3和18gNaCl，水温为28.5±0.5℃，循坏水的PH值在7.2左右，水质总硬度62mg/L，电导率485μS。
3.根据权利要求1所述的Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，其特征在于：所述步骤四中，提取RNA的具体步骤为：用电动组织研磨器在液态氮中进行匀浆处理，每50-100ml加入1ml裂解液RZ，样品体积不超过RZ体积的十分之一，研磨后的匀浆放置五分钟，随后分离核酸蛋白复合物，将上清液转入离心机的离心管中，加入200μm氯仿，剧烈震荡15s，随后室温静置三分钟，再取上层水相转入离心管中，加入无水乙醇，打开离心机使无水乙醇和上层水相均匀混合，并转入CR3中，随后丢弃废液，再加入500μL去蛋白液，加入离心机混合后，去除废液，加入500μL漂洗液RW，室温下静置两分钟，加入离心机混合后，去除废液，并重复加入500μL漂洗液RW，室温下静置两分钟，加入离心机混合后，再次去除废液，使用吸附柱放入收集管中，去除残余液体，随后将吸附柱放入新的无RNAase的吸附柱中，加入30μLRNAase-FreeddH2O，静置两分钟，利用多功能酶标仪对溶液的浓度进行检测，并放入零下80℃进行保存。
4.根据权利要求1所述的Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，其特征在于：所述步骤四中，加入无水乙醇的体积为上层水相的50％。
5.根据权利要求1所述的Mog1基因敲除斑马鱼模型及应用，其特征在于：所述步骤八中，筛选合适位点，遵从以下原则：
(1)TALEN识别结合位点序列在外显子中或者位于内含子与外显子的交界处，敲除靶点尽量靠近ATG起始翻译位点，但必须在ATG翻译位点后面，左、右臂的长度为12-19bp；
(2)TNAEN左侧识别位点即左臂与右侧识别位点即右臂之间的spacer区域长度为14-21bp；
(3)5’端第0位必须为T，最后一位推荐为T，也可为A、C或G；
TALEN识别结合位点序列经BLAST程序检测，需具有特异性且不位于重复序列中。
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