CN116210646A - 直接检测甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼构建方法 - Google Patents
直接检测甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116210646A CN116210646A CN202211620765.6A CN202211620765A CN116210646A CN 116210646 A CN116210646 A CN 116210646A CN 202211620765 A CN202211620765 A CN 202211620765A CN 116210646 A CN116210646 A CN 116210646A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- zebra fish
- fish
- thyroid hormone
- mcherry
- xtre
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
直接检测环境甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼构建方法，属于基因工程与环境科学领域，该方法包括：（1）克隆斑马鱼甲状腺激素受体响应元件7×TRE的DNA序列；（2）构建质粒Tol2‑7×TRE‑thrβ promoter‑mCherry；（3）胚胎显微注射及功能验证；（4）Founder筛选；（5）纯种筛选培养。按本发明方法所得的转基因斑马鱼中，甲状腺激素干扰物能刺激7×TRE响应，通过thrβ启动子激活斑马鱼眼球中mCherry的表达，从而达到方便、直观、动态检测环境甲状腺激素及其干扰物是否存在及其浓度的目的，为后续深入探索甲状腺激素及其干扰物毒性提供良好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程与环境科学领域，尤其涉及一种直接检测甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼构建方法。
背景技术
甲状腺是脊椎动物体内重要的内分泌腺，其分泌的甲状腺激素在人类和动物的生理过程中发挥着重要的作用，包括调节生长、能量代谢、组织分化和发育以及维护大脑功能等。环境中许多化学污染物，例如：多氯联苯(PCBs)、邻苯二甲酸酯类(PAEs)、酚类、二噁英(PCDD/Fs)、溴阻燃剂(BFRs)等，可以影响生物体甲状腺激素的合成、分泌、运输、作用和代谢过程，从而影响甲状腺的结构和功能，这类污染物被统称为甲状腺激素干扰物(TDCs)。TDCs能伴随人类生产、生活进入环境水体，对水生生态系统和人类健康造成威胁。
水体环境中TDCs的检测方法通常包括化学分析法和生物检测法。化学分析法测试精准，但仪器昂贵，操作复杂，而且不能直接检测出环境水体对甲状腺激素的生物干扰效应。生物检测法具有简洁、经济、快速、高效的优点，并且能直接表征环境水体对甲状腺激素的生物干扰效应。水环境中的TDCs浓度低，因此需要开发更快速、灵敏、高效的生物检测法，尤其是利用转基因等技术实现高效、高通量的检测，以全面、正确的评估甲状腺激素干扰物的健康风险。
欧洲经济与合作发展组织(OECD)和日本的生殖毒理学家采用斑马鱼(Zebrafish)作为检测水环境内分泌干扰物浓度的早期敏感对象。
斑马鱼中有两个基因与哺乳动物甲状腺激素受体(THRs)同源：thrα和thrβ。两种甲状腺激素受体均可与甲状腺激素响应元件(TRE)DNA序列结合，并以剂量依赖的方式激活胞内转录；并且thrβ在斑马鱼胚胎发育早期眼球中高水平表达。
发明内容
本发明提供了一种用于直接检测甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼的构建方法，按照本发明方法所得的转基因斑马鱼中，甲状腺激素干扰物能刺激7×TRE响应，激活mCherry在斑马鱼眼球中表达，从而达到方便、直观、动态检测环境甲状腺激素干扰物是否存在及其浓度的目的。
本发明的具体技术方案为：
一种用于直接检测甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼的构建方法，包括如下步骤：
(1)克隆斑马鱼雌激素响应元件TRE的DNA序列：合成获得7×TRE序列片段；
(2)构建质粒Tol2-7×TRE-Thrβpromoter-mCherry：将7×TRE序列片段和Thrβ启动子序列片段融合入含一个mCherry元件的质粒中，得到对甲状腺激素干扰物有响应的Tol2-7×TRE-Thrβpromoter-mCherry质粒；
(3)胚胎显微注射及功能验证：将步骤(2)所得质粒和转座酶mRNA共同注射至Tg斑马鱼的受精卵中，使受精卵发育2-4天，对长成的幼鱼使用甲状腺激素干扰物验证其荧光响应功能，筛选出眼睛颜色发生变化的斑马鱼幼鱼；
(4)Founder筛选：以步骤(3)筛选出的幼鱼长成的斑马鱼为F0代，将其与野生型AB品系斑马鱼杂交后形成F1代，并通过PCR鉴定目的基因是否插入到F1代斑马鱼的基因组中；
(5)纯种筛选培养：对通过鉴定的F1代斑马鱼进行培养，获得能够监测水体中环境甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼系；
所述步骤(5)具体为：通过鉴定的F1代斑马鱼成鱼分别与野生型AB品系斑马鱼杂交产F2代，然后通过在荧光显微镜下观察眼球荧光进行验证，选择眼球出现红色荧光的作为通过验证的F2代进行养殖，使通过验证的F2代成鱼自交，获得F3代；F3代中纯合子比例理论上为1/4，首先挑选出荧光显微镜下眼球出现红色荧光的F3代，然后通过PCR扩增测序的方式筛选出纯合子，或着将荧光显微镜下眼球出现红色荧光的F3代成鱼分别与野生型AB品系斑马鱼杂交，若后代均呈阳性，则为纯合子，筛选纯合子继续培养，从而得到能够监测水体中环境甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼系。
所述步骤(1)中，合成7×TRE序列片段后将其克隆到pUC57载体上。
所述步骤(2)具体为：先通过PCR分别扩增以下片段：
通过上下游引物TRE-F和TRE-R扩增7×TRE片段，模板为pUC57-7×TRE；其中TRE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，TRE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
通过上下游引物Thrβ-F和Thrβ-R扩增Thrβ启动子片段，模板为斑马鱼眼球cDNA；其中Thrβ-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，Thrβ-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
通过上下游引物mCherry-F和mCherry-R扩增mCherry片段，模板为T-mCherry；其中mCherry-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，mCherry-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
然后将各个片段用试剂盒Rapid DNA Ligation Kit与质粒pTol2连接，转入DH5α感受态中，涂布于含有Ampicillin的LB平板上培养，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的Tol2-7×TRE-Thrβpromoter-mCherry质粒。
所述步骤(3)中，将纯化后的Tol2-7×TRE-Thrβpromoter-mCherry质粒和TPasemRNA混合后共注射，其中两者的注射量比为1:(2-5)；注射完成后的受精卵于28℃的胚胎培养液中培养。
所述步骤(3)中，注射阶段为受精后1hpf内单细胞期。
本发明限定在上述阶段注射的原因是注射物可以对之后分裂形成的所有细胞发生作用。
所述步骤(3)中：使用甲状腺激素或干扰物验证其甲状腺激素及其干扰物荧光响应功能的过程为：在受精后将注射过的幼鱼浸泡于含有诱导剂的溶液中，在光照培养箱中培养，最终利用荧光显微镜成像，进行验证。
所述步骤(3)中，所述诱导剂为1-10μg/L的双酚S或1-10μg/L的T3。
所述步骤(3)中，在受精后2-4天将注射过的幼鱼浸泡于含有诱导剂的溶液中。
所述步骤(3)中，光照培养箱的培养条件为28℃，12/12h光周期；
所述步骤(3)中，荧光体视镜成像的条件为：4倍，曝光200ms。
所述步骤(3)中的筛选出眼睛颜色发生变化的斑马鱼幼鱼，具体为使用甲状腺干扰物对生长2-4天的幼鱼进行诱导，挑选荧光显微镜下眼球发射红色荧光的斑马鱼。
所述步骤(4)中，对F1代斑马鱼的鉴定方法为：设计鉴定引物TRE-F1和TRE-R1，提取5-10条斑马鱼幼鱼的基因组，用鉴定引物进行PCR鉴定。其中TRE-F1和TRE-R1的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.8-9所示。
所述方法构建的转基因斑马鱼的应用，其特征在于所述转基因斑马鱼在甲状腺激素及其干扰物快速筛选中的应用。
所述方法构建的转基因斑马鱼对甲状腺激素及其干扰物快速筛选的方法，其特征在于包括以下步骤：
提取含有化学物的溶液，将权利要求1所述方法构建的转基因斑马鱼所产胚胎在化学物溶液中暴露，当所述转基因斑马鱼胚胎长成幼鱼时，如果所述幼鱼在荧光显微镜下表现为眼球产生红色荧光，即可判定该化学物溶液含有甲状腺激素或其干扰物。
所述的筛选方法，其特征在于首先将所构建的转基因斑马鱼系进行饲养和培育，包括：使用斑马鱼养殖系统，水温控制在26-28℃，盐度调节至0.25-0.75‰，溶解氧大于6mg/L，光周期为12h：12h(昼：夜)；将斑马鱼以雌雄比2:1/3:1的比例分隔置于配鱼缸内，次日清晨将配鱼缸中的隔板移除，在光照刺激下产卵，收集受精卵置于含有胚胎培养液的培养皿中，静置在恒温孵化箱中2h后，挑除死亡胚胎，剩余发育良好的胚胎用于后续暴露在化学物溶液中的实验。
本发明的原理为：甲状腺激素及其干扰物+甲状腺激素受体→7×TRE激活→mCherry表达。也就是说，按照本发明方法所得的转基因斑马鱼中，甲状腺激素干扰物能刺激7×TRE响应，通过位于眼球的thrβ启动子激活mCherry的表达，从而达到方便、直观、动态检测环境雌激素是否存在及其浓度的目的。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
(1)通过本发明方法所得的转基因斑马鱼眼球可稳定表达红色荧光蛋白mCherry，且蛋白表达水平受环境甲状腺激素及其干扰物浓度依赖性的诱导，因而该转基因斑马鱼可用于探测环境中的甲状腺激素及其干扰物的存在及浓度。
(2)本发明所得转基因斑马鱼检测的样品不需复杂的前处理，实验结果在荧光显微镜下直观可见，通过眼球荧光的有无、强弱判断有雌激素活性的物质的存在与否与含量多少。
(3)斑马鱼兼具体外实验与体内实验的优点，使用本发明所得转基因甲状腺激素及其干扰物斑马鱼的检测方法周期短，费用低，能反应甲状腺激素及其干扰物在体内代谢产物整体的毒性情况，结果与人相关性高。
附图说明
图1为实施例1中Tol2-7×TRE-Thrβpromoter-mCherry质粒图谱。
图2为实施例1中F0代甲状腺激素干扰物检测功能验证荧光图(上为对照组，下为BPS处理组)。
图3为实施例1中F2代甲状腺激素干扰物检测功能验证荧光图(上为对照组，下为BPS处理组)。
图4为双酚S(BPS)和T3在不同浓度下的荧光强度对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
1、克隆斑马鱼甲状腺激素响应元件(TRE)DNA序列
查找ERE片段，合成7×TRE片段并克隆到pUC57载体上。
2、构建质粒Tol2-7×TRE-Thrβpromoter-mCherry用PCR扩增各个片段，引物序列见表1：
表1.质粒构建的引物名称和序列
| 引物名称 | 引物序列5’-3’ |
| TRE-F | AGGTCATTTTAG |
| TRE-R | TGACCTAAAATG |
| Thrβ-F | CCCAGTGACGTAGGAAG |
| Thrβ-R | AGTTGCTCGCTGCAGTC |
| mCherry-F | ATGGTGAGCAAG |
| mCherry-R | CTTGTACAGCTCG |
其中，扩增7×TRE片段的引物为TRE-F和TRE-R，模板为质粒Puc57-7×ERE；
扩增Thrβ启动子片段的引物为Thrβ-F和Thrβ-R，模板为斑马鱼眼球cDNA；
扩增mCherry片段的引物为mCherry-F和mCherry-R，模板为质粒T-mCherry；
然后将各个片段用试剂盒Rapid DNA Ligation Kit与质粒pTol2连接，转入DH5α感受态中，涂布于含有Ampicillin的LB平板上培养，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的Tol2-7×TRE-Thrβpromoter-mCherry质粒：
上述序列中，其中第一段下划线部分
第二段下划线部分
第三段下划线部分
3、胚胎显微注射及功能验证
纯化后的质粒Tol2-7×TRE-Thrβpromoter-mCherry和TPase mRNA混合后共注射，其中两者的注射量均为10pg:20pg。注射的斑马鱼胚胎品系为Tg(购买自国家斑马鱼资源中心)，注射阶段为1hpf的单细胞期；注射完成后的胚胎收集到胚胎培养液中于28℃下培养。
在受精后4天(4dpf)时在注射过的幼鱼中挑取荧光强度相近的幼鱼随机分组并移至6孔板中(10条/孔)，使用溶有不同浓度药物的系统水浸泡(2mL)。以上实验均在光照培养箱中培养(28℃，12/12h光周期)，分组详见以下：
1)对照组(系统水，4dpf的幼鱼)；
2)甲状腺激素干扰物组(BPS 5μg/L，4dpf的幼鱼进行药物处理)；然后利用荧光体视镜成像(4倍，曝光200ms)(见图2)。
结果显示，BPS可以增强特定转基因斑马鱼荧光表达，F0代斑马鱼甲状腺激素干扰物检测功能可实现。
4、Founder筛选：F0代斑马鱼筛选，使用甲状腺干扰物对生长至4天的幼鱼进行诱导，挑选荧光显微镜下眼球发射红色荧光的斑马鱼，将其与野生型AB品系斑马鱼(购买自国家斑马鱼资源中心)杂交传至F1代，并通过PCR鉴定目的基因是否插入到F1代斑马鱼的基因组中：设计鉴定引物，产物长度925bp，提取5-10条2dpf的斑马鱼幼鱼的基因组，用相应的鉴定引物进行PCR鉴定，选择大小正确的电泳条带测序，确定目的基因插入到基因组中。
表2引物名称和序列
| TRE-F1 | AGGTCATTTTAGGTCA |
| TRE-R1 | CTTGTACAGCTCGTCC |
5、纯种筛选培养选择鉴定正确的F1代成鱼分别与野生型斑马鱼AB杂交产F2代，然后进行功能验证(见图3)，选择满足要求的F2代进行养殖，F2代成鱼自交，获得F3代，F3代中纯合子比例理论上为1/4，F3代鉴定正确的成鱼分别与AB杂交，若后代均是阳性，则为纯合子，筛选纯合子继续培养。
本申请最终所得转基因斑马鱼在不同浓度的BPS和T3下的眼球荧光强度数据如图4所示，可对甲状腺激素及其干扰物的浓度进行定性和定量的检测。
利用本发明方法构建的转基因斑马鱼检测环境甲状腺激素干扰物具有以下优点：
(1)48h即可完成检测，处理周期短，操作简便。双酚S浓度为1ng/mL时即可表达荧光(图3)，检测灵敏度较强。且荧光强度在1-100ng/mL范围内与双酚S正相关。本发明的转基因斑马鱼在实际应用中的检测范围更大，可对双酚S、T3的浓度进行定性和定量的检测。
(2)经甲状腺激素及其干扰物诱导的斑马鱼胚胎在眼球处有明显的mCherry荧光表达，可以对环境中的甲状腺激素及其干扰物更方便、快捷的进行检测。
(3)本发明构建的转基因斑马鱼可作为进一步探讨甲状腺激素及其干扰物信号在体内的生理作用的有价值的模型。可反映甲状腺激素及其干扰物对斑马鱼眼球发育的影响。
Claims (10)
1.一种直接检测甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼构建方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）克隆斑马鱼雌激素响应元件TRE的DNA序列：合成获得7×TRE序列片段；
（2）构建质粒Tol2-7×TRE-Thrβ promoter-mCherry：将7×TRE序列片段和Thrβ启动子序列片段融合入含一个mCherry元件的质粒中，得到对甲状腺激素干扰物有响应的Tol2-7×TRE-Thrβ promoter-mCherry质粒；
（3）胚胎显微注射及功能验证：将步骤(2) 所得质粒和转座酶mRNA共同注射至Tg斑马鱼的受精卵中，使受精卵发育2-4天，对长成的幼鱼使用甲状腺激素干扰物验证其荧光响应功能，筛选出眼睛颜色发生变化的斑马鱼幼鱼；
（4）Founder筛选：以步骤（3）筛选出的幼鱼长成的斑马鱼为F0代，将其与野生型AB品系斑马鱼杂交后形成F1代，并通过PCR鉴定目的基因是否插入到F1代斑马鱼的基因组中；
（5）纯种筛选培养：对通过鉴定的F1代斑马鱼进行培养，获得能够监测水体中环境甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼系；
所述步骤（5）具体为：通过鉴定的F1代斑马鱼成鱼分别与野生型AB品系斑马鱼杂交产F2代，然后通过在荧光显微镜下观察眼球荧光进行验证，选择眼球出现红色荧光的作为通过验证的F2 代进行养殖，使通过验证的F2代成鱼自交，获得F3代；F3代中纯合子比例理论上为 1/4，首先挑选出荧光显微镜下眼球出现红色荧光的F3代，然后通过PCR扩增测序的方式筛选出纯合子，或着将荧光显微镜下眼球出现红色荧光的F3代成鱼分别与野生型AB品系斑马鱼杂交，若后代均呈阳性，则为纯合子，筛选纯合子继续培养，从而得到能够监测水体中环境甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼系。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述步骤（1）中，合成7×TRE序列片段后将其克隆到pUC57载体上。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述步骤（2）具体为：
先通过PCR分别扩增以下片段：
通过上下游引物TRE-F和TRE-R扩增7×TRE片段，模板为pUC57-7×TRE；其中TRE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，TRE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；
通过上下游引物Thrβ-F和Thrβ-R扩增Thrβ启动子片段，模板为斑马鱼眼球cDNA；其中Thrβ-F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，Thrβ-F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；
通过上下游引物mCherry-F和mCherry-R扩增mCherry片段，模板为T-mCherry；其中mCherry-F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，mCherry-F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
然后将各个片段用试剂盒Rapid DNA Ligation Kit与质粒pTol2连接，转入DH5α感受态中，涂布于含有Ampicillin的LB平板上培养，得到核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示的Tol2-7×TRE-Thrβ promoter-mCherry质粒。
4. 如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述步骤（3）中，将纯化后的Tol2-7×TRE-Thrβ promoter-mCherry质粒和转座酶 mRNA混合后共注射至受精后1 hpf内处于单细胞期的转基因斑马鱼胚胎，其中两者的注射量比为1:(2~5)；注射完成后的受精卵于28℃的胚胎培养液中培养；
所述步骤（3）中，使用甲状腺激素干扰物验证其甲状腺激素干扰物荧光响应功能的过程为：在受精后将注射过的幼鱼浸泡于含有诱导剂的溶液中，在恒温培养箱中培养，最终利用荧光显微镜成像，进行验证。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述步骤（3）中，所述诱导剂为1-10μg/L的双酚S（BPS）或1-10μg/L的三碘甲状腺原氨酸（T3）。
6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述步骤（3）中，光照培养箱的培养条件为28℃，12/12h光周期；荧光显微镜成像的条件为：4倍，曝光200ms。
7. 如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述步骤（4）中，对F1代斑马鱼的鉴定方法为：设计鉴定引物TRE-F1和TRE-R1，提取5-10条斑马鱼幼鱼的基因组，用鉴定引物进行PCR 鉴定；其中TRE-F1和TRE-R1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO .8-9所示。
8.权利要求1所述方法构建的转基因斑马鱼的应用，其特征在于所述转基因斑马鱼在甲状腺激素及其干扰物快速筛选中的应用。
9.利用权利要求1所述方法构建的转基因斑马鱼对甲状腺激素及其干扰物快速筛选的方法，其特征在于包括以下步骤：
提取含有化学物的溶液，将权利要求1所述方法构建的转基因斑马鱼所产胚胎在化学物溶液中暴露，当所述转基因斑马鱼胚胎长成幼鱼时，如果所述幼鱼在荧光显微镜下表现为眼球产生红色荧光，即可判定该化学物溶液含有甲状腺激素或其干扰物。
10.如权利要求9所述的筛选方法，其特征在于首先将所构建的转基因斑马鱼系进行饲养和培育，包括：使用斑马鱼养殖系统，水温控制在26-28℃，盐度调节至0.25-0.75‰，溶解氧大于6mg/L，光周期为12h：12h(昼：夜)；将斑马鱼以雌雄比2:1/3:1的比例分隔置于配鱼缸内，次日清晨将配鱼缸中的隔板移除，在光照刺激下产卵，收集受精卵置于含有胚胎培养液的培养皿中，静置在恒温孵化箱中2h后，挑除死亡胚胎，剩余发育良好的胚胎用于后续暴露在化学物溶液中的实验。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211620765.6A CN116210646A (zh) | 2022-12-16 | 2022-12-16 | 直接检测甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211620765.6A CN116210646A (zh) | 2022-12-16 | 2022-12-16 | 直接检测甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116210646A true CN116210646A (zh) | 2023-06-06 |
Family
ID=86572029
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211620765.6A Pending CN116210646A (zh) | 2022-12-16 | 2022-12-16 | 直接检测甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116210646A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117958186A (zh) * | 2024-04-01 | 2024-05-03 | 水利部交通运输部国家能源局南京水利科学研究院 | 鱼类全生活史生境需求的生态流量过程水温过程确定方法 |
-
2022
- 2022-12-16 CN CN202211620765.6A patent/CN116210646A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117958186A (zh) * | 2024-04-01 | 2024-05-03 | 水利部交通运输部国家能源局南京水利科学研究院 | 鱼类全生活史生境需求的生态流量过程水温过程确定方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10080355B2 (en) | Inducible animal models of stress behavior | |
| Cenik et al. | Maternal ribosomes are sufficient for tissue diversification during embryonic development in C. elegans | |
| CN106222204B (zh) | 一种黄鳝基因编辑的方法 | |
| Ako et al. | Simultaneous visualization of multiple neuronal properties with single-cell resolution in the living rodent brain | |
| Avanesov et al. | Analysis of the retina in the zebrafish model | |
| CN116210646A (zh) | 直接检测甲状腺激素及其干扰物的转基因斑马鱼构建方法 | |
| CN105274140A (zh) | 肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法 | |
| Sasado et al. | The National BioResource Project Medaka (NBRP Medaka): an integrated bioresource for biological and biomedical sciences | |
| Denver et al. | Comparative endocrinology in the 21st century | |
| CN107058386A (zh) | 一种转基因斑马鱼的制备方法 | |
| Malicki et al. | Analysis of gene function in the zebrafish retina | |
| Balay et al. | Analysis of zebrafish cryptochrome 2 and 4 expression in UV cone photoreceptors | |
| KR100984643B1 (ko) | 에스트로겐 반응성 리포터 유전자가 도입된 제브라피쉬 및이를 이용한 에스트로겐 화합물의 스크리닝 방법 | |
| CN1297664C (zh) | 表达二荧光基因之重组质粒 | |
| CN110592122B (zh) | 斑马鱼naalad2基因启动子及其应用 | |
| CN112522278B (zh) | 基于美洲大蠊嗅觉受体基因OR3X设计的dsRNA、编码基因及其制备方法与应用 | |
| Coverdale et al. | Not just a fishing trip-Environmental genomics using zebrafish | |
| CN112852872A (zh) | 一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法 | |
| CN106434680A (zh) | 一种虾类雄性化基因及其应用 | |
| CN106755099B (zh) | 一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法 | |
| US20040031065A1 (en) | Neuronal activation in a transgenic model | |
| Touzot et al. | Large-scale deregulation of gene expression by artificial light at night in tadpoles of common toads | |
| CN109880850A (zh) | 一种双转基因斑马鱼生物传感器及其构建方法和应用 | |
| Wang et al. | Song control nuclei in male and female large-billed crows (Corvus macrorhynchos) | |
| Zheng et al. | Prolonged electrolysis injures the neural development of zebrafish (Danio rerio) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |