CN110305896A - 一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法 - Google Patents
一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110305896A CN110305896A CN201910385967.9A CN201910385967A CN110305896A CN 110305896 A CN110305896 A CN 110305896A CN 201910385967 A CN201910385967 A CN 201910385967A CN 110305896 A CN110305896 A CN 110305896A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gff
- kidney
- plasmid
- sgrna
- fish
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 title claims abstract description 48
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 title claims abstract description 28
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims abstract description 33
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 21
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 7
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 claims description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims 1
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 abstract description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 7
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 230000004308 accommodation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108700027332 zebrafish six2 Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/40—Fish
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法,该方法包括在斑马鱼中利用基因敲入的方法构建Six2a:GFF的转基因鱼系,该鱼系与UAS:GFP、UAS:Dendra2‑NTR等鱼系进行杂交可以特异在肾脏中标记肾脏祖细胞或者删除肾脏祖细胞,以及在肾脏祖细胞中过表达和抑制基因。同时,该系统可以用于高通量的药物筛选,为找到在人类肾脏中制造肾脏祖细胞提供方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法。
背景技术
斑马鱼肾脏具有强大再生能力,其原因是斑马鱼肾脏存在肾脏祖细胞。对斑马鱼肾脏祖细胞进行研究,将会为治疗肾脏疾病提供新的方法或者药物。而目前还没有可以高效标记并且方便在肾脏祖细胞中进行基因过表达和基因抑制的方法。
本发明人在斑马鱼中利用基因敲入的方法构建成功了Six2a:GFF的转基因鱼系,该鱼系与UAS:GFP、UAS:Dendra2-NTR等鱼系进行杂交可以特异在肾脏中标记肾脏祖细胞或者删除肾脏祖细胞,以及在肾脏祖细胞中过表达和抑制基因。同时,该系统可以用于高通量的药物筛选,为找到在人类肾脏中制造肾脏祖细胞提供方法。本发明的UAS-GFF系统可以灵活的在斑马鱼肾脏祖细胞中表达各种基因,为科学研究和药物筛选提供了一个新的研究模型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法,所述方法是在斑马鱼中利用基因敲入的方法构建成功了Six2a:GFF的转基因鱼系。
本发明的方法,首先设计针对目标基因内含子的单导向RNA(sgRNA),构建包括有基因部分序列和外源基因序列的质粒作为供体(donor),通过利用CRISPR/cas9(以下简称Cas9)系统的核酸内切酶活性,同时切割基因组和供体质粒,使得被切割后的质粒在基因组的切口处,通过非同源整合的修复方式,将外源基因敲入到基因组中。
将外源基因插入到基因组中的目标基因位点的方法是不影响内源基因表达的方法,内源基因包括目标基因。sgRNA靶序列位于目的基因片段的一个内含子中,该位点将是sgRNA识别位点和cas9切割位点。通常内含子是靠近目标基因3’端的内含子,本发明选择的是最末端的一个内含子。由于目的区段5’端内含子和外显子直至终止子的序列均被覆盖入左同源臂中,因此当进行非同源臂重组将外源基因插入后,该目标基因自身的表达及功能并不会受到影响。
使用CRISPR/cas9系统,通过内含子靶向介导GFF敲入斑马鱼six2基因位点。将供体质粒,sgRNA和Cas9mRNA共同注入斑马鱼胚胎中,就可以使six2-p2A-EGFF质粒定向整合进入six2位点。
在一实施方案中。本发明的一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法,包括以下过程:
1)six2敲入靶点筛选:选取six2基因的最后一个内含子为敲入靶点;
2)根据选取靶点确定sgRNA的DNA序列;
3)将过程2)的sgRNA的DNA序列克隆到PT7-sgRNA质粒中,通过T7体外转录试剂盒进行体外转录,制得sgRNA;
4)制备T-P2A-GFF质粒;
5)通过PCR引物分别扩增左臂和右臂,将左臂用KpnI和BamHI双酶切连接到T-P2A-EGFF质粒中,再将右臂通过AgeI和SalI连接到已经连接左臂的T-P2A-EGFF的质粒中,形成供体质粒,其中,所述引物为:
左臂PCR扩增引物:
six-LF GAATTCGAGCTCGGTACCACGACAACGCGACCGAGCAGC
six-LR GAGCCAAGGTCGACCAAGTTTG
右臂PCR扩增引物:
six-RF TAAACGTGGACCCTTTCAAAAG
six-RR CCTAGGGCATGCCTCGAGCCTAATGTGCTCGATAACAAG
6)将cas9mRNA,sgRNA和供体质粒一起通过显微注射仪注入到1细胞期的斑马鱼受精卵中,即建成Six2a:GFF的转基因鱼系。
上述本发明的方法,所述sgRNA的DNA序列为GGGAAAAGTCTTAAAGCCCG。
上述本发明的方法,所述制备T-P2A-GFF质粒,以PEM-GFF VP16为模板,P2A-GFF融合序列扩增引物扩增得到P2A-GFF融合序列,然后通过T-A克隆的方法转入PMD-19T载体中。
上述本发明的方法,所述cas9mRNA,由表达Cas9的质粒通过内切酶线性化后,用试剂盒转录纯化得到。
上述本发明的方法,进一步包括将Six2a:GFF的转基因鱼系与选自UAS:GFP、UAS:Dendra2-NTR的鱼系进行杂交可以特异在肾脏中标记肾脏祖细胞或者删除肾脏祖细胞,以及在肾脏祖细胞中过表达和抑制基因。
另一方面,上述本发明的方法构建的Six2a:GFF的转基因鱼系统在高通量的药物筛选中的用途以及上述的方法构建的系统在人类肾脏中制造肾脏祖细胞的用途。
本发明的斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法在斑马鱼中利用基因敲入的方法构建成功了Six2a:GFF的转基因鱼系,该鱼系与UAS:GFP、UAS:Dendra2-NTR等鱼系进行杂交可以特异在肾脏中标记肾脏祖细胞或者删除肾脏祖细胞,以及在肾脏祖细胞中过表达和抑制基因。同时,该该方法构建的系统(鱼系)可以用于高通量的药物筛选,为找到在人类肾脏中制造肾脏祖细胞提供方法。并可以灵活的在斑马鱼肾脏祖细胞中表达各种基因,为科学研究和药物筛选提供了一个新的研究模型。
附图说明
图1为靶点6切割后的基因组测序图,
图2为靶点7切割后的基因组测序图;
图3为six2a-P2A-GFF.DNA图;
图4为提取转基因鱼基因组经引物扩增后条带图;
图5为F0的six2a-P2A-GFF转基因鱼第筛选结果;
图6为5#F0和Tg(UAS:EGFP)外交产F1,荧光显微镜图;
图7为有绿色荧光的six2a-P2A-GFF转基因小鱼再次进行PCR鉴定筛选结果;
图8为Six2-EGFF抗体染色图。
具体实施方式
以下实施例为代表性的,用于进一步阐明和理解本发蝗的实质。但不以此限制本发明的范围,任何在本发明的精神实质下进行的简单修饰和变通,也属于本发明的范围。
实施例1 Six2a:GFF的转基因鱼系的构建
1)six2敲入靶点筛选:
a.靶点选择并确认(最后一个intron上):
通过靶点设计原则在six2基因(见基因核苷酸序列SEQ ID NO.1)的最后一个内含子上找到了8个靶点如下Target1-Target8,分别通过基因组测序来验证切割效率,筛选出效率最高的靶点。
靶点设计:
b.切割效率验证:
将8个靶点分别注射到斑马鱼胚胎后,提取3dpf幼鱼基因组测序,只有靶点6和靶点7出现乱峰见图1和图2;
c.克隆验证切割效率和切割形式:
靶点6:15个有效测序结果中,2个出现双峰不可用,12个有缺失或增加,1个没有突变;故切割效率为12/13。
靶点7:15个有效测序结果中,5个出现双峰不可用,4个有缺失或增加,6个没有突变;故切割效率为4/10。
由于靶点6的切割效率比较高,因此敲入位点选择靶点6,其sgRNA的DNA序列SEQ:GGGAAAAGTCTTAAAGCCCG。
2)six2敲入载体构建并验证:
a.根据野生型斑马鱼基因组,分别设计引物,扩增左右臂,分别连接P2A-GFF,并测序验证,见图3。
b.制备T-P2A-GFF质粒
以PEM-GFF VP16为模板,P2A-GFF融合序列扩增引物扩增得到P2A-GFF融合序列。然后采用同规格T-A克隆的方法转入PMD-19T载体中。通过用M13正向引物测序质粒,筛选正向插入的质粒。质粒中,P2A序列是一种被剪切的序列,用于分别表达P2A序列前后两种蛋白。
c.制备最终质粒(供体质粒)
用斑马鱼基因组DNA为模板,分别设计PCR引物扩增左臂和右臂,将左臂用KpnI和BamHI双酶切连接到T-P2A-GFF中。在此基础上,再将右臂通过AgeI和SalI连接到已经连接左臂的T-P2A-GFF的质粒中,最终形成供体质粒。
左臂PCR扩增引物:six-LF GAATTCGAGCTCGGTACCACGACAACGCGACCGAGCAGC
six-LR GAGCCAAGGTCGACCAAGTTTG
右臂PCR扩增引物:six-RF TAAACGTGGACCCTTTCAAAAG
six-RR CCTAGGGCATGCCTCGAGCCTAATGTGCTCGATAACAAG
PCR扩增体系(50ul):
酶切体系:37℃水浴3h
凝胶电泳检测,之后切下目的片段用胶回收试剂盒回收。
连接体系(10ul):4℃过夜
右臂的连接方法与左臂一致,只是对已经连接了左臂的质粒用AgeI和SalI再次进行酶切,回收大片段后,再与右臂相连接,最后得到同时连接了左臂和右臂的质粒。
d.sgRNA和Cas9mRNA合成
用于制备sgRNA的DNA序列为GGGAAAAGTCTTAAAGCCCG(靶点6)
将上面的sgRNA序列克隆到PT7-sgRNA质粒中,通过T7体外转录试剂盒进行体外转录,然后回收得到sgRNA。
Cas9mRNA由表达Cas9的质粒通过内切酶线性化后,用试剂盒转录纯化得到。
e.显微注射并PCR验证
显微注射方法:提前准备好一细胞期的胚胎,固定在注射板中,将显微注射的液体按下面的配比配好后,注入到毛细管拉成的注射针中,安装好且调整好注射的速度,用显微注射仪注射到胚胎中。
将cas9mRNA,sgRNA和供体质粒一起通过显微注射仪注入到一细胞期的斑马鱼受精卵中。每个受精卵注入1nl液体。其中含有800ng/ul Cas9mRNA,80ng/ul sgRNA,和15ng/ul供体质粒。共注射约1800颗受精卵,成活率约10%。该批受精卵正常饲养,用于后期筛选鉴定,其中任意挑选10颗左右用于鉴定,发现有正确敲入。受精卵在体外条件培养下可以直接发育成斑马鱼。
f.鉴定引物及结果:
通过抽样提取转基因鱼基因组,分别用鉴定引物扩增,通过观察目的条带来筛选有正确敲入的鱼系,结果见图4。
3 F0转基因鱼系筛选
a.F0外交产F1,提取3dpf幼鱼基因PCR验证,条带大小正确的测序验证。筛选出与阳性对照结果一致的鱼即为six2基因敲入成功,表示为six2a-P2A-GFF。
模板DNA提取方法:
分别用镊子从3dpf幼鱼的尾部取1-2片鱼鳞溶解在10ul 0.05%的NaOH溶液中,然后于95℃20min,取出冷却后加1ul Tris-Hcl。
鉴定引物:
F:GGAGAAAAGGGAACTAGCTGAG(基因组位点特异引物)
R:GAGGCATATCAGTCTCCACTGAAGC(敲入质粒特异引物)
根据以上模板和引物进行PCR扩增,挑选出与阳性对照相同条带的实验组
PCR扩增体系:
six2a-P2A-GFF鉴定引物:
six-MF CTTGGTCGACCTTGGCTCTggatccggagctactaat
six-MR2 TGAAAGGGTCCACGTTTAttagttacccgggagcata
six2a-P2A-GFF筛选结果如图5所示:筛选效率:3/32
5#F0和Tg(UAS:EGFP)外交产F1,荧光显微镜下观察,挑选出有绿色荧光的小鱼,如图6所示:5#F0遗传比率:14/130。
b.对于挑选出来的有绿色荧光的小鱼再次进行PCR鉴定,鉴定方法与之前相同。
six2a-P2A-EGFF鉴定引物:
six-MF CTTGGTCGACCTTGGCTCTggatccggagctactaat
six-MR1 TTGAAAGGGTCCACGTTTActacttgtacagctcgtcca
Six2-GFF X UAS:GFP早期胚胎筛选结果如图7所示:
Six2-GFF X UAS:GFP鱼系标记肾脏祖细胞如图8所示。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院
<120> 一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 979
<212> DNA
<213> 斑马鱼 (D. rerio)
<400> 1
aagtgtctaa aagtaattgg aacgcattat atgcatatat tcgtgccgtg caatgtgaca 60
tcaagtcagt ggtgagtgtg taaaaagtcc taaagttccc acagatggat gagcacagtc 120
ggtacaaatg tcatccgttc tctgtaattg ttgatcgtta tttttgtaat aaatagttct 180
ccatgtcatt tgtaatatgc aataaaaagt aggctgctgt ttgagaaaag caggcccatg 240
cttacgggaa aagtcttaaa gcccgtggtg tgtattttgg tgtaatccag tttgagggaa 300
