CN109880850A - 一种双转基因斑马鱼生物传感器及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种双转基因斑马鱼生物传感器：包括水环境系统和生活在所述水环境系统中的双转基因斑马鱼，双转基因斑马鱼同时携带BAC vtg1‑cre‑rfp和l‑fabp‑loxP‑STOP‑loxP‑gfp基因。本发明提供的双转基因斑马鱼生物传感器，能够用于监测环境中的多种不同内分泌干扰物，具有较高的灵敏度；其监测结果不仅能够用于判断水体是否发生污染，并且能够揭示水体污染发生的时期。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及环境污染检测领域，具体地，涉及一种双转基因斑马鱼生物传感器及其构建方法和应用。
背景技术
近年来，全世界对环境污染的关注大大增加,环境污染会导致健康问题，降低我们的生活质量。内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals，EDCs)由于跟雌激素的结构相似，可以严重影响人类的内分泌系统，进而影响动物以及人类的发育、生长以及生殖状况。EDCs是一种具有激素活性广泛存在于环境中的天然和化学合成物质，其主要包括天然激素、人工合成激素以及具有(抗)内分泌活性的化合物。天然激素，如雌激素酮(estrone)、雌二醇(17β-estradiol，E2)、雌三醇(estriol，E3)；人工合成激素，如17α-炔雌醇(17α-ethynylestradiol，EE2)；环境化学污染物，如双酚A(bisphenol A，BPA)、杀虫剂、增塑剂、除草剂、化妆品、防腐剂、洗漆剂、阻燃剂以及化工副产品等，现在确认了的环境内分泌干扰物质有近千种，在我们的生活中己处处可见。
EDCs在很低的浓度下既可以扰乱正常的内分泌功能，导致发育、生长和生育力的改变。很多生殖内分泌系统肿瘤的发生均与外环境中存在的EDCs有关。尤其是那些生殖激素作用的EDCs，如雌激素和雄激素。己烯雌酚(DES)作为EDCs中的一种模型剂，它可以影响小鼠体的女性生殖道发育，并使小鼠患癌。大多数的人类乳腺癌与雌激素受体α(ERα)阳性相关，而且他们的增长受内源性雌激素和环境EDCs的影响。雌激素在肺癌也发挥了作用，所以环境中的EDCs被认为是一个可以增加肺腺癌风险的危险因子。
卵黄蛋白原(VTG)是卵黄的前体，一般在雌鱼的肝脏中合成，它是特定的雌激素类似物，可以通过结合到雌激素受体后刺激产生卵黄蛋白原。由于卵黄蛋白原基因(vtg)是比卵黄蛋白原蛋白更灵敏的一种生物标志物，因此通过vtg在雄鱼肝脏中的表达量检测是评价环境中内分泌干扰物雌激素效应的常用方法之一。斑马鱼的vtg分为7种亚型，zvtg1-zvtg7，生理情况下主要在成熟雌鱼肝脏表达；受到水体中各种环境雌激素作用后，雄鱼和幼鱼会从无到有地表达，且表达水平和环境雌激素的浓度呈正相关，其中zvtg1(zebrafishvtg1，zvtg1)的mRNA表达水平比其他亚型高很多(100-1000)倍。因此，斑马鱼zvtg1的表达水平成为定性和定量衡量环境雌激素浓度和活性的指标。
鱼类对水环境中的污染物十分敏感，而且终生生活在水中，因此是一种监测环境内分泌干扰物的理想实验动物。而水体中的EDCs能影响鱼类神经、免疫和生殖系统的正常功能，引起鱼体产生明显的雌性化效应，在被污染的河流、河口和沿海水域的野生鱼种群中，发现大量的雌雄间性(雄性和雌性的生殖腺特征同时存在)和睾丸异常的雄鱼。实验室中暴露于雌激素的雄性鱼，高水平的合成了雌激素诱导的VTG，且长出了生长缺陷的睾丸和雌雄间性腺。
利用转基因斑马鱼可以更简便直观地检测水环境中的雌激素物质，Legler等建立了稳定的由内源性雌激素受体控制的荧光素酶受体组成的转染系，通过检测组织中荧光素酶的表达量来反映内分泌干扰的强弱程度。陈浩等人先后构建并改良了zvtg1:gfp和ere-zvtg1:gfp转基因斑马鱼系，通过检测zvtg1启动子调控肝脏中绿色荧光蛋白的表达，来反映EDCs的污染情况(ere表示雌激素应答原件)。但是，通过zvtg1:gfp转基因斑马鱼反映EDCs的污染情况存在如下缺点：荧光比较弱，肉眼无法观察到成年的斑马鱼的肝脏绿色荧光，敏感性不好；不能非常严格的响应EDCs并诱导GFP的表达。另一方面，ere-zvtg1:gfp转基因斑马鱼系虽然可以敏感检测到多种不同的环境雌激素，但是它却不能确定感染是否正在发生。
发明内容
本发明的目的是提供一种双转基因斑马鱼生物传感器及其构建方法和应用，以解决上述技术问题中的至少一个。
根据本发明的一个方面，提供一种双转基因斑马鱼生物传感器，包括水环境系统和生活在水环境系统中的双转基因斑马鱼，双转基因斑马鱼同时携带BAC vtg1-cre-rfp和l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp基因。
优选地，水环境系统中含有浓度为5×10-5-3×10-4mol/L的1-苯基-2-硫脲。
根据本发明的另一个发明，提供一种上述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，以携带l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp基因的转基因斑马鱼和携带BAC vtg1-cre-rfp基因的转基因斑马鱼互为亲本杂交育种得到双转基因斑马鱼。
