CN111264467B - 一种突变体斑马鱼在制备骨髓增生异常综合征的动物模型中的应用 - Google Patents

一种突变体斑马鱼在制备骨髓增生异常综合征的动物模型中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种突变体斑马鱼在制备骨髓增生异常综合征的动物模型中的应用。该突变体斑马鱼为asxl1突变体斑马鱼，所述的asxl1突变体斑马鱼为斑马鱼asxl1基因第12个外显子中第817位至823位缺失7个碱基或第798位至819位缺失22个碱基的斑马鱼。本发明首次构建与血液髓系肿瘤病人类似的截短asxl1突变体，突变之后主要影响的是斑马鱼中性粒细胞的发育，与人类粒细胞发育不良的骨髓增生异常综合征类似的症状，且本发明首次发现利用针对H3K4me3的去甲基化酶抑制剂处理能恢复突变体的表型，因此，该模型可能成为研究ASXL1突变所导致的骨髓增生异常综合征的发病机制并可成为药物筛选的新载体。

Description

一种突变体斑马鱼在制备骨髓增生异常综合征的动物模型中 的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种突变体斑马鱼在制备骨髓增生异常综合征的动物模型中的应用。
背景技术
血液髓系肿瘤(myeloid malignancies)是由于造血干细胞(hematopoietic stemcells,HSC)或者髓系祖细胞过度增殖、自我更新或者分化的异常所导致的克隆性造血障碍。近年来，在许多血液髓系肿瘤的病人中广泛地发现有ASXL1(additional sex combs-like 1)的突变，突变位置主要集中在基因的第11和12外显子上，也就是在ASXL1蛋白的PHD功能域之前，突变类型主要是移码突变和无义突变(①Carbuccia N,Murati A,TrouplinV,et al.Mutations of ASXL1gene in myeloproliferative neoplasms[J].Leukemia,2009,23(11):2183-2186.②Gelsi-Boyer V,Trouplin V,Adelaide J,et al.Mutationsof polycomb-associated gene ASXL1in myelodysplastic syndromes and chronicmyelomonocytic leukaemia[J].Br J Haematol,2009,145(6):788-800.)。
已有的研究发现，ASXL1蛋白的功能主要是参与组蛋白修饰，而它突变之后导致疾病的原因可能是由于影响了组蛋白修饰而影响了造血发育相关基因的表达。在小鼠中，缺失ASXL1或者过表达人的突变的ASXL1都会导致类似于人的MDS(骨髓增生异常综合征)的表型(①Abdel-Wahab O,Gao J,Adli M,et al.Deletion of Asxl1results inmyelodysplasia and severe developmental defects in vivo[J].J Exp Med,2013,210(12):2641-2659.②Inoue D,Kitaura J,Togami K,et al.Myelodysplastic syndromesare induced by histone methylation-altering ASXL1mutations[J].J Clin Invest,2013,123(11):4627-4640.)。而对于ASXL1是具体是如何影响造血发育，以及突变后导致白血病的具体机制尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种突变体斑马鱼在制备骨髓增生异常综合征的动物模型中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种突变体斑马鱼在制备骨髓增生异常综合征的动物模型中的应用，其中，所述突变体斑马鱼为asxl1突变体斑马鱼。
所述的骨髓增生异常综合征是由asxl1基因的异常表达引起，即由asxl1基因突变引起。
所述的骨髓增生异常综合征包括骨髓增生异常综合征伴粒系病态造血，其症状为中性粒细胞发育异常(发育不良)，进而导致中性粒细胞减少。
所述的asxl1突变体斑马鱼为斑马鱼asxl1基因第12外显子移码突变得到的突变体斑马鱼；优选为斑马鱼asxl1基因第12个外显子中第817位至823位(exon12:817-823)缺失7个碱基或第798位至819位(exon12:798-819)缺失22个碱基的斑马鱼，具体为：
突变前：5’-…CCAGGGTGTGGATGTCATCAGGACATTGGCAGC…-3’；
突变后(7)：5’-…CCAGGGTGTGGATGTCATCAGG-------CAGC…-3’；
突变后(22)：5’-…CCA----------------------TTGGCAGC…-3’；
其中，7个碱基的缺失导致蛋白翻译时移码，进而导致氨基酸序列在919位出现终止密码子，造成蛋白提前终止，最后翻译的蛋白缺少后面两个功能域；22个碱基的缺失同样导致蛋白翻译时移码，使得氨基酸序列在914位出现终止密码子，造成蛋白提前终止，最后翻译的蛋白同样缺少后面两个功能域。
所述的asxl1突变体斑马鱼优选为通过如下方法构建得到：将gRNA和Cas9mRNA混合均匀，然后共同注射到野生斑马鱼胚胎中，再将获得的胚胎进行培养，得到asxl1突变体斑马鱼。
所述的gRNA和Cas9mRNA混合均匀后gRNA的终浓度为50～100ng/L，Cas9mRNA的终浓度为300ng/L。
所述的野生型斑马鱼优选为AB野生型斑马鱼。
所述的骨髓增生异常综合征在通过针对H3K4me3(组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化)的去甲基化酶抑制剂处理后症状缓解。
所述的去甲基化酶抑制剂优选为去甲基化酶KDM5抑制剂；更优选为CPI-455。
一种突变体斑马鱼在制备用于筛选药物对骨髓增生异常综合征有效的动物模型中的应用，所述突变体斑马鱼为asxl1突变体斑马鱼。
所述的骨髓增生异常综合征是由asxl1基因的异常表达引起，即由asxl1基因突变引起。
所述的骨髓增生异常综合征为骨髓增生异常综合征伴粒系病态造血，其症状为中性粒细胞发育异常(发育不良)。
所述的asxl1突变体斑马鱼为斑马鱼asxl1基因第12外显子中移码突变得到的突变体斑马鱼；优选为斑马鱼asxl1基因第12个外显子中第817位至823位(exon12:817-823)缺失7个碱基或第798位至819位(exon12:798-819)缺失22个碱基的斑马鱼。
所述的药物为H3K4me3的去甲基化酶抑制剂；优选为去甲基化酶KDM5抑制剂；更优选为CPI-455。
一种利用突变体斑马鱼筛选对骨髓增生异常综合征有效的药物的方法，所述突变体斑马鱼为asxl1突变体斑马鱼。
一种asxl1基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，包括如下步骤：将gRNA和Cas9mRNA混合均匀，然后共同注射到野生斑马鱼胚胎中，再将获得的胚胎进行培养，得到asxl1基因缺失斑马鱼突变体。
所述的gRNA通过如下方法制备得到：以含有gRNA骨架序列的质粒为模板进行PCR扩增，得到模板DNA；然后利用T7RNA聚合酶体外转录合成gRNA；其中，PCR扩增引物为：
FP:5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTGTGGATGTCATCAGGACATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(保护碱基+T7识别序列+靶点序列+gRNA骨架的FP)；
RP:5’-AGCACCGACTCGGTGCCACT-3’。
所述的gRNA和Cas9mRNA混合均匀后gRNA的终浓度为50～100ng/L，Cas9mRNA的终浓度为300ng/L。
所述的野生型斑马鱼优选为AB野生型斑马鱼。
所述的asxl1基因缺失斑马鱼突变体为斑马鱼asxl1基因第12外显子中移码突变得到的斑马鱼突变体；优选为斑马鱼asxl1基因第12个外显子中第817位至823位(exon12:817-823)缺失7个碱基或第798位至819位(exon12:798-819)缺失22个碱基的斑马鱼突变体。
本发明总体构思为：
(1)通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，我们获得了与临床相关病人突变位置相同的斑马鱼asxl1突变体。
(2)获得突变体之后，通过qRT-PCR及整体原位杂交检测各个血液谱系标记基因的变化，从而对突变体胚胎进行各个谱系的表型分析，观察是否出现各种血液髓系肿瘤。此外，在突变体成鱼中，通过收集突变体的肾脏血，经过May-Grunwald-Giemsa染色，观察血象变化。
(3)通过相关的机制分析找到相关的致病机制，从而寻找相应的药物进行治疗。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首次构建与血液髓系肿瘤病人类似的截短asxl1突变体，在小鼠中都是完全敲除的突变体，并没有构建内源性截短突变体。本发明利用这个模型发现，突变之后主要影响的是斑马鱼中性粒细胞的发育，与人类粒细胞发育不良的骨髓增生异常综合征类似的症状，该模型可能成为研究ASXL1突变所导致的骨髓增生异常综合征的发病机制并可成为药物筛选的新载体。
(2)由于斑马鱼的各项优势，该斑马鱼突变体可以实现：a.高通量：斑马鱼产卵数量多，养殖方便容易，且可以同时进行多种药物筛选，可进行多批次同时进行药物筛选；新突破：b.低费用：斑马鱼饲养和消耗的费用远远低于老鼠，平均每天每只消费约为老鼠的1/100；c.给药方便：可直接将化合物溶于水中，扩散至成年斑马鱼吸收，所需化合物的量仅为老鼠的1/100～1/1000。
(3)本发明中asxl1突变体斑马鱼成鱼具有以下表型：a.小鱼和成鱼中性粒细胞发育不良，主要呈现为不分叶的状态，类似于人的骨髓增生异常综合征伴粒系病态造血疾病；b.突变体中组蛋白修饰异常，并通过抑制剂能够恢复表型。
(4)本发明首次发现，利用针对H3K4me3的去甲基化酶抑制剂处理能恢复突变体的表型，说明该斑马鱼模型可成为研究骨髓增生异常综合征及药物筛选的新载体。
附图说明
图1是asxl1基因突变体和其同胞野生型基因组DNA测序结果和对应形成的蛋白图；其中，图A为突变体靶点设计图及突变体突变位置序列；图B为突变后预测形成蛋白图，蛋白提前终止，形成缺失后面两个功能域的截短蛋白。
图2是asxl1突变体和其同胞野生型斑马鱼小鱼粒细胞发育分析结果图；其中，图A为成熟中性粒细胞标记基因lyz和mpx整体原位杂交结果及成熟中性粒细胞染色苏丹黑B染色结果(箭头：阳性信号)；图B为成熟中性粒细胞标记基因lyz整体原位杂交结果；图C为成熟中性粒细胞标记基因mpx整体原位杂交结果；图D为成熟中性粒细胞染色苏丹黑B染色结果(SBB+)；图E为荧光定量PCR检测lyz和mpx的表达水平；图F和G为5dpf时期分选出中性粒细胞后进行May-Grunwald/Giemsa染色并计数成熟中性粒细胞比例结果。
图3是asxl1突变体和其同胞野生型斑马鱼成鱼肾脏血(Kidney marrow，KM)细胞分析结果图；其中，图A～D为6个月及1年的肾脏血中不同血细胞比例；图E为asxl1突变体和其同胞野生型斑马鱼肾脏血细胞May-Grunwald/Giemsa染色结果(实线箭头：中性粒细胞；虚线箭头：红系细胞)；图F和G是分选出asxl1突变体和其同胞野生型斑马鱼的中性粒细胞之后进行May-Grunwald/Giemsa染色并计数成熟中性粒细胞比例结果；图H为荧光定量PCR检测中性粒细胞中髓系相关标记基因表达情况。
图4是Western Blot检测asxl1突变体和其同胞野生型斑马鱼胚胎总体组蛋白修饰水平的变化图。
图5是利用去甲基化酶抑制剂处理asxl1突变体和其同胞野生型斑马鱼胚胎后检测中性粒细胞标记基因表达变化的结果图；图A和B为用针对H3K4me3去甲基化酶KDM5抑制剂CPI-455处理胚胎后，利用整体原位杂交检测成熟中性粒细胞标记基因lyz的表达情况；图C和D为用针对H3K27me3去甲基化酶KDM6B抑制剂GSK J1处理胚胎后，检测中性粒细胞标记基因表达变化的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的各原料、试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。
本发明中所使用的术语“同胞鱼(sibling)”或者“同胞野生型斑马鱼”是指由同一双亲的后代个体。
本发明中所使用的术语“dpf”指受精后的天数。举例来说，“3dpf”指受精后三天，“4dpf”指受精后四天。
实施例1
(1)斑马鱼养殖
斑马鱼的养殖如文献(Westerfield M:The zebrafish:guide for thelaboratory use of zebrafish(Brachdanio rerio).Edition by Eugene,OR,M.Westerfield，1993)所述。
本发明中用到如下的品系：AB野生型斑马鱼、asxl1突变体斑马鱼以及带有Tg(lyz:DsRED2)转基因背景的asxl1突变体斑马鱼；其中，
转基因斑马鱼Tg(lyz:DsRED2)参考文献(Hall C,Flores MV,Storm T,CrosierK,Crosier P.The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specificexpression in transgenic fish.BMC Dev Biol 2007；7:42.)获得(Tg(lyz:DsRED2)与参考文献中的lysC::DsRED2相同)。带有Tg(lyz:DsRED2)转基因背景的asxl1突变体斑马鱼是由asxl1突变体斑马鱼与转基因斑马鱼Tg(lyz:DsRED2)杂交获得。
(2)CRISPR/cas9
将gRNA和Cas9mRNA混到一起，使得终浓度为gRNA(50～100ng/L)，Cas9mRNA(300ng/L)，吸取2μL样品至注射针管中。调节气压，使得每次注射的液体体积大约为0.5μL(液滴直径约为100μm)。
收集刚产下的AB野生型斑马鱼的胚胎，在胚胎1～2cell(细胞)时期进行显微注射，显微注射针穿过卵黄囊进入细胞中。在胚胎24hpf时将其裂解，提取基因组DNA，利用PCR扩增，靶点附近片段，所用引物序列为：FP:5’-TG AACCATCTCCCTCTTCTGT-3’；RP:5’-GTCTGAGCCATGCTGGATAACT-3’，PCR产物再利用T7endonuclease I(New England Biolabs，M0302S)检测是否存在突变(可被T7endonuclease I切开表明有出现突变)，将检测有效率的剩余胚胎培养长大，进行后面的F0代筛选。经过筛选之后的F0与野生型斑马鱼杂交，得到带有突变的asxl1杂合突变体，在经过测序筛选得到两种突变体，即为F1代杂合突变体。如图1所示，后续实验主要运用缺失7个碱基的突变体进行后面的实验。缺失7个碱基的突变体斑马鱼为斑马鱼asxl1基因第12个外显子中的缺失7个碱基(exon12:817-823)，从而导致氨基酸序列在919位出现终止密码子，导致翻译时移码，造成提前终止，最后翻译的蛋白缺少后面两个功能域。其中，
gRNA和Cas9mRNA的合成可参考文献：Chang N,Sun C,Gao L,et al.Genomeediting with RNA-guided Cas9nuclease in zebrafish embryos.Cell Res.2013；23(4):465-472.
具体通过如下步骤：
①gRNA的合成：以含有gRNA骨架序列的质粒为模板(质粒可根据上述文献获得)，利用PCR的方法合成可用于gRNA转录的模板DNA；所用引物为：
FP:5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTGTGGATGTCATCAGGACATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(保护碱基+T7识别序列+靶点序列+gRNA骨架的FP)；
RP:5’-AGCACCGACTCGGTGCCACT-3’；
得到可用于gRNA转录的模板DNA之后，经过纯化后利用T7RNA聚合酶(Fermentas，EP0111)体外转录合成含有我们所需靶点的gRNA。
②Cas9mRNA的合成：利用invitrogen的mMESSAGE mMACHINETMSP6TranscriptionKit进行mRNA的体外转录(其中涉及的含有Cas9的质粒可根据上述文献获得)。
(3)整体原位杂交
①胚胎的固定与脱水：a.收集已破膜的缺失7个碱基的突变体斑马鱼胚胎的放入1.5mL EP管中，弃掉残留的胚胎培养液，加1mL PBST(含吐温-20的磷酸盐缓冲液)润洗一遍；b.加入1mL 4％多聚甲醛，室温摇床孵育2～4小时，也可4℃过夜；c.固定好的胚胎用PBST漂洗，漂洗3次，每次10min；d.分别加入PBST稀释的50％(v/v)甲醇溶液和100％甲醇溶液进行脱水，每次5min。最后更换一次100％甲醇溶液，于-20℃静置过夜，可长期保存。
②探针孵育：a.分别加入PBST稀释的75％、50％和25％甲醇溶液进行复水，每次5min；b.PBST漂洗，室温下漂洗3次，每次5min；c.为了增加组织通透性，需要用蛋白酶K(Fermentas，E00492)消化处理，根据胚胎发育的时期，选择不同的蛋白酶K消化时间(24hpf1min，36hpf 5～8min，2dpf时期15～18min，3dpf时期20min，4dpf时期25min，5dpf时期30min)；d.消化结束后用PBST润洗一遍，然后用4％多聚甲醛进行后固定约20min，再用PBST室温漂洗3次，每次10min；e.加入杂交缓冲液(hybridization buffer，HB，配方：50％甲酰胺，5×SSC，9mM pH6.0柠檬酸，50μg/ml肝素，500μg/ml tRNA，0.1％吐温20)，65℃预杂交3小时；f.加入用杂交缓冲液稀释的带有地高辛标记的探针(探针合成参考文献：Chitramuthu BP,Bennett HP.High resolution whole mount in situ hybridizationwithin zebrafish embryos to study gene expression and function.J Vis Exp.2013(80):e50644.)，放到65℃孵育过夜。其中，SSC(SSC缓冲溶液)储液为20×SSC(salinesodium citrate)，其配方为：3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠，pH为7.0。
③抗体孵育：a.回收探针，分别用预热好的50％(v/v)甲酰胺/2×SSCT溶液(含有Tween-20的SSC)、2×SSCT溶液、0.2×SSCT溶液溶液漂洗胚胎，放在65℃杂交炉进行，漂洗2次，每次20min；b.加入PBST漂洗，室温漂洗3次，每次5min；c.加入封闭缓冲液(PBST中加2％(v/v)羊血清)，孵育2小时；d.更换为封闭缓冲液配制的抗体(Anti-digoxigenin-AP，Roche，11093274910)，4℃孵育过夜。
④染色：a.丢弃抗体，加入PBST漂洗6次，每次20min；b.加入Buffer9.5T(100mMTris-HCl，pH为9.5，5mM氯化镁，0.1％(v/v)吐温20)漂洗2次，每次10min；c.加入NBT/BCIP染液(Roche，12933900)，实时检测染色状态；d.加入PBST漂洗3次，每次10min；e.加入4％多聚甲醛进行后固定约20min；f.最后放入70％(w/v)甘油中，于-20℃避光保存。
分别用成熟中性粒细胞标记基因的探针lyz和mpx进行原味杂交，结果如图2A、2B和2C所示，荧光定量PCR检测lyz和mpx的表达水平如图2E所示，与同胞野生型斑马鱼(asxl1sib)相比，asxl1突变体(asxl1mut)中中性粒细胞标记基因lyz和mpx表达下降，提示突变体中的中性粒细胞发育不成熟。
(4)苏丹黑B染色
①收集3dpf的斑马鱼胚胎，去掉胚胎培养液之后，用PBST润洗一次；
②去上清后即用4％多聚甲醛固定，在室温摇床固定2小时；
③PBST洗3次，每次10min；
④加入配好的苏丹黑B染色液(Andy Bio，B100131)，室温摇床染色30min，再用70％(v/v)乙醇反复冲洗，反复洗几个小时之后就可在体式显微镜下观察结果。成熟中性粒细胞染色苏丹黑B染色(SBB)结果如图2A和2D所示。
(5)突变体血象分析：
①胚胎期中性粒细胞收集：
胚胎收集：asxl1杂合突变体斑马鱼asxl1+/-来自于上述制备的asxl1F1杂合突变体。带有Tg(lyz:DsRED)转基因背景的asxl1+/-斑马鱼是由asxl1杂合突变体斑马鱼asxl1+/-与转基因斑马鱼Tg(lyz:DsRED)杂交获得。有Tg(lyz:DsRED)背景的asxl1+/+和asxl1-/-斑马鱼是由带有Tg(lyz:DsRED)背景的asxl1+/-斑马鱼自交获得。带有Tg(lyz:DsRED)背景的asxl1+/+和asxl1-/-斑马鱼与各自相同基因型的鱼杂交，收取胚胎，在24hpf～36hpf的时期，分别挑选出lyz：DsRED阳性的胚胎，继续培养到5dpf时期，收集胚胎。
细胞悬液的准备a.将胚胎收集到100μm的细胞滤网上，用1×PBS清洗一遍，再用细胞收集缓冲液(0.9×磷酸盐缓冲液+5％(v/v)胎牛血清)润洗一遍；b.取1mL注射器的活塞，剪去突出部分，用其对鱼进行碾压磨碎，同时，一边用细胞收集缓冲液冲洗，收集分离的细胞，最后所有细胞收集在40mL缓冲液中；c.将收集好细胞的离心管放入已预冷的4℃离心机中，200g离心10min；d.去上清，各加入1mL Dispase(1U/mL的中性蛋白酶，用1×PBS配制)，重悬组织，将所有重悬液转移到1.5mL离心管中，再将其放入37℃孵箱中消化30min(为了更好的消化，在孵育过程中注意每隔一段时间上下颠倒将液体混匀)；e.已消化好的细胞放入已预冷的4℃离心机中，200g离心5min；f.去上清，加入1mL Washing buffer(20％(v/v)FBS，5mM CaCl2，50μg/mL Turbo DNase，用Hanks buffer稀释)，用枪头轻轻吹打混匀，放入4℃离心机中，200g离心5min；g.去上清，加入1mL Resuspend buffer(10％(v/v)FBS，5mMEDTA(乙二胺四乙酸)，用PBS稀释)，用枪头轻轻吹打混匀，再将细胞悬液通过40μm的细胞滤网，此时得到的细胞悬液经过流式分选出DsRed阳性的中性粒细胞。
②肾脏血收集：a.麻醉生长期为6个月和1年的野生型asxl1+/+斑马鱼和突变体asxl1-/-斑马鱼后剪开腹部，翻开其他脏器，找到贴在背部的肾脏，用眼科镊小心夹出肾脏；b.将取出的肾脏放到装有1ml细胞收集缓冲液(0.9×磷酸盐缓冲液+5％(v/v)胎牛血清)中，用1mL枪头吹散细胞；c.吹散的肾脏血溶液用40μm细胞滤网进行过滤，即可做后面的细胞甩片。进行中性粒细胞的分析通过流式分选仪的前向角散射(forward scatter，FSC)与侧向角散射(side scatter，SSC)，可将斑马鱼成鱼肾脏血细胞分出髓系细胞进行后面的制片及染色处理。
③血细胞薄层制片：a.将单孔浓缩器与防脱载玻片利用细胞薄层制片仪配置的架子夹紧备用；b.取200μL步骤②中获得的血细胞溶液，加到单孔浓缩器的凹槽里；c.将其放到细胞薄层制片仪中，400rpm，离心3min进行甩片，细胞制片完成后，可进行后面的染色。
④May-Grunwald/Giemsa染色：a.每个片子加1mL麦格EMB培养基溶液(Merck，1.01424.1000)，加的时候从一侧轻加，注意不要将液体直接冲打细胞所在位置，染色5min；b.轻轻冲洗片子，加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS)，室温清洗5min；c.去掉磷酸盐缓冲液之后，晾干，加入1mL吉姆萨染液工作液(Merck，1.09204.0100，Giemsa(吉姆萨)与磷酸盐缓冲液1：20)。
⑤结果：5dpf时期分选出中性粒细胞后进行May-Grunwald/Giemsa染色并计数成熟中性粒细胞比例结果如图2F和2G所示，根据分选中性粒细胞的染色结果统计发现，asxl1突变体中成熟分叶的中性粒细胞比例下降，表明asxl1突变体中中性粒细胞的发育受到了影响。
成鱼的肾脏血血象分析结果如图3A～3D所示；asxl1突变体和其同胞野生型斑马鱼肾脏血细胞May-Grunwald/Giemsa染色结果如图E所示；分选出asxl1突变体和其同胞野生型斑马鱼的中性粒细胞之后进行May-Grunwald/Giemsa染色并计数成熟中性粒细胞比例结果如图3F和3G所示。根据统计发现，无论是6个月还是1年的成鱼肾脏血中，都主要表现为突变体中的髓系细胞减少，并细分发现主要是中性粒细胞减少，此外也会伴随其他谱系比如红系祖细胞增加或者淋巴细胞增加。主要表现骨髓增生异常综合征伴粒系病态造血。此外通过分选的髓系细胞统计同样发现，突变体中的中性粒细胞主要表现为不成熟的不分叶状态。
(6)荧光定量PCR检测髓系标记基因的表达变化
总RNA利用Trizol(Roche，TriPure Isolation Reagent)提取，继而利用反转录试剂盒(Promega,Madison,USA,M1701)合成cDNA。实时荧光定量PCR利用SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Roche,Austin,USA；4472908)染料在LightCycler 96机器上进行。具体操作步骤参照说明书。
对asxl1突变体和同胞野生型斑马鱼肾脏血中的髓系细胞分选后进行荧光定量PCR分析，引物序列如表1所示：
表1
引物 序列5′-3′
lyz-FP(上游引物) 5’-AAAGCAGGTTTAAGACCCAC-3’
lyz-RP(下游引物) 5’-CCAGGTTTCCCATGATTTCAG-3’
mpx-FP(上游引物) 5’-CCGAGATGGCGATAGGTTG-3’
mpx-RP(下游引物) 5’-TCGAGATCAAAAGCTGGGATA-3’
pu.1-FP(上游引物) 5’-GTCAGAACGATCACTCTTGG-3’
pu.1-RP(下游引物) 5’-GTAAGTCATCTGTGGATTGGT-3’
cebpa-FP(上游引物) 5’-CCCCTACATCTACAAAGACACCG-3’
cebpa-RP(下游引物) 5’-TGTGGAATAAGTCAGCCAGGAA-3’
cebp1-FP(上游引物) 5’-ACACATAGCCATGTCGGT-3’
cebp1-RP(下游引物) 5’-CTCAGTGTTGGTGTTTGGG-3’
ef1α-FP(上游引物) 5’-TACTTCTCAGGCTGACTGTG-3’
ef1α-RP(下游引物) 5’-ATCTTCTTGATGTATGCGCT-3’
结果如图3H所示，在asxl1突变体斑马鱼胚胎中，成熟中性粒细胞特异性基因lyz和mpx表达明显降低。此外，在分选出来的中性粒细胞中检测髓系相关基因表达发现，髓系祖细胞标记基因pu.1和cebpa表达升高，而成熟粒细胞标记基因cebp1，mpx和lyz表达下降。
(7)组蛋白修饰的检测
①样品处理
胚胎破膜后，用Deyolk Buffer(1mM EDTA，PBS稀释)去除卵黄囊，4℃离心200g，5min；加入含有蛋白酶抑制剂的Whole Cell Lysis Buffer(Cell SignalingTechnology，#9803)，匀浆处理后静置20min，4℃离心14000rpm，5min，收集上清；加入5×Loading buffer，使其稀释为1×Loading buffer，混匀，98℃煮5min，冷却至室温。
②SDS-PAGE
配制浓缩胶为4％，分离胶为12％，用80V电压进行跑胶。
③蛋白转膜及显色
转膜条件为250mA，90min水浴，转膜之后进行封闭及抗体孵育，抗体为H3(abcam，ab1791)，H2AK119ub(CST，#8240)，H3K4me3(abcam，ab8580)，H3K27me3(abcam，ab6002)，用二抗孵育之后，加入ECL显色液(Tenon，6180-501)显色观察。
结果如图4所示，asxl1突变体中整体的H3K4me3以及H2AK119ub均减少，而H3K27me3改变不大。表明asxl1突变之后可能影响了其蛋白功能从而导致组蛋白修饰的改变。
(8)去甲基化酶抑制剂处理
在胚胎24hpf时期进行破膜，更换含有抑制剂(去甲基化酶KDM5抑制剂CPI-455、KDM6B的抑制剂GSK J1)的胚胎培养液，处理48小时，中间更换一次液体，收集处理后的胚胎进行后面原位杂交的检测(方法参考步骤(3)整体原位杂交)。
原位杂交结果如图5所示，首先我们选用了去甲基化酶KDM5抑制剂CPI-455。KDM5家族是能对组蛋白H3上的第4位赖氨酸上进行去甲基化。在经过10mM的CPI-455(Selleck，S8287)处理之后，我们发现无论是在sibling还是mutant中，成熟中性粒细胞标记基因lyz的表达都有明显的上升。此外，我们也选用了KDM6B的抑制剂GSK J1(Selleck，S7581)，KDM6B是能特异性针对组蛋白H3的第27位的二甲基化和三甲基化的赖氨酸进行去甲基化作用。在经过50mM的GSK J1处理之后，与KDM5抑制剂相反，我们发现无论是在sibling还是mutant中，成熟的中性粒细胞标记基因lyz的表达都有明显下降。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种突变体斑马鱼在制备骨髓增生异常综合征的动物模型中的应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突变前
<400> 1
ccagggtgtg gatgtcatca ggacattggc agc 33
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突变后（7）
<400> 2
ccagggtgtg gatgtcatca ggcagc 26
<210> 3
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突变后（22）
<400> 3
ccattggcag c 11
<210> 4
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FP
<400> 4
gaaattaata cgactcacta tagggtgtgg atgtcatcag gacatgtttt agagctagaa 60
atagc 65
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RP
<400> 5
agcaccgact cggtgccact 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FP1
<400> 6
tgaaccatct ccctcttctg t 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RP1
<400> 7
gtctgagcca tgctggataa ct 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> lyz-FP
<400> 8
aaagcaggtt taagacccac 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> lyz-RP
<400> 9
ccaggtttcc catgatttca g 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mpx-FP
<400> 10
ccgagatggc gataggttg 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mpx-RP
<400> 11
tcgagatcaa aagctgggat a 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pu.1-FP
<400> 12
gtcagaacga tcactcttgg 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pu.1-RP
<400> 13
gtaagtcatc tgtggattgg t 21
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cebpa-FP
<400> 14
cccctacatc tacaaagaca ccg 23
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cebpa-RP
<400> 15
tgtggaataa gtcagccagg aa 22
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cebp1-FP
<400> 16
acacatagcc atgtcggt 18
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cebp1-RP
<400> 17
ctcagtgttg gtgtttggg 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ef1α-FP
<400> 18
tacttctcag gctgactgtg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ef1α -RP
<400> 19
atcttcttga tgtatgcgct 20

Claims (3)

1.一种突变体斑马鱼在制备骨髓增生异常综合征的动物模型中的应用，其特征在于：所述突变体斑马鱼为asxl1突变体斑马鱼；
所述的asxl1突变体斑马鱼为斑马鱼asxl1基因第12个外显子中第817位至823位缺失7个碱基或第798位至819位缺失22个碱基的斑马鱼；
所述的骨髓增生异常综合征为骨髓增生异常综合征伴粒系病态造血，其症状为中性粒细胞发育异常，进而导致中性粒细胞减少。
2.根据权利要求1所述的突变体斑马鱼在制备骨髓增生异常综合征的动物模型中的应用，其特征在于：所述的骨髓增生异常综合征是由asxl1基因的异常表达引起。
3.根据权利要求1所述的突变体斑马鱼在制备骨髓增生异常综合征的动物模型中的应用，其特征在于，包括如下步骤，所述的asxl1突变体斑马鱼通过如下方法制备得到：
将gRNA和Cas9 mRNA混合均匀，然后共同注射到野生斑马鱼胚胎中，再将获得的胚胎进行培养，得到asxl1基因缺失斑马鱼突变体；
所述的gRNA通过如下方法制备得到：以含有gRNA骨架序列的质粒为模板进行PCR扩增，得到模板DNA；然后利用T7 RNA聚合酶体外转录合成gRNA；其中，PCR扩增引物为：
FP:5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTGTGGATGTCATCAGGACATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；
RP:5’-AGCACCGACTCGGTGCCACT-3’。
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Zebrafish models of myeloid malignancies produced through tet2 and asxl1 genomic editing;visa Gjini,etc.;《cancer research》;20150422;摘要 *
利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼lgalsla等9个基因的突变;刘欢欢;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;20160229;第43页 *
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