CN112852872A - 一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程与环境科学领域，公开了一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法，包括：（1）克隆斑马鱼雌激素响应元件ERE的DNA序列；（2）构建质粒Tol2‑5×ERE‑GFF；（3）胚胎显微注射及功能验证；（4）Founder筛选；（5）纯种筛选培养。按本发明方法所得的转基因斑马鱼中，雌激素能刺激5×ERE响应，激活GFF的表达，而GFF蛋白可与UAS结合，进而驱动绿色荧光蛋白（EGFP）的表达，从而达到方便、直观、动态检测环境雌激素是否存在及其浓度的目的。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程与环境科学领域，尤其涉及一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法。
背景技术
环境雌激素(EnvironmentalEstrogens，EEs)是一类环境中存在的能干扰内分泌系统的正常生理和生化功能的化学物质，三大主要的EEs有1、人工合成雌激素，2、生物来源雌激素，3、环境化学污染物。EEs一般以较低浓度存在于环境中，可在生物体内富集并诱导生物体神经、生殖、免疫系统疾病及肿瘤等多种病变。EEs污染问题已引起广泛关注。
EEs的检测方法主要可分为理化检测和生物学检测两大类。其中，理化方法如气相色谱(GC)法、液相色谱(LC)、电感耦合等离子发射光谱(ICP)及其相关的质谱(MS)联用分析等偏向于检测化学结构已知的物质，对新的雌激素类化合物的筛查有局限性，且前处理复杂。生物学方法分为体外和体内实验。体外实验如雌激素敏感细胞和酵母菌检测系统，检测灵敏度较高，但不能全面反应雌激素毒性。子宫生长试验是经典的体内检测雌激素活性的方法，优点是可以检测某些需要在体内代谢活化的活性物质和中间代谢产物等，但灵敏度较低，影响因素较多，且结果难以外推到人。
欧洲经济与合作发展组织(OECD)和日本的生殖毒理学家采用斑马鱼(Zebrafish)作为检测水环境内分泌干扰物浓度的早期敏感对象。
斑马鱼具有个体小、繁殖率高、生长周期短、胚胎透明、与人类基因的同源性高、易于进行转基因操作并得到基因突变体，成为研究脊椎动物环境毒理学的理想模式生物。
斑马鱼中有三个基因与哺乳动物雌激素受体(ERs)同源：erα(在斑马鱼中也称为nr3a1或esr1)、erβ1(nr3a2a或esr2a)和erβ2(nr3a2b或esr2b)。三种雌激素受体均可与雌激素响应元件(ERE)DNA序列结合，并以剂量依赖的方式激活胞内转录。
发明内容
本发明提供了一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法，按照本发明方法所得的转基因斑马鱼中，雌激素能刺激5×ERE响应，激活GFF的表达，而GFF蛋白可与UAS结合，进而驱动绿色荧光蛋白(EGFP)的表达，从而达到方便、直观、动态检测环境雌激素是否存在及其浓度的目的。
本发明的具体技术方案为：
一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法，包括如下步骤：
(1)克隆斑马鱼雌激素响应元件ERE的DNA序列：合成获得5×ERE序列片段。
(2)构建质粒Tol2-5×ERE-GFF：将5×ERE序列片段融合入含一个GFF元件的质粒中，得到对雌激素有响应的Tol2-5×ERE-GFF质粒。
(3)胚胎显微注射及功能验证：将步骤(2)所得质粒注射至Tg(UAS：EGFP)转基因斑马鱼的受精卵中，并使用雌激素验证其雌激素荧光响应功能。
(4)Founder筛选：以步骤(3)所得受精卵长成的斑马鱼作为F0代，对F0代斑马鱼的可遗传性筛选及PCR鉴定，将F0代斑马鱼与野生型AB品系斑马鱼杂交传至F1代，通过PCR鉴定目的基因是否插入到F1代斑马鱼的基因组中。
(5)纯种筛选培养：对通过鉴定的F1代斑马鱼进行培养，获得能够监测水体中环境雌激素的转基因斑马鱼系。
本发明的原理为：雌激素+雌激素受体→5×ERE激活→GFF/UAS基因表达调控系统激活→EGFP表达。具体为以UAS-GFF基因表达调控系统为基础，利用优化重组的雌激素响应元件(ERE)驱动上游质粒GFF的表达，进而对下游UAS质粒中荧光基因eGFP表达进行调控。也就是说，按照本发明方法所得的转基因斑马鱼中，雌激素能刺激5×ERE响应，激活GFF的表达，而GFF蛋白可与UAS结合，进而驱动绿色荧光蛋白(EGFP)的表达，从而达到方便、直观、动态检测环境雌激素是否存在及其浓度的目的。
利用本发明方法构建的转基因斑马鱼检测环境雌激素具有以下优点：
(1)24h即可完成检测，处理周期短，操作简便。雌二醇浓度为0.01ng/mL时即可表达荧光(图5)，检测灵敏度较现有文献报道更强(现有文献报道最低仅能达到0.1ng/mL)，高于常规检测所需。且荧光强度在0.1-100ng/mL范围内与雌二醇正相关，在雌二醇浓度为10ng-100ng/mL范围内荧光强度变化仍可见有较大差异(见图5)。现有技术中的斑马鱼在10ng～100ng/mL范围内荧光变化不明显，因此在实际应用中在上述范围内只能进行定性检测。而本发明的转基因斑马鱼在此范围内的变化仍非常明显，因此在实际应用中的检测范围更大，在此范围内仍然可对雌激素的浓度进行定性和定量的检测。
(2)将特异性启动子与目的基因相融合的转基因方式在操作上难以实现对目的基因比较准确的控制，本发明GFF-UAS系统的应用对于目的基因的控制更为准确，且对于斑马鱼的毒性更加低，更符合动物福利。
(3)常规的GFP荧光蛋白的合成存在滞后情况。本发明使用增强型绿色荧光蛋白EGFP，发射出的荧光强度比GFP大6倍以上，因此，比GFP更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。
(4)本发明构建的转基因斑马鱼可作为进一步探讨雌激素信号在体内的生理作用的有价值的模型。可反映雌激素类似物对斑马鱼各个器官的亲和性，反映其组织特异性。
作为优选，步骤(1)中，合成5×ERE序列片段后将其克隆到pUC57载体上。
作为优选，步骤(2)具体为：
先通过PCR分别扩增以下片段：
通过上下游引物vector-F和vector-R扩增载体Tol2，模板为质粒Tol2-Cl；其中vector-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，vector-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
通过上下游引物GFF-F1和GFF-R1扩增GFF和SV40 poly(A)片段，模板为质粒T-GFF；其中GFF-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，GFF-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；通过上下游引物ERE-F和ERE-R扩增5×ERE片段，模板为pUC57-5×ERE；其中ERE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，ERE-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
然后将各个片段用试剂盒Hieff
Plus Multi One Step Cloning Kit连接，转入DH5α感受态中，涂布于含有Ampicillin的LB平板上培养，得到核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的Tol2-5×ERE-GFF质粒。
作为优选，步骤(3)中：将纯化后的Tol2-5×ERE-GFF质粒和TPase mRNA混合后共注射，其中两者的注射量比为(0.8-1.2)∶1；注射完成后的受精卵于25-30℃的培养基培养。
作为优选，步骤(3)中：注射阶段为受精卵的单细胞期。
本发明限定在上述阶段注射的原因是注射物可以对之后分裂形成的所有细胞发生作用。
作为优选，步骤(3)中：使用雌激素验证其雌激素荧光响应功能的过程为：在受精后将注射过的幼鱼浸泡于含有诱导剂的溶液中，在光照培养箱中培养，最终利用荧光显微镜成像，进行验证。
作为优选，步骤(3)中：所述诱导剂为3-7μg/L的雌二醇或3-7μg/L的雌二醇+3-7μM的4-OHT。
本发明团队通过试验发现，E2可以增强特定转基因斑马鱼荧光表达，而4-OHT与E2混合使用则会使荧光强度下降。
作为优选，步骤(3)中：在受精后3天将注射过的幼鱼浸泡于含有诱导剂的溶液中。
作为优选，步骤(3)中：光照培养箱的培养条件为25-30℃，14/10h光周期。
作为优选，步骤(3)中：荧光体视镜成像的条件为：3.2倍，曝光250ms。
作为优选，步骤(4)中：对F1代斑马鱼的鉴定方法为：设计鉴定引物ERE-F1和ERE-R1，提取10-20条斑马鱼幼鱼的基因组，用鉴定引物进行PCR鉴定。其中ERE-F1和ERE-R1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8-9所示。
作为优选，步骤(5)具体为：对通过鉴定的F1代斑马鱼成鱼分别与野生型AB品系斑马鱼杂交产F2代，然后进行功能验证，选择通过验证的F2代进行养殖，F2代成鱼自交，获得F3代，F3代中纯合子比例理论上为1/4，F3代通过鉴定的成鱼分别与AB品系杂交，若后代均呈阳性，则为纯合子，筛选纯合子继续培养。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
(1)通过本发明方法所得的转基因斑马鱼可稳定表达绿色荧光蛋白EGFP，且蛋白表达水平受环境雌激素浓度依赖性的诱导，因而该转基因斑马鱼可用于探测环境中的雌激素及其类似物的存在及浓度。
(2)本发明所得转基因雌激素荧光斑马鱼检测的样品不需复杂的前处理，实验结果在荧光显微镜下直观可见，通过荧光的有无、强弱判断有雌激素活性的物质的存在与否与含量多少。
(3)斑马鱼兼具体外实验与体内实验的优点，使用本发明所得转基因雌激素斑马鱼的检测方法周期短，费用低，能反应雌激素及其体内代谢产物整体的毒性情况，结果与人相关性高。
附图说明
图1为实施例1中Tol2-5×ERE-GFF质粒图谱。
图2为实施例1中F0代雌激素检测功能验证荧光图。
图3为实施例1中F0代斑马鱼凝胶电泳条带。
图4为实施例1中F2代雌激素检测功能验证荧光图；
图5为雌二醇(E2)在不同浓度下的荧光强度对比图；
图6为在不同浓度的雌二醇(E2)下斑马鱼的肝脏荧光强度图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
1、克隆斑马鱼雌激素响应元件(ERE)DNA序列
查找ERE片段，合成5×ERE片段并克隆到pUC57载体上。
2、构建质粒Tol2-5×ERE-GFF
用PCR扩增各个片段，引物序列见表1：
表1.质粒构建的引物名称和序列
| 引物名称 | 引物序列5′-3′ |
| vector-F | GGTGTGGGAGGTTTTTTAATTCAAGCTTAAACAAGAATCTCTAGT |
| vector-R | AAATTAAACTGGGCATCAGCG |
| GFF-F1 | ATGAAGCTACTGTCTTCTATCG |
| GFF-R1 | GAATTAAAAAACCTCCCACACC |
| ERE-F | CGCTGATGCCCAGTTTAATT |
| ERE-R | GATAGAAGACAGTAGCTTCAT |
其中，扩增载体tol2的引物为vector-F和vector-R，模板是质粒Tol2-C1；扩增GFF和SV40poly(A)片段的引物为GFF-F1和GFF-R1，模板是质粒T-GFF；扩增5×ERE片段的引物为ERE-F和ERE-R，模板为质粒Puc57-5×ERE。然后将各个片段用试剂盒Hieff
PlusMulti One Step Cloning Kit连接，转入DH5α感受态中，涂布于含有Ampicillin的LB平板上37℃过夜培养，然后提取单克隆进行测序，对测序结果进行比对及分析，获得正确的质粒(图谱如图1所示)，用于后续实验。所得Tol2-5×ERE-GFF质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：
上述序列中，其中第一段下划线部分
“CCCAGTGACGTAGGAAGTCCATCCATTCACAGCGCTTCTATAAAGGCGCCAGCTGAGGCGCCTACTACTCCAACCGCGACTGCAGCGAGCAACT”为启动子minimal mfos promoter序列；第三段下划线部分“ATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAACAAGCATGCGATATTTGCCGACTTAAAAAGCTCAAGTGCTCCAAAGAAA AACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTGAAGAACAACTGGGAGTGTCGCTACTCTCCCAAAACCAAAAGGTCTCCGCTGAC TAGGGCACATCTGACAGAAGTGGAATCAAGGCTAGAAAGACTGGAACAGCTATTTCTACTGATTTTTCCTCGAGAA GACCTTGACATGATTTTGAAAATGGATTCTTTACAGGATATAAAAGCATTGTTAACAGGATTATTTGTACAAGATA ATGTGAATAAAGATGCCGTCACAGATAGATTGGCTTCAGTGGAGACTGATATGCCTCTAACATTGAGACAGCATAG AATAAGTGCGACATCATCATCGGAAGAGAGTAGTAACAAAGGTCAAAGACAGTTGACTGTATCGCCGGAATTCCCG GCCGACGCCCTGGACGACTTCGACCTGGACATGCTGCCTGCTGATGCTCTCGATGATTTCGATCTCGATATGCTCC CGGGTAACTAA”为GFF序列。
3、胚胎显微注射及功能验证
纯化后的质粒Tol2-5×ERE-GFF和TPase mRNA混合后共注射，其中两者的注射量均为25pg。注射的斑马鱼胚胎品系为Tg(UAS：EGFP)(由南京歆佳医药科技有限公司提供)，注射阶段为单细胞期。注射完成后的胚胎收集到相应的培养基中于28.5℃下培养。
在受精后3天(3dpf)时在注射过的幼鱼中挑取荧光强度相近的幼鱼随机分组并移至6孔板中(15条/孔)，使用溶有不同浓度药物的系统水浸泡(5mL)。以上实验均在光照培养箱中培养(28.5℃，14/10h光周期)，分组详见以下：
1)对照组(系统水，3dpf的幼鱼)；
2)雌二醇组(E2 5μg/L，3dpf的幼鱼进行药物处理)；
3)雌二醇+4-OHT组(E2 5μg/L+4-OHT 5μM，3dpf的幼鱼进行药物处理)；然后利用荧光体视镜成像(3.2倍，曝光250ms)(见图2)。
结果显示，E2可以增强特定转基因斑马鱼荧光表达，4-OHT与E2混合使用则会使荧光强度下降，F0代斑马鱼雌激素检测功能可实现。
4、Founder筛选：F0代斑马鱼的可遗传性筛选，进行PCR鉴定
F0代斑马鱼与野生型AB品系(由南京歆佳医药科技有限公司提供)杂交，通过PCR鉴定目的是否插入到基因组中：设计鉴定引物，产物长度622bp，提取10-20条2dpf的斑马鱼幼鱼的基因组，用相应的鉴定引物进行PCR鉴定，电泳检测(见图3)，选择大小正确的电泳条带测序，确定目的基因插入到基因组中。
表2引物名称和序列
| 引物名称 | 引物序列5′-3′ |
| ERE-F1 | GAGCCCAGTGACGTAGGAAG |
| ERE-R1 | GAGATCGAAATCATCGAGAGCA |
5、纯种筛选培养
选择鉴定正确的F1代成鱼分别与野生型斑马鱼AB杂交产F2代，然后进行功能验证(见图4)，选择满足要求的F2代进行养殖，F2代成鱼自交，获得F3代，F3代中纯合子比例理论上为1/4，F3代鉴定正确的成鱼分别与AB杂交，若后代均是阳性，则为纯合子，筛选纯合子继续培养。
本申请最终所得转基因斑马鱼在不同浓度的雌二醇(E2)下的肝脏荧光强度数据如图6所示，可对雌激素的浓度进行定性和定量的检测。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 杭州环特生物科技股份有限公司
<120> 一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgtgggag gttttttaat tcaagcttaa acaagaatct ctagt 45
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaattaaact gggcatcagc g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaagctac tgtcttctat cg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaattaaaaa acctcccaca cc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgctgatgcc cagtttaatt 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatagaagac agtagcttca t 21
<210> 7
<211> 760
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgaccaggt cacagtgacc tactcgacca ggtcacagtg acctactcga ccaggtcaca 60
gtgacctact cgaccaggtc acagtgacct actcgaccag gtcacagtga cctactcgag 120
cccagtgacg taggaagtcc atccattcac agcgcttcta taaaggcgcc agctgaggcg 180
cctactactc caaccgcgac tgcagcgagc aactgccacc atgaagctac tgtcttctat 240
cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag tgctccaaag aaaaaccgaa 300
gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac tctcccaaaa ccaaaaggtc 360
tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg ctagaaagac tggaacagct 420
atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt ttgaaaatgg attctttaca 480
ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat aatgtgaata aagatgccgt 540
cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta acattgagac agcatagaat 600
aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt caaagacagt tgactgtatc 660
gccggaattc ccggccgacg ccctggacga cttcgacctg gacatgctgc ctgctgatgc 720
tctcgatgat ttcgatctcg atatgctccc gggtaactaa 760
<210> 8
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagcccagtg acgtaggaag 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gagatcgaaa tcatcgagag ca 22
Claims (10)
1.一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）克隆斑马鱼雌激素响应元件ERE的DNA序列：合成获得5×ERE序列片段；
（2）构建质粒Tol2-5×ERE-GFF：将5×ERE序列片段融合入含一个GFF元件的质粒中，得到对雌激素有响应的Tol2-5×ERE-GFF质粒；
（3）胚胎显微注射及功能验证：将步骤（2）所得质粒注射至Tg（UAS:EGFP）转基因斑马鱼的受精卵中，并使用雌激素验证其雌激素荧光响应功能；
（4）Founder筛选：以步骤（3）所得受精卵长成的斑马鱼作为F0代，对F0代斑马鱼进行可遗传性筛选及PCR鉴定，将F0代斑马鱼与野生型AB品系斑马鱼杂交传至F1代，通过PCR鉴定目的基因是否插入到F1代斑马鱼的基因组中；
（5）纯种筛选培养：对通过鉴定的F1代斑马鱼进行培养，获得能够监测水体中环境雌激素的转基因斑马鱼系。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，合成5×ERE序列片段后将其克隆到pUC57载体上。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）具体为：
先通过PCR分别扩增以下片段：
通过上下游引物vector-F和vector-R扩增载体Tol2，模板为质粒Tol2-C1；其中vector-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，vector-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
通过上下游引物GFF-F1和GFF-R1扩增GFF和SV40 poly(A)片段，模板为质粒T-GFF；其中GFF-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，GFF-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
通过上下游引物ERE-F和ERE-R扩增5×ERE片段，模板为pUC57-5×ERE；其中ERE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，ERE-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
然后将各个片段用试剂盒Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit连接，转入DH5α感受态中，涂布于含有Ampicillin的LB平板上培养，得到核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的Tol2-5×ERE-GFF质粒。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中：将纯化后的Tol2-5×ERE-GFF质粒和TPase mRNA混合后共注射，其中两者的注射量比为（0.8-1.2）:1；注射完成后的受精卵于25-30℃的培养基培养。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中：注射阶段为受精卵的单细胞期。
6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中：使用雌激素验证其雌激素荧光响应功能的过程为：在受精后将注射过的幼鱼浸泡于含有诱导剂的溶液中，在恒温培养箱中培养，最终利用荧光显微镜成像，进行验证。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中：所述诱导剂为3-7μg/L的雌二醇或3-7μg/L的雌二醇+3-7μM的4-OHT。
8.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中：
在受精后3天将注射过的幼鱼浸泡于含有诱导剂的溶液中；和/或
培养箱的培养条件为25-30℃，14/10h光周期；和/或
荧光显微镜成像的条件为：3.2倍，曝光250ms。
9.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中：对F1代斑马鱼的鉴定方法为：设计鉴定引物ERE-F1和ERE-R1，提取10-20条斑马鱼幼鱼的基因组，用鉴定引物进行PCR鉴定；其中ERE-F1和ERE-R1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8-9所示。
10.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（5）具体为：对通过鉴定的F1代斑马鱼成鱼分别与野生型AB品系斑马鱼 杂交产F2代，然后进行功能验证，选择通过验证的F2代进行养殖，F2代成鱼自交，获得F3代，F3代中纯合子比例理论上为 1/4，F3代通过鉴定的成鱼分别与AB品系杂交，若后代均呈阳性，则为纯合子，筛选纯合子继续培养。
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