优选地，包括以下步骤：(1)利用cre序列、vtg1序列、pRFP序列和含有ere的序列构建ere-vtg1:rfp/cre质粒，将ere-vtg1:rfp/cre质粒线性化后显微注射到斑马鱼胚胎细胞中，孵育，得到Tg(ere-vtg1:cre/rfp)转基因斑马鱼；(2)利用l-fabp序列、loxP-STOP-loxP序列和pGFP序列构建Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)质粒，将l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp质粒线性化后显微注射到斑马鱼胚胎细胞中，孵育，得到Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼；(3)分别筛选出携带BAC vtg1-cre-rfp纯合子基因的Tg(ere-vtg1:cre/rfp)转基因斑马鱼和携带l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp纯合子基因的Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼后，使其进行杂交，得到双转基因斑马鱼；(4)使双转基因斑马鱼进行繁殖传代，直至筛选出同时携带BAC vtg1-cre-rfp纯合子基因和l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp纯合子基因的双转基因斑马鱼。
优选地，利用以下引物扩增cre序列：上游引物，5’-GCTGCAAGCTTAATAGCCGACCAGTGCTTGTGAT-3’；下游引物，5’-CTCGGATCAGCTCAAGGACCCCACTTT-3’。
优选地，利用以下引物扩增vtg1序列：上游引物，5’-CGATCACCTCTCAGTGAGGTGACTGGACGTA-3’；下游引物，5’-CTGAAGGCAAGGCGCATCGACACCGGTATCG-3’。
优选地，利用以下引物扩增l-fabp序列：上游引物，5’-TATAGCCGTACGTACGTGCAAT-3’；下游引物，5’-CAGTCAGTCGTCGATCGGTCA-3’。
优选地，利用以下引物扩增loxP-STOP-loxP序列：上游引物，5’-CGATCACCTCTCAGTGAGGTGACTGGACGTA-3’；下游引物，5’-CTGAAGGCAAGGCGCATCGACACCGGTATCG-3’。
优选地，利用以下引物扩增含有ere的序列：正链，5’-TAACTTTGATCAGGTCACTGTGACCTGACTTTGGACAGT-3’；反链，5’-ACTGTCCAAAGTCAGGTCACAGTCACAGTGACCTGACCTGATCAAAGTTA-3’。
根据本发明的另一个发明，提供一种上述双转基因斑马鱼生物传感器在监测环境内分泌干扰物中的应用。
本发明构建的双转基因斑马鱼生物传感器利用两种荧光基因的表达情况实现对环境中17α-炔雌醇、雌酮、雌二醇、雌激素等多种内分泌干扰物的检测。检测结果不仅可以反映环境中是否存在着内分泌干扰物污染，还可以揭示内分泌干扰物污染发生的时间，能够应用于全面地评价环境中的内分泌干扰物污染的具体情况。总的来说，利用本发明构建的双转基因斑马鱼生物传感器监测和筛查环境中的内分泌干扰物，具有灵敏、高效、简便、特异、直观、活体、动态的特点。
附图说明
图1为Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼的红色荧光效应图，其中a为对照组的Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼，b为实验组的Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼；
图2为Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼的绿色荧光效应图，其中a为对照组的Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼，b为实验组的Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼；
图3为双转基因斑马鱼的红色荧光效应图，其中A为对照组的双转基因斑马鱼，B为实验组的双转基因斑马鱼；
图4为双转基因斑马鱼的绿色荧光效应图，其中A为对照组的双转基因斑马鱼，B为实验组的双转基因斑马鱼。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
实施例1构建双转基因斑马鱼生物传感器
1.引物设计
本发明中涉及的技术术语的中英文对照如表1所示。本实施例设计的引物由生工生物工程有限公司合成。
表1技术术语中英文对照
根据斑马鱼数据库的cre、vtg1、l-fabp基因(ID：ENSDARG00000011758，ENSDARG00000016825，ENSDARG00000025961)，设计引物：
cre引物：
cre-F,5’-GCTGCAAGCTTAATAGCCGACCAGTGCTTGTGAT-3’(SEQ ID NO:1)；
cre-R,5’-CTCGGATCAGCTCAAGGACCCCACTTT-3’(SEQ ID NO:2)。
vtg1引物：
vtg1-F,5’-CGATCACCTCTCAGTGAGGTGACTGGACGTA-3’(SEQ ID NO:3)；
vtg1-R,5’-CTGAAGGCAAGGCGCATCGACACCGGTATCG-3’(SEQ ID NO:4)。
l-fabp引物
l-fabp-F,5’-TATAGCCGTACGTACGTGCAAT-3’(SEQ ID NO:5)；
l-fabp-R,5’-CAGTCAGTCGTCGATCGGTCA-3’(SEQ ID NO:6)。
根据爪蟾的vgA2基因(Gene bank Accession no.X00205)，设计含有ere的寡核苷酸序列引物：
正链，5’-TAACTTTGATCAGGTCACTGTGACCTGACTTTGGACAGT-3’(SEQ ID NO:7)；
反链，
5-ACTGTCCAAAGTCAGGTCACAGTCACAGTGACCTGACCTGATCAAAGTTA-3’(SEQ ID NO:8)。
用于扩增loxP-STOP-loxP的引物如下：
loxP-STOP-loxP-F,5’-CGATCACCTCTCAGTGAGGTGACTGGACGTA-3’(SEQ ID NO:9)；
loxP-STOP-loxP-R,5’-CTGAAGGCAAGGCGCATCGACACCGGTATCG-3’(SEQ ID NO:10)。
2.斑马鱼基因组DNA的提取
在一定区域水体内，按照《The Zebrafish Book》饲养野生型(TU系)斑马鱼，待TU系斑马鱼自然产卵后收集胚胎。为了防止受精后24小时(24hour post fertilization，24hpf)的胚胎及后续幼鱼的色素形成，水体中会加入终浓度为2×10-4mol/L的1-苯基-2-硫脲(1-phenyl-2-thio-urea，PTU)。取30枚发育至24hpf的受精卵置于PCR管中；吸干水分，采用美国promega公司的基因组DNA提取试剂盒提取斑马鱼基因组DNA。
3.PCR扩增
3.1cre序列、vtg1序列和l-fabp序列扩增
使用上述提取的TU系斑马鱼基因组DNA，进行cre、vtg1和l-fabp序列
3.1.1cre序列扩增
cre序列扩增所需试剂及其用量如表2所示，PCR反应条件为94℃5min；94℃1min，62℃1min，72℃2min，30个循环；72℃7min；16℃forever。
表2cre序列扩增所需试剂及其用量
| 反应试剂 | 试剂用量/μL |
| 10μmol/L的正向引物(cre-F) | 1 |
| 10μmol/L的反向引物(cre-R) | 1 |
| 10×PCR Buffer | 2.5 |
| d NTP | 4 |
| TU系斑马鱼基因组DNA | 2 |
| TAKARA LA Taq DNA聚合酶 | 1 |
| ddH<sub>2</sub>O | 18.5 |
使用1％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳分离cre扩增反应产物，并验证PCR产物的大小是否正确。验证正确后，用美国promega公司的核酸纯化试剂盒纯化上述产物。
3.1.2vtg1序列扩增
vtg1序列扩增所需试剂及其用量如表3所示，PCR反应条件为98℃30s；98℃10s，58℃10s，72℃10s，39个循环；72℃10min；16℃forever。
表3vtg1序列扩增所需试剂及其用量
| 反应试剂 | 试剂用量/μL |
| 10μmol/L的正向引物(vtg1-F) | 1 |
| 10μmol/L的反向引物(vtg1-R) | 1 |
| 10×PCR Buffer | 2.5 |
| d NTP | 4 |
| TU系斑马鱼基因组DNA | 2 |
| TAKARA LA Taq DNA聚合酶 | 1 |
| ddH<sub>2</sub>O | 18.5 |
使用1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳分离vtg1扩增反应产物，并验证PCR产物的大小是否正确。验证正确后，采用DNA产物回收试剂盒(购于天根生化科技有限公司)纯化PCR产物，并溶于ddH2O，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定浓度。
3.1.3l-fabp序列扩增
l-fabp序列扩增所需试剂及其用量如表4所示，PCR反应条件为98℃30s；98℃10s，58℃10s，72℃10s，39个循环；72℃10min；16℃forever。
表4 l-fabp序列扩增所需试剂及其用量
| 反应试剂 | 试剂用量/μL |
| 10μmol/L的正向引物(l-fabp-F) | 1 |
| 10μmol/L的反向引物(l-fabp-R) | 1 |
| 10×PCR Buffer | 2.5 |
| d NTP | 4 |
| TU系斑马鱼基因组DNA | 2 |
| TAKARA LA Taq DNA聚合酶 | 1 |
| ddH<sub>2</sub>O | 18.5 |
使用1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳分离l-fabp增反应产物，并验证PCR产物的大小是否正确。验证正确后，采用DNA产物回收试剂盒(购于天根生化科技有限公司)纯化PCR产物，并溶于ddH2O，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定浓度。
3.2ere磷酸化与序列扩增
在50μL的反应体系中，所需试剂及其用量如表5所示，将用于扩增ere序列的正链反应物和反链反应物等量混合，于37℃反应半小时。所得产物进行如下扩增反应步骤：100℃，10min；65℃，1h；37℃，1h；降至室温，褪火成双链。
表5ere序列扩增所需试剂及其用量
| 反应试剂 | 试剂用量/μL |
| 正链反应物 | 2 |
| 反链反应物 | 2 |
| 10×Buffer | 5 |
| 100×ATP | 0.5 |
| T4多聚核苷酸激酶 | 2 |
| 无菌双蒸水 | 40.5 |
收获按照上述步骤制得的磷酸化的ere扩增产物，加入200μL酚/氯仿/异戊醇，混匀。取上层水相移至另一微量离心管中,再加等体积酚/氯仿/异戊醇，混匀。离心，取水相，加入20μL3M的醋酸钠和500μL冷的无水乙醇，-20℃沉淀30-60min。离心，弃上清，加200μL冷的无水乙醇洗，烘干后溶于10μL无菌双蒸水中。
3.3loxP-STOP-loxP磷酸化与序列扩增
在50μL的反应体系中，所需试剂及其用量如表6所示，将用于扩增loxP-STOP-loxP序列的正链反应物和反链反应物等量混合，于37℃反应半小时。所得产物进行如下扩增反应步骤：100℃，10min；65℃，1h；37℃，1h；降至室温，褪火成双链。
表6 loxP-STOP-loxP序列扩增所需试剂及其用量
| 反应试剂 | 试剂用量/μL |
| 正链反应物 | 2 |
| 反链反应物 | 2 |
| 10×Buffer | 5 |
| 100×ATP | 0.5 |
| T4多聚核苷酸激酶 | 2 |
| 无菌双蒸水 | 40.5 |
收获按照上述步骤制得的磷酸化的loxP-STOP-loxP扩增产物，加入200μL酚/氯仿/异戊醇，混匀。取上层水相移至另一微量离心管中,再加等体积酚/氯仿/异戊醇，混匀。离心，取水相，加入20μL 3M的醋酸钠和500μL冷的无水乙醇，-20℃沉淀30-60min。离心，弃上清，加200μL冷的无水乙醇洗，烘干后溶于10μL无菌双蒸水中。
4.Tg(ere-vtg1:rfp/cre)质粒的构建
4.1
使经过HindⅢ和BamHⅠ双酶切的、纯化后的cre PCR产物，与同样经过HindⅢ和BamHⅠ双酶切的pRFP载体连接,所需试剂及其用量如表7所示。在16℃下连接3小时，利用连接产物转化大肠杆菌感受态DH5a，抽提质粒酶切鉴定，送广州艾基生物技术公司测序。重组质粒命名为cre-rfp。
表7构建cre-rfp质粒所需试剂及其用量
| 反应试剂 | 试剂用量/μL |
| PCR产物(cre) | 4 |
| pRFP | 1 |
| SolutionⅠ(含连接酶) | 5 |
4.2
使经过ECoRⅠ和XholⅠ双酶切的、纯化后的vtg1PCR产物，与同样经过ECoRⅠ和XholⅠ双酶切的pRFP载体连接,所需试剂及其用量如表8所示。在16℃下连接3小时，利用连接产物转化大肠杆菌感受态DH5a，抽提质粒酶切鉴定，送广州艾基生物技术公司测序。重组质粒命名为vtg1-cre-rfp。
表8构建vtg1-cre-RFP质粒所需试剂及其用量
| 反应试剂 | 试剂用量/μL |
| PCR产物(vtg1) | 4 |
| pRFP | 1 |
| SolutionⅠ(含连接酶) | 5 |
4.3
将经过EcoRⅤ单酶切的vtg1-cre-rfp质粒进行去磷酸化处理,所需试剂及其用量如表9所示，反应条件为50℃水浴保温30min。使用酚/氯仿/异戊醇将反应产物抽提二遍，然后向抽提产物中加入醋酸钠和无水乙醇进行沉淀。然后将所得产物与磷酸化的ere双链DNA用平端连接试剂盒16℃连接30分钟。利用连接产物转化DH5a感受态细菌，涂布含有卡那霉素的LB平皿，37℃培养16小时，挑取阳性克隆双酶切鉴定。最后制得的重组质粒为Tg(ere-vtg1:rfp/cre)质粒，将Tg(ere-vtg1:rfp/cre)质粒用BgⅢ酶切线性化后，用于显微注射斑马鱼受精卵。
表9构建Tg(ere-vtg1:rfp/cre)质粒所需试剂及其用量
5.Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)质粒的构建
5.1
使经过HindⅢ和BamHⅠ双酶切的、纯化后的l-fabp PCR产物，与同样经过HindⅢ和BamHⅠ双酶切的pGFP载体连接,所需试剂及其用量如表10所示。在16℃下连接3小时，利用连接产物转化大肠杆菌感受态DH5a，抽提质粒酶切鉴定，送广州艾基生物技术公司测序。重组质粒命名为l-fabp-gfp质粒。
表10构建l-fabp-gfp质粒所需试剂及其用量
| 反应试剂 | 试剂用量/μL |
| PCR产物(l-fabp) | 4 |
| pGFP | 1 |
| SolutionⅠ(含连接酶) | 5 |
5.2
将经过EcoRⅤ单酶切的l-fabp-gfp质粒进行去磷酸化处理，所需试剂及其用量如表11所示，反应条件为50℃水浴保温30min。使用酚/氯仿/异戊醇将反应产物抽提二遍，向抽提产物中加入醋酸钠和无水乙醇进行沉淀。然后将所得产物与磷酸化的loxP-STOP-loxP双链DNA用平端连接试剂盒16℃连接30分钟。利用连接产物转化DH5a感受态细菌，涂布含有卡那霉素的LB平皿，37℃培养16小时，挑取阳性克隆双酶切鉴定。最后制得的重组质粒为Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)质粒，将Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)质粒用BgⅢ酶切线性化后，用于显微注射斑马鱼受精卵。
表11构建Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)质粒所需试剂及其用量
| 反应试剂 | 试剂用量/μL |
| 无菌双蒸水 | 123 |
| 10×CIAP buffer | 15 |
| CIAP | 2 |
| l-fabp-gfp质粒 | 10 |
6.显微注射
分别将经过BgⅢ酶切线性化后Tg(ere-vtg1:rfp/cre)质粒和Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)质粒溶于缓冲液(5Mm Tris-HCl Ph＝8.0,200Nm KCl,0.05％苯酚磺酞)中至终浓度为50ng/mL，用显微注射器，在斑马鱼卵受精后的1到2细胞期通过显微注射进入胚胎细胞中，每个受精卵注射量为100pg。并在28.5℃继续培养，荧光显微镜下观察。显微注射用针为内径硝1mm管经显微注射拉针器拉制而成。使用前用镊子去除玻璃针最尖端，使针尖开口直径为0.06mm。注射针通过一条长约70cm的塑料管与显微注射仪相联。整套显微注射系统是通过气压驱动，显微注射时调整气压为30psi，单次注射时间为大于100ms。上样时，用移液器吸取2μL注射液，加入显微注射针内，然后排空气泡备用。向直径为8cm的玻璃培养皿盖中倒入适量加热溶解的1％琼脂糖，然后放入预制模具，琼脂糖凝固后形成一个宽1mm、深1mm的凹槽，可用于铺放斑马鱼卵。在显微注射槽内加入胚胎培养基溶液，将鱼卵单层铺于槽最低部，即可用于注射。
7.转基因斑马鱼系的建立
7.1Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼系的建立
将经过Tg(ere-vtg1:rfp/cre)质粒显微注射的斑马鱼胚胎经10ng/L EE2暴露1周，于荧光解剖镜下420nm激发光下观察红色荧光，筛选红色荧光阳性的嵌合体。在含有2×10-4mol/L的PTU水环境中孵育阳性的斑马鱼胚胎。胚胎孵化成Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼在含有2×10-4mol/L的PTU水环境中按照《The Zebrafish Book》要求饲养，至性成熟后，与野生型斑马鱼杂交，其后代继续以10ng/L EE2暴露一周，挑选有红色荧光出现的F1代，喂养至性成熟后，与野生型斑马鱼杂交，继续进行繁殖遗传筛选，直至得到与野生型斑马鱼交配产生的Fn代100％出现有红色荧光，提示Fn-1代斑马鱼被确定为Tg(ere-vtg1:rfp/cre)纯合子。由此建立Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼系。
7.2Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼系的建立
将经过Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)质粒显微注射的斑马鱼胚胎经10ng/LEE2暴露1周，于荧光解剖镜下480nm激发光下观察绿色荧光，筛选绿色荧光阳性的嵌合体。在含有2×10-4mol/L的PTU水环境中孵育阳性的斑马鱼胚胎。胚胎孵化成Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼在含有2×10-4mol/L的PTU水环境中按照《The ZebrafishBook》要求饲养，至性成熟后，与野生型斑马鱼杂交，其后代继续以10ng/L EE2暴露一周，挑选有绿色荧光出现的F1代，喂养至性成熟后，与野生型斑马鱼杂交，继续进行繁殖遗传筛选，直至得到与野生型斑马鱼交配产生的Fn代100％出现有绿色荧光，提示Fn-1代斑马鱼被确定为Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)纯合子。由此建立Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼系。
7.3双转基因斑马鱼系的建立
使Tg(ere-vtg:egfp)转基因斑马鱼与Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼杂交，其后代以10ng/L EE2暴露一周，于荧光解剖镜下分别在420nm激发光下观察红色荧光、在480nm激发光下观察绿色荧光，挑选既有绿色荧光出现也有红色荧光出现的F1代，喂养至性成熟后，与野生型斑马鱼杂交，继续进行繁殖遗传筛选，直至得到与野生型斑马鱼交配产生的Fn代100％既有绿色荧光出现也有红色荧光出现，提示Fn-1代斑马鱼被确定同时具有Tg(ere-vtg1:rfp/cre)纯合子基因型和Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)纯合子基因型。由此，建立双转基因斑马鱼系，并继续组内交配传代。
实施例2转基因斑马鱼生物传感器的测试效果
1.Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼系
在实施例1构建的Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼系中随机选择40条Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼，随机地将其分成实验组和对照组，每组20条，实验组的Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼在含有10ng/L 17α-炔雌醇(17α-ethynylestradiol，EE2)的水环境中饲养，对照组的Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼在不含具有雌激素功能的化学物质的水环境中饲养，其余饲养条件均保持一致且按照《The Zebrafish Book》要求设置。一周后，分别测试两组Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼的荧光效应。于荧光解剖镜下420nm激发光下观察红色荧光，结果如图1所示，对照组的Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼体内没有出现荧光，而实验组的Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼肝脏出现红色荧光(图1中被虚线圆形圈出的部分)。实验组的Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼在环境中的EE2作用下，vtg1启动子驱动ere元件和cre-rfp融合蛋白的表达，Tg(ere-vtg1:rfp/cre)转基因斑马鱼体内出现红色荧光。
2.Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼系
在实施例1构建的Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼系中随机选择40条Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼，随机地将其分成实验组和对照组，每组20条，为实验组的Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼注射cre重组酶，实验组和对照组的饲养条件均保持一致且按照《The Zebrafish Book》要求设置。一周后，分别测试两组Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼的荧光效应。于荧光解剖镜下480nm激发光下观察绿色荧光，结果如图2所示，对照组的Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼体内没有出现荧光，而实验组的Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼肝脏出现绿色荧光(图2中被虚线圆形圈出的部分)。Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼具有可以阻止gfp翻译的loxP-STOP-loxP元件，对照组Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼的gfp报告基因被loxP-STOP-loxP关闭，所以不出现荧光，然而，在cre重组酶的作用下，实验组Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼的loxP-STOP-loxP元件被切除，gfp在新的转录本中翻译，由此对照组Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼肝脏内出现绿色荧光。
3.双转基因斑马鱼系
在实施例1构建的双转基因斑马鱼中随机选择40条双转基因斑马鱼，随机地将其分成实验组和对照组，每组20条，实验组的双转基因斑马鱼在含有10ng/L EE2的水环境中饲养，对照组的双转基因斑马鱼在不含具有雌激素功能的化学物质的水环境中饲养，其余饲养条件均保持一致且按照《The Zebrafish Book》要求设置。
一周后，分别测试两组双转基因斑马鱼的荧光效应。于荧光解剖镜下420nm激发光下观察红色荧光，结果如图3所示，对照组的双转基因斑马鱼体内没有出现荧光，而实验组的双转基因斑马鱼肝脏出现红色荧光(图3中被虚线圆形圈出的部分)。同时，于荧光解剖镜下480nm激发光下观察绿色荧光，结果如图4所示，对照组的双转基因斑马鱼体内没有出现荧光，而实验组的双转基因斑马鱼肝脏出现绿色荧光(图4中被虚线圆形圈出的部分)。对照组的双转基因斑马鱼生活的水体环境中不含具有雌激素功能的化学物质，其体内没有vtg1表达，没有启动子驱动cre-rfp表达，另外，gfp报告基因被loxP-STOP-loxP关闭，于是对照组的双转基因斑马鱼体内既没有出现红色荧光也没有出现绿色荧光。而实验组的双转基因斑马鱼在环境中的EE2作用下，vtg1启动子驱动ere元件和cre-rfp融合蛋白表达导致对照组双转基因斑马鱼体内出现红色荧光；进一步地，cre重组酶将loxP-STOP-loxP元件从转基因中切除，使gfp在新的转录本中翻译，导致实验组双转基因斑马鱼体内出现绿色荧光。
将实验组中的双转基因斑马鱼随机分成两组，每组10条，标记为：A组，继续在含有10ng/L EE2的水体环境中饲养；B组，转投放至不含具有雌激素功能的化学物质的水体环境中饲养；其余饲养条件均保持一致且按照《The Zebrafish Book》要求设置。两周后，分别测试两组双转基因斑马鱼的荧光效应。荧光测试结果显示，A组的双转基因斑马鱼体内同时出现红色荧光和绿色荧光，B组的双转基因斑马鱼体内仅出现绿色荧光。A组双转基因斑马鱼的具体发光机理参照上一段中对实验组双转基因斑马鱼发光机理的解释。而B组的双转基因斑马鱼曾在受到EE2污染的水体环境中生活，如上所述，其l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp质粒中的loxP-STOP-loxP元件已经被受到vtg1驱动表达的cre重组酶切除，从而使gfp报告基因的表达不再受到阻止。因此，针对曾经在受到雌激素类似物污染的水体环境中生活过的双转基因斑马鱼，无论其目前生活的水体环境是否存在雌激素类似物污染，其肝脏类可以持续观察到绿色荧光。但是，B组转基因斑马鱼目前生活的水体环境中没有能够驱动vtg1启动子表达的雌激素类似物，更无法进一步地利用vtg1启动子驱动cre-rfp表达，因此B组双转基因斑马鱼体内没有出现红色荧光。
综上，实施例1构建的双转基因斑马鱼传感器不仅能够灵敏地检测水体环境中的EDCs污染水平，也能够揭示EDCs污染发生的时间，具体地：双转基因斑马鱼体内既没有出现红色荧光也没有出现绿色荧光，水体环境中没有发生EDCs污染；双转基因斑马鱼体内同时出现红色荧光和绿色荧光，水体环境中正在发生EDCs污染；双转基因斑马鱼体内仅出现绿色荧光，水体环境中过去曾经受到EDCs污染。
实施例3双转基因斑马鱼传感器的敏感性鉴定实验
将100条双转基因斑马鱼纯合子幼鱼置于盛有1L EE2溶液的鱼缸中暴露1周，暴露组浓度分别为100、10、1ng/L(EE2)，溶剂对照为5μL/L乙醇。为了避免EE2被幼鱼吸收或水分蒸发导致的暴露浓度改变，每天更换EE2溶液和乙醇溶液。分别在暴露60、72、84、96、108、120、144小时后，计数表达绿色荧光蛋白的幼鱼数量。根据各暴露组出现荧光的时间，进行持续观察，并在出现荧光时拍照记录。纯合子双转基因斑马鱼的胚胎暴露实验方法与上述方法相同，每组的样本数量为100个胚胎/缸。
表12双转基因斑马鱼幼鱼对EE2的敏感性测试结果
表13双转基因斑马鱼胚胎对EE2的敏感性测试结果
测试结果(表12、13)表明，将实施例1制备的双转基因斑马鱼胚胎和幼鱼暴露在含有EE2的溶液中84小时后，显著地发出绿色荧光，暴露在含10ng/L和100ng/L EE2的斑马鱼幼鱼和胚胎对绿色荧光蛋白的表达率都高于85％。由此得出，实施例1构建的双转基因斑马鱼传感器能敏感地检测EE2。
实施例4双转基因斑马鱼传感器的对其他雌激素结构类似物的响应
另外，除上述EE2外，申请人还购买了与EE2同为雌激素结构类似物的孕酮和皮质激素17-羟固醇。每种物质均配制1、10、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108ng/L浓度的溶液，每种物质低浓度向高浓度依次进行转基因斑马鱼幼鱼暴露试验，连续7天，每天更换暴露溶液后观察荧光，直到观察到荧光蛋白表达为止，更高浓度不做检测。
测试结果如表14、15所示，双转基因斑马鱼幼鱼对各浓度的孕酮和17-羟固醇都能够反馈不同速度的响应，对于含量为102ng/L的孕酮和17-羟固醇能够及时地反馈，测试结果表明实施例1构建的双转基因斑马鱼能够有效地检测作为雌激素结构类似物的孕酮和17-羟固醇。此外，实施例1构建的双转基因斑马鱼还能检测多种内分泌干扰物，包括雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌激素(E3)。
表14双转基因斑马鱼幼鱼对孕酮的敏感性测试结果
“+”表示能观察到绿色荧光，“–”表示未观察到绿色荧光。
表15双转基因斑马鱼幼鱼对17-羟固醇的敏感性测试结果
“+”表示能观察到绿色荧光，“–”表示未观察到绿色荧光。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 北京大学深圳研究生院
<120> 一种双转基因斑马鱼生物传感器及其构建方法和应用
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctgcaagct taatagccga ccagtgcttg tgat 34
<210> 2
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcggatcag ctcaaggacc ccacttt 27
<210> 3
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgatcacctc tcagtgaggt gactggacgt 30
<210> 4
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctgaaggcaa ggcgcatcga caccggtatc g 31
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
tatagccgta cgtacgtgca at 22
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
cagtcagtcg tcgatcggtc a 21
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
taactttgat caggtcactg tgacctgact ttggacagt 39
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
actgtccaaa gtcaggtcac agtcacagtg acctgacctg atcaaagtta 50
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgatcacctc tcagtgaggt gactggacgt a 31
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctgaaggcaa ggcgcatcga caccggtatc g 31
Claims (10)
1.一种双转基因斑马鱼生物传感器，其特征在于：包括水环境系统和生活在所述水环境系统中的双转基因斑马鱼，所述双转基因斑马鱼同时携带BACvtg1-cre-rfp和l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp基因。
2.如权利要求1所述双转基因斑马鱼生物传感器，其特征在于：所述水环境系统中含有浓度为5×10-5-3×10-4mol/L的1-苯基-2-硫脲。
3.一种如权利要求1所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于：以携带l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp基因的转基因斑马鱼和携带BACvtg1-cre-rfp基因的转基因斑马鱼互为亲本杂交育种得到所述双转基因斑马鱼。
4.如权利要求3所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用cre序列、vtg1序列、pRFP序列和含有ere的序列构建ere-vtg1:rfp/cre质粒，将所述ere-vtg1:rfp/cre质粒线性化后显微注射到斑马鱼胚胎细胞中，孵育，得到Tg(ere-vtg1:cre/rfp)转基因斑马鱼；
(2)利用l-fabp序列、loxP-STOP-loxP序列和pGFP序列构建Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)质粒，将所述l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp质粒线性化后显微注射到斑马鱼胚胎细胞中，孵育，得到Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼；
(3)分别筛选出携带BAC vtg1-cre-rfp纯合子基因的所述Tg(ere-vtg1:cre/rfp)转基因斑马鱼和携带l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp纯合子基因的所述Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼后，使其进行杂交，得到所述双转基因斑马鱼；
(4)使所述双转基因斑马鱼进行繁殖传代，直至筛选出同时携带所述BACvtg1-cre-rfp纯合子基因和所述l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp纯合子基因的双转基因斑马鱼。
5.如权利要求4所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于，利用以下引物扩增所述cre序列：
上游引物，5’-GCTGCAAGCTTAATAGCCGACCAGTGCTTGTGAT-3’；
下游引物，5’-CTCGGATCAGCTCAAGGACCCCACTTT-3’。
6.如权利要求4所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于，利用以下引物扩增所述vtg1序列：
上游引物，5’-CGATCACCTCTCAGTGAGGTGACTGGACGTA-3’；
下游引物，5’-CTGAAGGCAAGGCGCATCGACACCGGTATCG-3’。
7.如权利要求4所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于，利用以下引物扩增所述l-fabp序列：
上游引物，5’-TATAGCCGTACGTACGTGCAAT-3’；
下游引物，5’-CAGTCAGTCGTCGATCGGTCA-3’。
8.如权利要求4所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于，利用以下引物扩增所述loxP-STOP-loxP序列：
上游引物，5’-CGATCACCTCTCAGTGAGGTGACTGGACGTA-3’；
下游引物，5’-CTGAAGGCAAGGCGCATCGACACCGGTATCG-3’。
9.如权利要求4所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于，利用以下引物扩增所述含有ere的序列：正链，5’-TAACTTTGATCAGGTCACTGTGACCTGACTTTGGACAGT-3’；反链，5’-ACTGTCCAAAGTCAGGTCACAGTCACAGTGACCTGACCTGATCAAAGTTA-3’。
10.如权利要求1所述双转基因斑马鱼生物传感器在监测环境内分泌干扰物中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN112852872A (zh) * | 2021-01-22 | 2021-05-28 | 杭州环特生物科技股份有限公司 | 一种用于直接检测环境雌激素的转基因斑马鱼的构建方法 |
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| CN1904048A (zh) * | 2005-07-26 | 2007-01-31 | 复旦大学 | 斑马鱼卵黄蛋白原－1基因调控序列 |
-
2019
- 2019-03-05 CN CN201910162596.8A patent/CN109880850A/zh active Pending
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