CN106755099B - 一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型,所述在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型,其基因BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为荧光蛋白序列,荧光信号均特异性地表达在胰岛β细胞中,可以指示活体内胰岛β细胞钙离子信号变化。本发明创建了第一个可以指示活体内胰岛β细胞功能的动物模型,本发明的转基因斑马鱼系在其活体中可以实时观测胰岛β细胞内钙信号的变化,直观并准确地报告胰岛β细胞功能状态。运用该转基因斑马鱼系,可以在活体水平进行便捷、自动化和高通量地分析胰岛β细胞的功能特点,从而实现对于促进胰岛β细胞功能药物的高通量筛选,具有重要的现实意义和广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,涉及治疗糖尿病药物筛选的技术领域,尤其涉及一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病。其发病原因主要是机体不能分泌足够的胰岛素或者胰岛素的下游靶器官组织发生了胰岛素抵抗,不能有效地降低血糖,从而引起血糖升高,糖尿病发病和进一步的各种严重的并发症。来自全球的研究数据显示,2013年全世界糖尿病患病人数估计达到3.82亿,我国糖尿病患病人数约达1.139亿,已成为糖尿病第一大国。糖尿病已经发展成为危害人类健康、社会和经济发展的全球性问题,大力发展糖尿病基础研究和促进其研究成果向临床应用转化,已成为世界各国的迫切需要。
作为机体内唯一产生和分泌胰岛素的细胞,胰岛β细胞的功能和数量在糖尿病的发病过程中起着决定性的作用。目前,利用高通量筛选(High-ThroughputScreening,HTS)促进胰岛β细胞数目和功能的药物,是一种治疗糖尿病非常有前景的方案。现在的研究主要集中于促进胰岛β细胞增生的药物筛选,然而,应用β细胞系或原代细胞体外筛选除了会造成与体外环境相关的假象外,也不能筛得间接促进(通过影响其它胰腺细胞或其它器官)β细胞增生的化合物。而斑马鱼因为其透明、占地小、较低廉的饲养费用成为理想的高通量筛选的动物模型。DidierY.R.Stainier研究组利用基于荧光的泛素化细胞周期指标(fucci)技术,创建了可以标记分裂期的β细胞的转基因斑马鱼,并利用该体系进行了高内涵筛选(HighContentScreening,HCS),得到20种可以在体促进β细胞增殖的小分子。这些分子虽然结构迥异,但主要调节三个特异的信号途径:血清素,视黄酸和糖皮质激素。
然而,关于促胰岛β细胞功能的新药筛选方面的研究目前仍处于空白状态,最主要的原因是缺乏一个可以在体便捷可行地甚至自动化地评价胰岛β细胞功能的动物模型。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足,本发明的目的是提供一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型,从而可以在体观测胰岛β细胞的功能。
本发明的另一个目的是提供一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法。
为了实现上述目的,本发明是通过以下技术方案予以实现的。
一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型,斑马鱼BAC_CH211_69I14(BACPACResourcesCenter)包含基因preproinsulin(ins)的全部序列,斑马鱼BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为荧光蛋白序列,荧光信号均特异性地表达在胰岛β细胞中,可以指示活体内胰岛β细胞钙离子信号变化。
优选地,所述荧光蛋白序列为红色荧光蛋白Rcamp1.07;所述红色荧光蛋白Rcamp1.07是一种特异性指示钙离子浓度的红色荧光蛋白。
优选地,利用RecE/RecT同源重组技术把BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为Rcamp1.07的序列。
一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法,包括以下步骤:
S1.获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列和构建PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒;
S2.转基因斑马鱼的创建;
S3.转基因斑马鱼的鉴定。
优选地,利用RecE/RecT同源重组技术把BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为红色荧光蛋白Rcamp1.07的序列,将Rcamp1.07及其前后的ins调节序列进一步通过同源重组亚克隆到含有两个I-SceI大范围核酸酶酶切位点的质粒中,最终将上述得到的质粒与大范围核酸酶I-SceI共同注射到斑马鱼胚胎处于单细胞阶段的受精卵中,筛选出在胰岛β细胞表达Rcamp1.07荧光蛋白并且具有种系传递的F0代阳性斑马鱼,根据Rcamp1.07的荧光信号的强度,选择表达量较强的Tg(ins:Rcamp1.07)鱼系进行大量繁殖。
优选地,上述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法,所述的获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列和构建PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒,包括以下步骤:
S1.获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列;
S2.把红色荧光蛋白Rcamp1.07蛋白编码序列克隆到R6K中间载体上;
S3.设计分别包含ins蛋白编码序列起始ATG上游同源序列和下游同源序列的引物对,PCR扩增Rcam1.07-frt-kana-frt序列,然后转染到含有RecE/RecT同源重组系统和BAC_ins的大肠杆菌中,利用卡那霉素筛选Rcamp1.07-frt-kana-frt基因成功插入到BAC_ins载体ins启动子下游的克隆BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt;
S4.设计分别包含ins基因最上游同源序列和最下游同源序列的引物对,扩增两端携带I-SceI酶切位点的PNPC2载体片段,该PNPC2载体片段包含诺尔丝菌素抗性基因cloNAT,转染到含有RecE/RecT同源重组系统和BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的大肠杆菌中,利用诺尔丝菌素筛选出生成PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt重组质粒的大肠杆菌克隆;
S5.转染表达flpe的质粒到含有PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的克隆中,催化两个frt序列的同源重组,去掉卡那霉素抗性基因,最终得到含有质粒PNPC2-ins-Rcamp1.07的大肠杆菌克隆。
更优选地,上述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法,所述步骤S3的引物对为:
L:5’-ATGTTTTTGATTGACAGAGATTGTATGTGTGTGTTTGTGTCAGTGTGACCCGCCACCATGGGTTCTCATC-3’;
R:5’-CCTGTGTGCAAACAGGTGTTTCTGGCATCGGCGGTGGTCAAATCTCTTCAGGCAGATCGTCAGTCAG-3’。
更优选地,上述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法,所述步骤S4的引物对为:
L:5’-AGTCCATTAAATAATATCTTGTAGAATTATGTTTTTAAAAAGTACCAATGCCGTAGGGATAACAGGGTAATTTAAGC-3’;
R:5’-CAACTTTTTCACAAACACTGACCAAAACAAGCTACATGTTTTAGAGGCATTAGGGATAACAGGGTAATTGCACTG-3’。
优选地,上述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法,所述转基因斑马鱼的创建,包括以下步骤:
S1.将核酸内切酶I-SceI与上述PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒共同注射到斑马鱼胚胎处于单细胞阶段的受精卵中,随机将ins-Rcamp1.07序列整合到斑马鱼的基因组中;
S2.将上述注射了PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒的F0代胚胎养到2天鱼龄的时候,运用配备汞灯的体式镜或者宽场荧光显微镜进行筛选,将Rcamp1.07荧光信号正确定位于胰岛部位的幼鱼挑选出来,培养待其性成熟用于繁殖下一代;
S3.将成年的F0代转基因鱼与AB野生型斑马鱼杂交,产生的F1代在2天鱼龄时用上述同样方法筛选出在胰岛中表达Rcamp1.07的阳性胚胎,选择阳性胚胎转基因斑马鱼F1代继续养殖。
以上所述的在体筛选促胰岛β细胞功能药物的斑马鱼模型在筛选促胰岛β细胞功能药物中的应用。
更优选地,该转基因斑马鱼模型可以指示活体内胰岛β细胞钙离子信号变化,在宽场荧光显微镜下,可以在体实时观测和指示胰岛β细胞群体的功能状态;在双光子三轴光片层荧光显微镜2P3A-DSLM的高分辨率下,可以观察活体状态下转基因斑马鱼模型的单个胰岛β细胞的功能状态;通过直接观测胰岛β细胞内钙信号变化从而直观地评价活体中胰岛β细胞的功能。
免疫荧光实验结果表明本发明创建的Tg(ins:Rcamp1.07)转基因斑马鱼系中Rcamp1.07的荧光信号均特异性地表达在胰岛β细胞中。在宽场显微镜下观测受精后3天的Tg(ins:Rcamp1.07)幼鱼,当用20mM葡萄糖刺激时,其胰岛β细胞的荧光强度明显升高,反映了葡萄糖刺激下细胞膜去极化引起的钙离子内流。综上所述,本发明成功创建了可以在体实时观测和指示胰岛β细胞功能的转基因斑马鱼模型,通过直接观测胰岛β细胞内钙信号变化从而直观地评价活体中胰岛β细胞的功能。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、相比于DidierY.R.Stainier研究组创建的可以指示β细胞增殖的转基因斑马鱼,本发明的转基因斑马鱼模型是第一个可以指示活体内胰岛β细胞功能的动物模型。
2、本发明的转基因斑马鱼可以在其活体中可以实时观测胰岛β细胞内钙信号的变化,直观并准确地报告胰岛β细胞功能状态;运用该转基因斑马鱼系,可以在活体水平进行便捷、自动化和高通量地分析胰岛β细胞的功能特点,从而实现对于促进胰岛β细胞功能药物的高通量筛选。
3、使用普通的宽场荧光显微镜,可以观察活体状态下转基因斑马鱼模型的胰岛β细胞群体的功能状态,即胰岛β细胞群体响应葡萄糖刺激而产生钙离子信号增强及周期性波动;使用双光子三轴光片层荧光显微镜2P3A-DSLM在高分辨率,可以观察活体状态下转基因斑马鱼模型的单个胰岛β细胞的功能状态,可以得到单个胰岛β细胞的高时空分辨率的Ca2+信号随时间变化的荧光曲线。
4、本发明的转基因斑马鱼模型可以应用于筛选促进胰岛β细胞功能药物中,也可以为筛选药物动物模型的构建提供了方法,具有重要的现实意义和广泛的应用前景。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明,但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制,对于本领域的普通技术人员,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1为包含斑马鱼preproinsulin序列的细菌人工染色体(BAC_ins)。
图2为RecE/RecT系统介导同源重组的发生机制。
图3为PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒的构建图谱。
图4为斑马鱼胚胎显微注射以及转基因斑马鱼F0代筛选的示意图以及结果。
其中,图a:将大范围核酸内切酶I-SceI与PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒共同注射到斑马鱼胚胎处于单细胞阶段的受精卵中,每枚受精卵注射大约1nL的混合液;培养至2天鱼龄时,在宽场荧光显微镜下筛选在胰岛位置表达Rcamp1.07的F0代斑马鱼并培养;
图b:在宽场荧光显微镜下Rcamp1.07正确表达在胰岛部位的转基因斑马鱼F0代胚胎;
图c:在子代F1代中遗传了ins-Rcamp1.07转基因的F0代斑马鱼的生殖系转基因效率的评估。
图5为对3天鱼龄Tg(ins:Rcamp1.07)转基因斑马鱼进行整胚胰岛素抗体免疫荧光染色后胰岛部位的共聚焦显微镜成像。
其中,图a:Rcamp1.07蛋白的红色荧光信号;
图b:绿色荧光信号指示用胰岛素抗体标记的胰岛素的表达;
图c:对a,b两个通道的荧光信号进行合并;标尺,10μm。
图6为宽场显微镜下Tg(ins:Rcamp1.07)转基因斑马鱼响应葡萄糖刺激的钙离子信号的实时成像。
其中,图a:蒙太奇图为2天鱼龄的Tg(ins:Rcamp1.07)转基因斑马鱼胚胎于3mM葡萄糖下孵育20min、再加入20mM葡萄糖刺激60min,在此期间每隔一段时间所拍摄的胰岛荧光图像,箭头标注了发生钙离子内流的胰岛区域;
图b:对a中标注的胰岛区域进行荧光曲线分析;标尺,50μm。
图7为双光子三轴光片层荧光显微镜下Tg(ins:Rcamp1.07)转基因斑马鱼响应葡萄糖刺激的钙离子信号的实时成像。
其中,图a:双光子三轴光片层荧光显微镜下在体观测Tg(ins:Rcamp1.07)斑马鱼胰岛β细胞功能的示意图;
图b:对3天鱼龄的Tg(ins:Rcamp1.07)斑马鱼胚胎进行活体成像和三维重构;
图c:蒙太奇图为对b中3天鱼龄的Tg(ins:Rcamp1.07)斑马鱼胚胎加入20mM葡萄糖刺激后,在15μm和30μm两个层面每隔20s时间间隔所拍摄的代表性图像,箭头标注了3个发生钙离子内流的胰岛β细胞;
图d:对图c中标注的胰岛β细胞进行荧光曲线分析;标尺,10μm。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规分子生物学方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1:斑马鱼模型的构建
1、PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒的构建
1.1斑马鱼胰岛素BAC_ins完整基因序列的获取
斑马鱼BAC_CH211_69I14(BACPACResourcesCenter),包含斑马鱼preproinsulin(ins)基因的全部序列以及与其紧邻的上下游基因(如图1)。
1.2斑马鱼胰岛素BAC_ins基因修饰
使用RecE/RecT同源重组系统对斑马鱼胰岛素BAC_ins基因进行修饰,选用来自λ噬菌体的RecE/RecT同源重组系统,RecE是一种5’-3’核酸外切酶,暴露出单链DNA的3’粘性末端;RecT是一种单链结合蛋白,它可以结合在单链DNA的3’粘性末端上,并介导其与另一条双链DNA上或基因组上的同源序列发生同源重组,从而将目的基因插入和替换(如图2)。
1.3PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒的构建
利用RecE/RecT同源重组技术把BAC_CH211_69I14上ins基因蛋白编码序列替换为Rcamp1.07的序列,进一步通过同源重组把修饰后的ins基因全序列亚克隆到含有两个I-SceI大范围核酸酶酶切位点的载体上,生成PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒(如图3)。因为Rcamp1.07是一种指示Ca2+浓度的红色荧光蛋白,与Ca2+结合后,Rcamp1.07的构象发生变化,可以在561nm激光激发下,产生584nm左右的激发光谱,从而指示Ca2+浓度变化。
1.4PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒的具体构建过程,包括如下步骤:
S1.把Rcam1.07蛋白编码序列克隆到R6K中间载体上,使其下游是frt-kana-frt序列,kana是编码卡那霉素抗性蛋白。
S2.设计分别包含ins蛋白编码序列起始ATG上游或下游同源序列的引物,PCR扩增Rcam1.07-frt-kana-frt序列,然后转染到含有RecE/RecT同源重组系统和BAC_ins的大肠杆菌中,利用卡那霉素筛选Rcamp1.07-frt-kana-frt基因成功插入到BAC_ins载体ins启动子下游的克隆BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt,所述引物为:
L:5’-ATGTTTTTGATTGACAGAGATTGTATGTGTGTGTTTGTGTCAGTGTGACCCGCCACCATGGGTTCTCATC-3’,
R:5’-CCTGTGTGCAAACAGGTGTTTCTGGCATCGGCGGTGGTCAAATCTCTTCAGGCAGATCGTCAGTCAG-3’;
S3.设计分别包含了ins基因最上游和最下游同源序列的引物,扩增两端携带I-SceI酶切位点的PNPC2载体片段,包含诺尔丝菌素抗性基因cloNAT,转染到含有RecE/RecT同源重组系统和BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的大肠杆菌中,利用诺尔丝菌素筛选出生成PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt重组质粒的大肠杆菌克隆,在该克隆中PNPC2载体片段成功替换掉BAC上除了修饰后的ins基因之外的全部序列,所述引物为:
L:5’-AGTCCATTAAATAATATCTTGTAGAATTATGTTTTTAAAAAGTACCAATGCCGTAGGGATAACAGGGTAATTTAAGC-3’,
R:5’-CAACTTTTTCACAAACACTGACCAAAACAAGCTACATGTTTTAGAGGCATTAGGGATAACAGGGTAATTGCACTG-3’;
S4.转染表达flpe的质粒到含有PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的克隆中,催化两个frt序列的同源重组,去掉卡那霉素抗性基因,最终得到含有质粒PNPC2-ins-Rcamp1.07的大肠杆菌克隆。
2、转基因斑马鱼Tg(ins:Rcamp1.07)的创建
2.1斑马鱼胚胎显微注射
在受精卵中或其卵裂形成的胚胎细胞过程中,I-SceI可以识别质粒PNPC2-ins-Rcamp1.07上的两个I-SceI识别位点,切割并结合在酶切产物的两个末端上,随机将ins-Rcamp1.07序列整合到斑马鱼的基因组中。将大范围核酸内切酶I-SceI和PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒共同注射到斑马鱼的受精卵中(如图4),受精卵处于单细胞阶段;内切酶的最终总效价为20U,质粒的终浓度为100ng/ul。
2.2转基因斑马鱼F0代的筛选
将注射了PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒的斑马鱼F0代胚胎养到2天鱼龄,运用配备汞灯的体式镜或者宽场荧光显微镜对其进行筛选,将Rcamp1.07荧光信号正确定位于胰岛部位的幼鱼挑选出来,培养至其性成熟;将成年的F0代转基因鱼与AB野生型斑马鱼杂交,对2天鱼龄的F1代筛选出在胰岛中表达Rcamp1.07的阳性胚胎,使用的方法与F0代相同;选择荧光信号最强的Tg(ins:Rcamp1.07)转基因斑马鱼F1代继续养殖,并将其后代进行大量扩增。
实施例2:转基因斑马鱼模型的鉴定
为了进一步验证实施例1所构建的Tg(ins:Rcamp1.07)转基因斑马鱼中胰腺β细胞被特异性地标记了Rcamp1.07,运用斑马鱼整胚免疫荧光染色技术,用胰岛素抗体荧光标记3天鱼龄的Tg(ins:Rcamp1.07)转基因鱼中的胰腺β细胞,观察Rcamp1.07的信号是否准确定位在胰腺β细胞当中,结果显示,Rcamp1.07的红色荧光信号定位在由胰岛素insulin抗体标记出来的胰岛β细胞当中(如图5),本发明构建的Tg(ins:Rcamp1.07)转基因斑马鱼是准确报告胰腺β细胞特性的转基因斑马鱼系β-cell-specificreporterfish。
实施例3:转基因斑马鱼模型的应用
1.转基因斑马鱼胰岛β细胞群体的应用
试验方法:使用普通的宽场荧光显微镜;
S1.将Tg(ins:Rcamp1.07)转基因鱼孵育在外液E3中,使用普通的宽场荧光显微镜,选用561nm波长的激光照射斑马鱼整胚;找到红色荧光信号所在的斑马鱼胰岛部位,精细调节焦面,使得胰岛位于显微镜的焦平面位置,拍摄20min的基础钙信号。
S2.往外液加入20mM葡萄糖刺激,继续拍摄钙信号60min;记录活体斑马鱼内胰岛β细胞群体的钙离子信号随时间的变化。
E3外液的成分为:5.0mMNaCl,0.17mMKCl,0.33mMCaCl2,0.33mMMgSO4。
结果显示:在普通的宽场荧光显微镜的低倍镜(10X)视野,当外液加入高浓度的葡萄糖刺激后,转基因斑马鱼胰岛内Rcamp1.07的荧光信号快速增强,并且伴随着信号强度的周期性波动(如图6),表明转基因斑马鱼可以用来指示胰岛β细胞群体的功能状态,即其可以响应葡萄糖刺激而发生钙离子内流和周期性的钙离子震荡。
2.转基因斑马鱼单个胰岛β细胞的应用
因为宽场荧光显微镜的低分辨率不能观测单个胰岛β细胞的功能状态,如果需要对单个胰岛β细胞进行观测其功能状态,就要使用分辨率更高的荧光显微镜,本实验采用了双光子三轴光片层荧光显微镜(2P3A-DSLM),具体步骤如下:
S1.将Tg(ins:Rcamp1.07)转基因鱼包埋在1%琼脂糖凝胶中,并孵育在外液E3中;
S2.使用双光子三轴光片层荧光显微镜,用1030nm波长的激光照射斑马鱼整胚,找到红色荧光信号所在的斑马鱼胰岛部位之后,精细调节焦面,使得胰岛位于显微镜的焦平面位置,调节斑马鱼的成像体位,获得能够分辨出单个胰腺β细胞的清晰图像,拍摄基础钙信号30s;
S3.往外液加入20mM葡萄糖刺激,继续拍摄钙信号90s,观察记录活体斑马鱼内每个胰岛β细胞的钙离子信号的变化。
E3外液的成分为:5.0mMNaCl,0.17mMKCl,0.33mMCaCl2,0.33mMMgSO4。
结果显示:在高倍镜(40X)视野下,成功地得到了清晰的高空间分辨率的二维和三维的胰岛图像,得到了高时空分辨率的Ca2+信号随时间变化的荧光曲线(如图7)。
相比于单光子激发的宽场荧光显微镜系统,2P3A-DSLM成像系统结合了双光子技术,故穿透深,可以实现对深埋在活体样本中的胰岛进行高分辨率成像;同时因为结合了光片层照明技术,可以实现对活体样本进行长时间的成像而不发生明显的荧光漂白。因此,Tg(ins:Rcamp1.07)转基因斑马鱼可以在2P3A-DSLM高倍镜下指示每一个胰岛β细胞的功能状态,在高糖刺激下,葡萄糖在胰岛β细胞内代谢,产生ATP,提高ATP/ADP比例,关闭ATP依赖型的钾离子通道,引起细胞膜去极化,从而打开电压门控的钙离子通道,发生钙离子内流和周期性的钙离子震荡,升高的钙离子刺激胰岛素囊泡释放;即高糖刺激下的胞浆内钙离子水平的实时变化,因此钙离子内流和钙离子震荡是评价胰岛β细胞功能的重要指标。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列和构建包含ins启动子和指示钙离子浓度的荧光蛋白编码序列的PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒;
S2.转基因斑马鱼的创建;
S3.转基因斑马鱼的鉴定;
斑马鱼BAC_CH211_69I14包含基因ins的全部序列,斑马鱼BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为荧光蛋白序列,荧光信号均特异性地表达在胰岛β细胞中,可以指示活体内胰岛β细胞钙离子信号变化;
所述荧光蛋白序列为红色荧光蛋白Rcamp1.07,所述红色荧光蛋白Rcamp1.07是一种特异性指示钙离子浓度的蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法,其特征在于,利用RecE/RecT同源重组技术把BAC_CH211_69I14上ins基因的编码序列替换为Rcamp1.07的序列。
3.根据权利要求1所述的一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法,其特征在于,所述的获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列和构建包含ins启动子和指示钙离子浓度的荧光蛋白编码序列的质粒,包括以下步骤:
S1.获取斑马鱼胰岛素ins完整基因序列;
S2.把红色荧光蛋白Rcamp1.07蛋白编码序列克隆到R6K中间载体上;
S3.设计分别包含ins蛋白编码序列起始ATG上游同源序列和下游同源序列的引物对,PCR扩增Rcam1.07-frt-kana-frt序列,然后转染到含有RecE/RecT同源重组系统和BAC_ins的大肠杆菌中,利用卡那霉素筛选Rcamp1.07-frt-kana-frt基因成功插入到BAC_ins载体ins启动子下游的克隆BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt;
S4.设计分别包含ins基因最上游同源序列和最下游同源序列的引物对,扩增两端携带I-SceI酶切位点的PNPC2载体片段,该PNPC2载体片段包含诺尔丝菌素抗性基因cloNAT,转染到含有RecE/RecT同源重组系统和BAC-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的大肠杆菌中,利用诺尔丝菌素筛选出生成PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt重组质粒的大肠杆菌克隆;
S5.转染表达flpe的质粒到含有PNPC2-ins-Rcamp1.07-frt-kana-frt的克隆中,催化两个frt序列的同源重组,去掉卡那霉素抗性基因,最终得到含有质粒PNPC2-ins-Rcamp1.07的大肠杆菌克隆。
4.根据权利要求3所述的一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法,其特征在于,所述步骤S3的引物对为:
L:5’-ATGTTTTTGATTGACAGAGATTGTATGTGTGTGTTTGTGTCAGTGTGACCCGCCACCATGGGTTCTCATC-3’;
R:5’-CCTGTGTGCAAACAGGTGTTTCTGGCATCGGCGGTGGTCAAATCTCTTCAGGCAGATCGTCAGTCAG-3’。
5.根据权利要求3所述的一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法,其特征在于,所述步骤S4的引物对为:
L:5’-AGTCCATTAAATAATATCTTGTAGAATTATGTTTTTAAAAAGTACCAATGCCGTAGGGATAACAGGGTAATTTAAGC-3’;
R:5’-CAACTTTTTCACAAACACTGACCAAAACAAGCTACATGTTTTAGAGGCATTAGGGATAACAGGGTAATTGCACTG-3’。
6.根据权利要求1所述的一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法,其特征在于,所述转基因斑马鱼的创建,包括以下步骤:
S1.将核酸内切酶I-SceI与上述PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒共同注射到斑马鱼胚胎处于单细胞阶段的受精卵中,随机将ins-Rcamp1.07序列整合到斑马鱼的基因组中;
S2.将上述注射了PNPC2-ins-Rcamp1.07质粒的F0代胚胎养到2天鱼龄的时候,运用配备汞灯的体式镜或者宽场荧光显微镜进行筛选,将Rcamp1.07荧光信号正确定位于胰岛部位的幼鱼挑选出来,培养待其性成熟用于繁殖下一代;
S3.将成年的F0代转基因鱼与AB野生型斑马鱼杂交,产生的F1代在2天鱼龄时用上述同样方法筛选出在胰岛中表达Rcamp1.07的阳性胚胎,选择阳性胚胎转基因斑马鱼F1代继续养殖。
7.一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法在筛选促胰岛β细胞功能药物中的应用,其特征在于,该转基因斑马鱼模型可以指示活体内胰岛β细胞钙离子信号变化,在宽场荧光显微镜下,可以在体实时观测和指示胰岛β细胞群体的功能状态;在双光子三轴光片层荧光显微镜2P3A-DSLM的高分辨率下,可以观察活体状态下转基因斑马鱼模型的单个胰岛β细胞的功能状态;通过直接观测胰岛β细胞内钙信号变化从而直观地评价活体中胰岛β细胞的功能。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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CN201710010182.4A CN106755099B (zh) | 2017-01-06 | 2017-01-06 | 一种在体筛选促胰岛β细胞功能药物的方法 |
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新型钙离子指示剂GCaMP的发展与应用;董斐斐等;《第二军医大学学报》;20130131;第34卷(第1期);全文 * |
胰淀素抑制高糖刺激INS-1细胞内钙离子浓度升高的作用机制;陈延延;《万方数据知识服务平台》;20130723;摘要 * |
转基因水生动物的应用研究;叶星等;《广东海洋大学学报》;20070228;第27卷(第1期);第98页左栏第1段 * |
转基因系构建斑马鱼胰岛β-细胞发育模型;夏铭等;《贵阳中医学院学报》;20090930;第27卷(第5期);第21页左栏第1、3段;摘要、图2;第19页左栏第6段 * |
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