aaataatccg cttttaatta atggtaatgt tcttcgaatt gtaaaaaagt atctgaacat 360
attcttgtta tgaatgtgtg cagttgcaaa ggctactcct taaacgtgtc ttgtttcacc 420
cgcaggcgag ctagtcaagt tgaaaccaca atgtaaacca ttaaactagc tcatacgttt 480
cccgatactt tatccttaat taatacttta tgaatgaacc tttaattgac accttgtgat 540
ttagaattta gataaatcag tttgtgacga tgttttaacc gacatgattt attccaaacc 600
atataaataa ttatggcgta gacgcaagaa aagtaaactt tatcagttaa tttgtttgtc 660
ttttatgtaa atttaatacc gccaagaatt aggatgtgta ataagactaa tgtctgatgc 720
agagaaaaaa aggtgcacac tgttattatt gttacatata tttttatgga aatattctaa 780
agtttagtct acgcgaagtc gttagtgatg gtttattcct attggctttt atttatactg 840
ttttaacatt ttaataaaaa aatatttctc acctaaataa cccactttca ttaagataaa 900
ggctattaat agttgtttta gatttgtttg agaaagcatg ttgcataatt ataactattt 960
gtgcaaatta gctattaag 979
Claims (7)
1.一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法,包括以下过程:
1)six2敲入靶点筛选:选取six2基因的最后一个内含子为敲入靶点;
2)根据选取靶点确定sgRNA的DNA序列;
3)将过程2)的sgRNA的DNA序列克隆到PT7-sgRNA质粒中,通过T7体外转录试剂盒进行体外转录,制得sgRNA;
4)制备T-P2A-GFF质粒;
5)通过PCR引物扩增左臂和右臂,将左臂用KpnI和BamHI双酶切连接到T-P2A-EGFF质粒中,再将右臂通过AgeI和SalI连接到已经连接左臂的T-P2A-EGFF的质粒中,形成供体质粒,其中,所述引物为:
左臂PCR扩增引物:
six-LF GAATTCGAGCTCGGTACCACGACAACGCGACCGAGCAGC
six-LR GAGCCAAGGTCGACCAAGTTTG
右臂PCR扩增引物:
six-RF TAAACGTGGACCCTTTCAAAAG
six-RR CCTAGGGCATGCCTCGAGCCTAATGTGCTCGATAACAAG
6)将cas9mRNA,sgRNA和供体质粒一起通过显微注射仪注入到1细胞期的斑马鱼受精卵中,即建成Six2a:GFF的转基因鱼系。
2.如权利要求1所述的方法,所述sgRNA的DNA序列为GGGAAAAGTCTTAAAGCCCG。
3.如权利要求1所述的方法,所述制备T-P2A-GFF质粒以PEM-GFF VP16为模板,P2A-GFF融合序列扩增引物扩增得到P2A-GFF融合序列,然后通过T-A克隆的方法转入PMD-19T载体中。
4.如权利要求1所述的方法,所述cas9 mRNA,由表达Cas9的质粒通过内切酶线性化后,用试剂盒转录纯化得到。
5.如权利要求1所述的方法,进一步包括将Six2a:GFF的转基因鱼系与选自UAS:GFP、UAS:Dendra2-NTR的鱼系进行杂交可以特异在肾脏中标记肾脏祖细胞或者删除肾脏祖细胞,以及在肾脏祖细胞中过表达和抑制基因。
6.利要求1的方法构建的Six2a:GFF的转基因鱼系统在高通量的药物筛选中的用途。
7.利要求1所述的方法构建的系统在人类肾脏中制造肾脏祖细胞的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910385967.9A CN110305896B (zh) | 2019-05-09 | 2019-05-09 | 一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910385967.9A CN110305896B (zh) | 2019-05-09 | 2019-05-09 | 一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110305896A true CN110305896A (zh) | 2019-10-08 |
CN110305896B CN110305896B (zh) | 2020-11-24 |
Family
ID=68074618
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910385967.9A Active CN110305896B (zh) | 2019-05-09 | 2019-05-09 | 一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110305896B (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110714026A (zh) * | 2019-10-22 | 2020-01-21 | 闽南师范大学 | 一种ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用 |
CN112852872A (zh) * | 2021-01-22 | 2021-05-28 | 杭州环特生物科技股份有限公司 | 一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法 |
CN113373150A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-10 | 南方科技大学 | 一种靶向dat基因的sgRNA及其应用 |
CN113388639A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-09-14 | 湖南师范大学 | 一种选育斑马鱼心脏组织特异表达增强型绿色荧光蛋白敲入实验模型构建及其应用的方法 |
CN115678912A (zh) * | 2021-07-26 | 2023-02-03 | 福州大学 | 一种构建dgtm转基因斑马鱼作为载体表达人源dgtm蛋白的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004023867A2 (en) * | 2002-09-11 | 2004-03-25 | Dana-Farber Cancer Institute | Transgenic cancer models in fish |
CN104195177A (zh) * | 2014-08-05 | 2014-12-10 | 南京大学 | 一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法 |
CN107058386A (zh) * | 2017-04-13 | 2017-08-18 | 厦门大学 | 一种转基因斑马鱼的制备方法 |
CN108949830A (zh) * | 2018-08-03 | 2018-12-07 | 福州大学 | 一种在鱼类中实现基因组编辑、精确定点基因敲入的方法 |
-
2019
- 2019-05-09 CN CN201910385967.9A patent/CN110305896B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004023867A2 (en) * | 2002-09-11 | 2004-03-25 | Dana-Farber Cancer Institute | Transgenic cancer models in fish |
CN104195177A (zh) * | 2014-08-05 | 2014-12-10 | 南京大学 | 一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法 |
CN107058386A (zh) * | 2017-04-13 | 2017-08-18 | 厦门大学 | 一种转基因斑马鱼的制备方法 |
CN108949830A (zh) * | 2018-08-03 | 2018-12-07 | 福州大学 | 一种在鱼类中实现基因组编辑、精确定点基因敲入的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
AKIO KOBAYASHI等: "Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development", 《CELL STEM CELL》 * |
MIKI TAKEUCHI等: "Establishment of Gal4 Transgenic Zebrafish Lines for Analysis of Development of Cerebellar Neural Circuitry", 《DEVELOPMENTAL BIOLOGY》 * |
STEFANIE WEBER等: "SIX2 and BMP4 Mutations Associate With Anomalous Kidney Development", 《J AM SOC NEPHROL》 * |
ZHIQIANG DONG等: "Stable Gene Silencing in Zebrafish with Spatiotemporally Targetable RNA Interference", 《GENETICS》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110714026A (zh) * | 2019-10-22 | 2020-01-21 | 闽南师范大学 | 一种ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用 |
CN112852872A (zh) * | 2021-01-22 | 2021-05-28 | 杭州环特生物科技股份有限公司 | 一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法 |
CN113388639A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-09-14 | 湖南师范大学 | 一种选育斑马鱼心脏组织特异表达增强型绿色荧光蛋白敲入实验模型构建及其应用的方法 |
CN113388639B (zh) * | 2021-06-04 | 2024-01-12 | 湖南师范大学 | 一种基因敲入选育斑马鱼vmhcEGFP-KI品系的方法 |
CN113373150A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-10 | 南方科技大学 | 一种靶向dat基因的sgRNA及其应用 |
CN113373150B (zh) * | 2021-06-18 | 2022-11-22 | 南方科技大学 | 一种靶向dat基因的sgRNA及其应用 |
CN115678912A (zh) * | 2021-07-26 | 2023-02-03 | 福州大学 | 一种构建dgtm转基因斑马鱼作为载体表达人源dgtm蛋白的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110305896B (zh) | 2020-11-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110305896A (zh) | 一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法 | |
JP6531239B2 (ja) | 細胞トランスフェクション法 | |
Zhang et al. | A practical guide to CRISPR/Cas9 genome editing in Lepidoptera | |
CN108642055A (zh) | 能有效编辑猪miR-17-92基因簇的sgRNA | |
CN103409448B (zh) | 一种模型小鼠制备方法及条件性细胞剔除重组载体 | |
CN106282231B (zh) | 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用 | |
WO2020077930A1 (zh) | 一种应用Cas9技术制备CKO/KI动物模型的方法 | |
EP3384051A1 (en) | Methods for gender determination of avian embryos in unhatched eggs and means thereof | |
CN106119284A (zh) | 一种用于构建免疫缺陷动物模型的产品及其应用 | |
CN107365803B (zh) | 免药物筛选快速获得小鼠Rosa26基因定点整合外源基因的方法 | |
CN101175858A (zh) | 生产具有靶向基因组修饰的卵母细胞或卵的体外方法 | |
CN109266687A (zh) | 一种基因敲除选育tnni3k基因缺失型斑马鱼的方法 | |
CN105274141A (zh) | 一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体及制备方法和用途 | |
CN111154758A (zh) | 敲除斑马鱼slc26a4基因的方法 | |
CN113584079A (zh) | 一种应用于钙离子成像的斑马鱼心脏特异标记品系的建立 | |
CN109280666A (zh) | 一种基因敲除选育bai2基因缺失型斑马鱼的方法 | |
CN109055434A (zh) | 一种利用CRISPRCas9技术纠正猪KIT基因结构突变的方法 | |
CN110894510A (zh) | 一种基因敲除选育Lgr6基因缺失型斑马鱼的方法 | |
CN108866102B (zh) | 一种Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法 | |
US20200149063A1 (en) | Methods for gender determination and selection of avian embryos in unhatched eggs | |
CN109468324A (zh) | 一种基因敲除选育pdlim5b基因缺失型斑马鱼的方法 | |
CN109694885B (zh) | 基于CRISPR/Cas9技术制备PI3Kγ全身敲除模式小鼠方法及其应用和试剂盒 | |
CN104774870B (zh) | 可多次交换的无标记定点整合转基因系统及其应用 | |
CN108486115B (zh) | 一种用于淡水螯虾细胞外源基因表达的转染方法及其应用 | |
JP2020534024A (ja) | インサイチュ生殖細胞系列ゲノムエンジニアリングのための方法および組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |