CN111041106B - 一种基于荧光定量pcr技术区分人源dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术区分人源DNA的方法,以及一种基于荧光定量PCR技术区分人源DNA的组合物或试剂盒,包括核苷酸序列的引物和/或探针。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于荧光定量PCR技术区分人源DNA的方法,以及检测引物和探针。
背景技术
近年来,随着细胞类药物的快速发展,越来越多的细胞正被开发成细胞治疗药物,逐步从科研走向临床,细胞治疗是新药研发的趋势。细胞治疗类药物,研究其在体内药代动力学是判断其疗效和毒副作用不可或缺的环节。不同于传统的化学药物,对于细胞药物进入机体后的动态变化规律,包括其吸收、分布、代谢和排泄的过程和特征,目前国际上尚未能建立明确的细胞药物在体内药代动力学的研究方法。
非临床药代动力学研究,特别是动物实验,在新药研究开发的评价过程中起着重要作用。通过研究其在体内的动态,预测治疗中的合适计量,对降低细胞治疗的不确定性、增加疗效和减少毒副作用,都有很大的帮助。要将动物实验的结果作为一种评估细胞产品治疗效果的方法,将其与临床效果联系起来,势必需要找到一种灵敏度高且经过充分验证的方法来量化细胞产品在动物模型中的分布。与实验鼠、兔相比,实验猴在新药研究领域是一种非常重要的实验动物,因其与人的高度相似性,实验猴被认为是进行药物评价的重要工具。细胞药物在应用到人体之前,在与人亲缘关系比较相近的动物中进行比较系统的评价是有必要进行的。
目前研究细胞在实验猴中分布的方法主要有动物活体成像、荧光蛋白标记、免疫组化、qPCR等。各种方法各有其优缺点。例如核磁共振(MRI),MRI能反应细胞在体内的分布,该方法需要在体外标记细胞,通过成像的方式对注入机体内的细胞进行检测,从而判定细胞的存活及被清除的命运,该方法灵敏度高,标记时间长。但某些标记手段可能对细胞活性有影响,有报道称MRI标记骨髓间充质干细胞后,细胞分化能力受损。而且MRI灵敏度相对不足,原因是,在细胞死亡后释放出的氧化铁颗粒(MRI标记物),会造成非特异性显影,出现假阳性。例如绿色荧光蛋白标记(GFP),该方法使用基因修饰,使得细胞能够表达荧光蛋白,绿色荧光信号可以通过荧光显微镜直接观察,该方法有易于检测的优点。但细胞的遗传物质被改变,无法确保这种改变百分百稳定。任何对细胞进行标记的方法都有可能对细胞造成改变,对子代细胞分化等造成影响。免疫组化的方法,不需要标记细胞,但该方法需要分析大量切片和微观观察,同时由于人与猴的相似性,很多抗原在人与猴之间存在交叉,且这种方法难以标准化,只能得到半定量结果。
qPCR的方法是一种灵敏度高,操作相对简单的方法,且有望实现定量分析。要想建立qPCR的方法,通过检测血液和组织样本中DNA来实现人源细胞在实验猴中的定量分析,首先要找到能够区分人与动物模型DNA的序列、以及引物。虽然文献中指出了一些人和猴某些特定基因表达的差异,但是由于实验用的细胞注射到猴以后,细胞可能分化成不再表达该特定基因的细胞,因此目前区分人和猴的细胞的基因会存在假阴性。即人细胞存在于猴组织中,但是其不能被检测出来。例如基于人源性特殊基因片段-Alu基因作为分子标志物设计的引物,希望通过qPCR的方法来实现人与猴DNA的区分,最终实现在猴细胞或组织中检测人细胞的目的。遗憾的是,这些引物只能区分人与啮齿动物。
例如2012年Pengyue Song等报道了,基于DNA特异性引物的高效可重复PCR方法,能够检测小鼠组织中异种移植的人细胞。2015Julie等发表文章,报道了采用qPCR测定大鼠和小鼠中移植人细胞数量的方法。但鲜少有文章报道,能通过qPCR的方式区分人与猴DNA。
发明内容
一方面,本发明公开了一种DNA序列,其中所述DNA序列选自如SEQ ID NO:1所示序列或其片段、与SEQ ID NO:1的反向互补序列或其片段组成的组,所述DNA序列用于在混有人类与非人类动物组织样本中区分人类和非人类动物DNA。
SEQ ID NO:1的序列为:
tttaaaaacctccctatcacctccgatcactgttgaaaaagcattaaactgtaagaaggggttagtattgggggaagcatgtcgtttctaaggatgggaaaggaaaatgaagtgcttctcctccctgatccaagagaggcagcttcatgaaacttctgtatgaaaatgggagcgtctgtaggaagagggactctatttacataac
另一方面,本发明提供了一种DNA序列在制备用于在混有人类与非人类动物组织样本中区分人类和非人类动物DNA的试剂或试剂盒中的用途,其中所述DNA序列选自如SEQID NO:1所示序列或其片段、与SEQ ID NO:1的反向互补序列或其片段组成的组。
本发明还提供了一种检测DNA序列的试剂在制备用于在混有人类与非人类动物组织样本中区分人类和非人类动物DNA的试剂或试剂盒中的用途,其中所述DNA序列选自如SEQ ID NO:1所示序列或其片段、与SEQ ID NO:1的反向互补序列或其片段组成的组。
在一个具体实施例中,所述DNA序列为如SEQ ID NO:1所示序列或其反向互补序列,或这些全长序列的一部分片段,所述片段为SEQ ID NO:1或其返现个互补序列的5’端和/或3’端缺失1-70个核苷酸的序列,所述片段序列仍可用于在混有人类与非人类动物组织样本中区分人类和非人类动物DNA。
在一个具体实施例中,所述检测DNA序列的试剂选自通过PCR技术扩增所述DNA序列所需的引物和探针。
在一个具体实施例中,所述探针的序列如SEQ ID NO:10所示。
在一个具体实施例中,所述探针上带有检测标记,所述检测标记优选选自由FAM、TET、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine 6G、TMR、TMRITC、x-rhodamine、Texas red、生物素、和亲和素所组成的组。
在一个具体实施例中,所述引物的序列选自由如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列;如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5所示的序列;如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:3所示的序列;如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的序列;和如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示的序列组成的组。
在一个具体实施例中,所述非人类动物选自由恒河猴、绿猴、食蟹猴、大鼠、小鼠、兔组成的组。
在一个具体实施例中,所述混合人类与非人类动物组织为非人类动物例如恒河猴的组织及血液样本中混合了人源DNA,所述人源DNA来源于人源细胞。在一个具体实施例中,人源DNA来自于人源视网膜色素上皮细胞中的DNA。
再一方面,本发明公开了一种组合物,包含引物和探针,其中所述探针的序列如SEQ ID NO:10所示,所述引物的序列选自由如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列;如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5所示的序列;如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:3所示的序列;如SEQID NO:6和SEQ ID NO:7所示的序列;和如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示的序列组成的组。
其中,所述所述探针上带有检测标记,所述检测标记优选选自由FAM、TET、Alexa488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine 6G、TMR、TMRITC、x-rhodamine、Texas red、生物素、和亲和素所组成的组。
又一方面,本发明还提供了一种试剂盒,包含如前所述的组合物。
进一步,本发明还提供了一种非诊断治疗目的在混合人类与非人类动物组织中区分人类和非人类动物DNA序列的方法,其中使用如前所述的组合物或如前所述的试剂盒对混合了人类和非人类动物组织的样本进行DNA的PCR扩增。
在一个具体实施例中,其步骤具体包括:
1)使用组合及细胞DNA提取试剂盒对混合了人类和非人类动物组织的样本进行DNA提取;
2)使用如前所述的组合物或如前所述的试剂盒中所述的引物和探针进行TaqmanqPCR扩增;
3)收集荧光信号,计算循环阈值CT值,计算样本中人类DNA的浓度。
其中所述非人类动物选自由恒河猴、绿猴、食蟹猴、大鼠、小鼠、兔组成的组。
其中所述混合人类与非人类动物组织为非人类动物例如恒河猴的组织及血液样本中混合了人源DNA,所述人源DNA来源于人源细胞,优选来源于视网膜色素上皮细胞。
有益效果
本发明找到了人基因组染色体上的一段DNA序列,该DNA序列为人源特异性,在该DNA序列的基础上设计了一些引物及探针,能够区分人与多个物种的DNA。实际应用中可以实现从实验动物DNA中检测人源特异性DNA。
附图说明
图1示出靶向本发明的如SEQ ID NO:1所示的DNA序列时,使用R1、F1和Probe1检测不同物种DNA的扩增曲线图(①为人源视网膜色素上皮细胞DNA;②为恒河猴DNA;③为绿猴DNA;④为食蟹猴DNA;⑤为大鼠DNA;⑥为小鼠DNA;⑦为兔DNA)。
图2示出靶向本发明的如SEQ ID NO:1所示的DNA序列时,使用R2、F2和Probe1检测不同物种DNA的扩增曲线图(①为人源视网膜色素上皮细胞DNA;②为恒河猴DNA;③为绿猴DNA;④为食蟹猴DNA;⑤为大鼠DNA;⑥为小鼠DNA;⑦为兔DNA)。
图3示出靶向本发明的如SEQ ID NO:1所示的DNA序列时,使用R2、F1和Probe1检测不同物种DNA的扩增曲线图(①为人源视网膜色素上皮细胞DNA;②为恒河猴DNA;③为绿猴DNA;④为食蟹猴DNA;⑤为大鼠DNA;⑥为小鼠DNA;⑦为兔DNA)。
图4示出靶向本发明的如SEQ ID NO:1所示的DNA序列时,使用R3、F3和Probe1检测不同物种DNA的扩增曲线图(①为人源视网膜色素上皮细胞DNA;②为恒河猴DNA;③为绿猴DNA;④为食蟹猴DNA;⑤为大鼠DNA;⑥为小鼠DNA;⑦为兔DNA)。
图5示出靶向本发明的如SEQ ID NO:1所示的DNA序列时,使用R2、F3和Probe1检测不同物种DNA的扩增曲线图(①为人源视网膜色素上皮细胞DNA;②为恒河猴DNA;③为绿猴DNA;④为食蟹猴DNA;⑤为大鼠DNA;⑥为小鼠DNA;⑦为兔DNA)。
图6示出靶向基因SRGAP2时,检测不同物种DNA的扩增曲线图(①为人源视网膜色素上皮细胞DNA;②为恒河猴DNA;③为绿猴DNA;④为食蟹猴DNA;⑤为大鼠DNA;⑥为小鼠DNA;⑦为兔DNA);
图7示出靶向基因Qhomo2时,检测不同物种DNA的扩增曲线图(①为人源视网膜色素上皮细胞DNA;②为恒河猴DNA;③为绿猴DNA;④为食蟹猴DNA;⑤为大鼠DNA;⑥为小鼠DNA;⑦为兔DNA);
图8示出靶向基因Alu时,检测不同物种DNA的扩增曲线图(①为人源视网膜色素上皮细胞DNA;②为恒河猴DNA;③为绿猴DNA;④为食蟹猴DNA;⑤为大鼠DNA;⑥为小鼠DNA;⑦为兔DNA);
图9示出实时荧光定量PCR检测人源视网膜色素上皮细胞目的DNA序列的典型标准曲线。
具体实施方式
下面将通过具体描述,对本发明作进一步的说明。
除非另有限定,本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
本申请中,单数形式“一个”、“该”包括复数对象,除非上下文另外清楚规定。
如本文所用,术语“非人类动物”包括所有脊椎动物,例如哺乳动物和非哺乳动物,例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、大鼠、小鼠、两栖动物、爬行动物等。在具体实施例中,非人类动物选自由恒河猴、绿猴、食蟹猴、大鼠、小鼠、兔组成的组。
如本文所述,术语“DNA序列”本发明中是指编码蛋白的DNA序列,例如,但不限于,存在于细胞基因组中的编码蛋白的DNA序列。
如本文所述,术语“探针”在本发明中是指带有检测标记的寡核苷酸分子。“检测标记”在本发明中是指能够产生检测信号的分子或基团检测标记包括,但不限于,荧光分子(例如,参见欧洲专利EP144914)、放射性同位素(例如,参见美国专利US4358535和4446237)、抗体、酶和寡核苷酸(例如,寡核苷酸条形码)。
荧光分子的例子包括但不限于6-carboxyfluorescein(FAM)、Tetrachlorofluorescein(TET)、Alexa(例如Alexa 488,Alexa 532)、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine 6G(P6G)及其衍生物(tetramethyirhodamine(TMR),tetramethylrhodamine isothiocyanate(TMRITC),x-rhodamine,Texas red,由位于美国俄勒冈州尤金市的分子探针公司(Molecular Probes,Inc.)生产的商品名为"BODJPY FL"、"BODIPY FL/C3"、"BODIPY EL/C6"、"BODIPY 5-FAM"、"BODIPY TMR"、"BODIPY TR"、"BODIPY R6G"、"BODIPY 564"、"BODIPY 581"的探针及衍生物。
检测标记的示例还可以参见美国专利号5,723,591和5,928,907;WO2011066476和WO2012149042;www.idahotech.com;Gudnason等人,NucleicAcids Res.,35(19):e127(2007),其全文通过引用并入本发明。
检测标记可以通过共价键或非共价键连接在寡核苷酸分子上。非共价键包括但不限于氢键、离子键、范德华力和疏水键。例如,在一些实施方式中,检测标记可以通过共价键连接在核苷酸分子上。例如,在合成寡核苷酸分子时可以掺入氨基烯丙基(amino-allyl)UTP,所产生的氨基烯丙基标记的核酸分子可以和含有NHS-酯(NHS-ester)的荧光分子(例如Alexa 488,Alexa 594,Alexa 647(Invitrogen)或Cy3(GE Healthcare))偶联形成共价键连接。
在某些实施方式中,所述检测标记选自:FAM、Tetrachlorofluorescein(TET)、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine 6G(P6G)、tetramethyirhodamine(TMR)、tetramethylrhodamineisothiocyanate(TMRITC)、x-rhodamine、Texas red、生物素、亲和素。
在某些实施方式中,所述探针还带有可淬灭信号。“淬灭剂”在本发明中是指,当与检测标记在空间上足够靠近时,能够阻止检测标记产生检测信号的分子。当淬灭剂与检测标记距离较远时,淬灭剂不能阻止检测信号的产生。
淬灭分子的例子包括但不限于DDQ-I、DDQ-II、Dabcyl、Eclipse、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、"QSY7"“QSY-21”和"QSY33"(分子探针公司)、Ferrocene及其衍生物、methyl viologen、tetramethylrhodamine(TAMRA)、Minor groovebinding non-fluorescent quencher(MGBNFQ)和N,N'-dimethyl-2,9-diazopyrenium。
在某些实施方式中,所述荧光分子是FAM,所述淬灭分子是MGBNFQ或DDQ-I。在某些实施方式中,所述荧光分子是TAMRA、Cy3、ROX、Cy5,所述淬灭分子是DDQ-II。在某些实施方式中,所述荧光分子是FAM、HEX、ROX、JOE,所述淬灭分子是Dabcyl。在一些实施方式中,所述探针在5'端具有荧光分子FAM或VIC,在3'端具有淬灭分子MGBNFQ。
可以通过本领域公知的方法将淬灭分子连接在探针上。例如,在合成寡核苷酸分子时可以掺入氨基烯丙基(amino-allyl)UTP,所产生的氨基烯丙基标记的核酸分子可以和含有NHS-酯(NHS-ester)的淬灭分子偶联形成共价键连接。又例如,可以在合成寡核苷酸的过程中在3’端通过和淬灭分子(例如Dabcyl)的亚磷酰胺衍生物反应将淬灭分子连接到寡核苷酸上。
在某些实施方式中,当所述探针是完整的时,所述信号被淬灭。在某些实施方式中,检测标记和淬灭剂分别连接在探针的5’端和3’端。例如,非突变区探针的5’端连接检测标记,3’端连接淬灭剂,或者3’端连接检测标记,5’端连接淬灭剂。
在某些实施方式中,使用具有5’-3’外切酶活性的聚合酶扩增含有SEG ID NO:1或其互补序列,或与SEQ ID NO:1序列或其互补序列片段作为所述模板序列,并在反应混合物中加入所述探针。在扩增过程中,如果所述探针与模板序列杂交,所述探针将会被聚合酶在聚合反应过程中降解,从而使所述探针上的荧光分子与淬灭分子分离,并产生荧光信号(参见美国专利US5210015和US5487972)。
本文所述的术语“片段”是指在与本发明中所述DNA序列如SEQ ID NO:1所示序列或其反向100%互补序列的片段相比,其5’端和/或3’端缺失部分核苷酸的序列,例如与SEQID NO:1所示序列相比,5’端缺失了1-70个、2-70个、5-70个、10-70个、20-70个、30-70个、40-70个、50-70个、60-70个核苷酸的序列,或者3’端缺失了1-70个、2-70个、5-70个、10-70个、20-70个、30-70个、40-70个、50-70个、60-70个核苷酸的序列,或者5’端和3’端同时缺失了1-70个、2-70个、5-70个、10-70个、20-70个、30-70个、40-70个、50-70个、60-70个核苷酸的序列,这个片段通过PCR扩增后按照本领域技术人员的认识依然可以扩增出本发明实施例中相同或者相似的长度,同样达到用于检测和区别人类和非人类组织DNA的目的。本领域技术人员应该了解,针对SEQ ID NO:1的PCR,通过引物探针最终获得的PCR产物片段的长度可以是SEQ ID NO:1全长,也可以是其部分。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明。提供实施例仅用于说明目的,并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1:检测方法特异性验证
1.引物的设计与合成:
本发明在人源特异性DNA序列Seq1(SEQ ID NO:1)的基础上设计了多对引物及探针,同时从文献及专利中找到了3组人源特异性性基因及其引物(SRGAP2、Qhomo2及Alu)作为对照。其中Qhomo2的引物应用自文献(《脐带间充质干细胞临床前安全性研究》,王有为,北京协和医学院,2013年),根据报道该引物可以特异性检测人源DNA。SRGAP2的引物引用自专利CN201910477468.2《特异性检测人源性基因组DNA引物及其应用》,根据报道该引物能从多个物种DNA(包括食蟹猴、大鼠、小鼠、新西兰兔)中检测人源特异性DNA序列。而引物Alu扩增的基因Alu序列是人类基因组中具有普遍性、多样性和特异性的短重复序列,Alu家族元件在法医DNA分析中能被用来进行个体识别。也有文献报道Alu序列能用于人与其他物种DNA的区分,本发明的Alu引物及其探针应用自文献。表1.1为本发明中使用的的所有引物和探针的序列,其中探针(Probe)的5’端带有报告基团,3’端带有淬灭基团。
表1.1人源特异性DNA检测引物序列表
2.DNA提取
使用组织及细胞DNA提取试剂盒,按照试剂盒的说明书提取不同物种(人、恒河猴、绿猴、食蟹猴、大鼠、小鼠和兔)来源的细胞及组织的基因组DNA。
3.Taqman qPCR步骤
(1)Taqman qPCR扩增的反应体系,单个样本为20μL:10μL 2×SuperReal PreMix(Probe);1μL 50×ROX Reference Dye;0.6μL引物R(10μM);0.6μL引物F(10μM);0.4μL探针Probe(10μM);加入20ng的DNA;用RNase-Free ddH2O将反应体系补足20μL。该步骤使用的引物及探针及其组合见下表,一共13组引物及探针组合。
表1.2人源特异性DNA检测引物组合表
(2)Taqman qPCR扩增的反应条件为:95℃预变性15分钟;95℃变性1秒;62℃退火延伸30秒,共进行40个循环;在62℃处收集荧光信号。实验结束后从仪器中获取CT值。
(3)根据(2)的实验得到的CT值判定上述引物和探针检测人源DNA的效果,有CT值说明有扩增,无CT说明无扩增。若某一组引物及探针的组合,在其他物种中无扩增,只在人DNA样本中有扩增,说明该组合能扩增人源特异性DNA序列。
4.实验结果
表1.3人源特异性DNA检测结果统计表
表1.3中为实验结果:其中“+”表示有扩增,“-”表示无扩增;“/”表示未进行实验。SRGAP2、Qhomo2及Alu为文献或专利中报道过的人源特异性基因,探针及引物均来自报道,实际在我们的实验中验证后表明,在区分人与实验猴DNA的实验中仅仅只有Qhomo2能区分人与绿猴DNA,SRGAP2、Alu区分不了人与三种实验猴(绿猴、食蟹猴及恒河猴)DNA。本发明中发现的DNA序列Seq1,针对该DNA序列设计的部分引物及探针的组合(例如R2、F2加上Probe2)无法实现人与猴DNA的区分,也有一部分(例如R1、F1加上Probe1)可以实现人与多个物种(包括三种猴、大鼠、小鼠及兔)之间DNA的区分,图1、图6、图7、图8分别为引物组合R1、F1加上Probe1、SRGAP2、Qhomo2、Alu的扩增曲线图。图2至5示出了其他引物组合扩增DNA序列Seq1的扩增曲线图。实验结果也表明,本发明中合成的引物和探针,可以实现在多个物种中检测人源DNA。
表1.4引物的位置
表1.5扩增片段长度
实施例2:定量方法的开发及方法学验证
5组可以实现人与三种猴DNA区分的引物及探针的组合R1(SEQ ID NO:2)、F1(SEQID NO:3)加上Probe1(SEQ ID NO:10);R1(SEQ ID NO:2)、F2(SEQ ID NO:5)加上Probe1(SEQ ID NO:10);R2(SEQ ID NO:4)、F1(SEQ ID NO:3)加上Probe1(SEQ ID NO:10);R3(SEQID NO:6)、F3(SEQ ID NO:7)加上Probe1(SEQ ID NO:10);R2(SEQ ID NO:4)、F3(SEQ IDNO:7)加上Probe1(SEQ ID NO:10)。以下仅以其中一对引物及探针的组合(R1、F1加上Probe1)为例进行定量方法的开发及方法学验证。本领域技术人员应理解,其他引物因为可以区别人和其他物种,具有较好的特异性,因此应该也具有相似的方法学验证的效果。
1.标准曲线和质控样本的配制
1.1标准曲线样本的配制
根据下表配制标准曲线样本,其中标准品为人源视网膜色素上皮细胞注射液(含有人源视网膜色素上皮细胞的细胞溶液,该溶液可用于向恒河猴的双眼视网膜下注射治疗)的全基因组DNA(浓度约为:140ng/μL),按下表进行稀释先加入一定量体积的纯水,再加入相应体积人源视网膜色素上皮细胞注射液全基因组DNA、STD1~STD6到离心管中,涡旋混匀备用。
表2.1标准曲线样本的配制
注:以上配制可根据实际需要按比例放大或缩小。
1.2质控样本的配制
根据下表配制质控样本,其中标准品为人源视网膜色素上皮细胞全基因组DNA(浓度约为:140ng/μL),按下表进行稀释先加入一定量体积的纯水,再加入相应体积的人源视网膜色素上皮细胞注射液全基因组DNA、定量上限ULOQ、高质控HQC、中质控MQC、质控C、低质控LQC、定量下限LLOQ,进而配制成ULOQ(100ng/μL)、HQC(80ng/μL)、MQC(3.2ng/μL)、C(0.8ng/μL)、LQC(0.08ng/μL)及LLOQ(0.032ng/μL)。
表2.2质控品样本的配制
注:以上配制可根据实际需要按比例放大或缩小。
2.检测步骤
2.1DNA提取
使用组织及细胞DNA提取试剂盒,按照试剂盒的说明书提取细胞及组织的基因组DNA。
2.2Taqman qPCR步骤
(1)Taqman qPCR扩增的反应体系单个样本为20μL:10μL 2×SuperReal PreMix(Probe);1μL 50×ROX Reference Dye;0.6μL引物R(10μM);0.6μL引物F(10μM);0.4μL探针Probe(10μM);加入2μL的DNA(DNA模板分别为人源视网膜色素上皮细胞全基因组DNA、标准曲线样本、质控品样本、待测样本、空白基质阴性对照样本(Neg)和纯水无模板阴性对照(NTC));用RNase-Free ddH2O将反应体系补足20μL。
(2)Taqman qPCR扩增的反应条件为:95℃预变性15分钟;95℃变性1秒;62℃退火延伸30秒,共进行40个循环;在62℃处收集荧光信号。实验结束后从仪器中获得CT值,扩增效率(Efficiency),标准曲线的R2及标准曲线方程的Slope和截距。
3.数据处理
从获取的标准品CT值,扩增效率(Efficiency),R2及标准曲线方程的Slope和截距,计算标准曲线样本、HQC、MQC、LQC样本及待测样本的目的片段等的DNA浓度,Conc.=10(CT值-y-int)/Slope,浓度数据四舍五入后保留小数点后3位,%RE(相对误差),%CV(变异系数)保留小数点后2位。
报告中所用%RE、标准偏差(SD)、%CV以及目的DNA浓度等值均由Office Excel2010(美国Microsoft公司)软件计算得出。计算公式如下:
平均值:
相对误差百分比:
变异系数百分比:
标准偏差:
样本判断标准:1、当LLOQ和LOD的CT值均小于NTC和Neg的CT值:(1)待测样本的复孔CT值均小于LLOQ的平均CT值,出具浓度结果;(2)待测样本的复孔CT值均小于LOD的CT值,表示该样本为阳性;(3)如果LOD未出值,该批样本出具浓度结果;2、当Neg和NTC的CT值有一个小于LOD的CT值或者LOD未出值,则只有当待测样本的复孔CT值均小于LLOQ的平均CT值,出具浓度结果,NTC最小CT值与LLOQ之间为阳性样本;3、如果Neg和NTC的CT值有一个小于LLOQ的CT值,则只有当待测样本的复孔CT值均小于Neg和NTC的中最小的CT值,出具浓度结果。
4.方法学验证结果
4.1标准曲线与定量下限
按试验方案1.1配制标准曲线样本,上机检测后获取标准品CT值、扩增效率(Efficiency)、R2及标准曲线方程的斜率(Slope)和截距,进而获得标准曲线。确定方法的线性范围和定量下限(标准曲线的最低点)。至少2人分至少2天进行至少6个分析批的验证,统计各分析批内各浓度与理论浓度的相对误差(RE%)及所有分析批间各浓度的平均相对误差(RE%)和精密度(CV%)。
接受标准:各分析批内、批间的标准曲线样本浓度满足相对误差(RE%)在-75%~150%之间;批间精密度(CV%)≤60.00%;所有分析批需满足R2≥0.980。
结果显示:qPCR检测人源视网膜色素上皮细胞注射液目的片段的标准曲线的线性范围为:0.032~100.000ng/μL,定量下限为:0.032ng/μL。R2在0.991~0.999范围内;标准曲线各浓度点的批内准确度%RE在-16.75~43.75%范围内;各浓度点的批间准确度%RE在-4.53~12.50%范围内,精密度%CV在5.42~13.89%范围内;满足标准曲线准确度、精密度要求。具体结果见表2.3,典型标准曲线见图9,标准曲线拟合参数汇总见表2.4。
表2.3实时荧光定量PCR检测人源视网膜色素上皮细胞注射液目的DNA序列的标准曲线结果
备注:“/”表示无计算数据。
表2.4标准曲线拟合参数汇总
备注:标准曲线拟合公式:CT=Slope LgX0+y-int;其中X0为样本起始浓度,y-int为截距,Slope为斜率。
4.2精密度与准确度
为了验证此方法的批内、批间精密度(Precision)和相对误差(Accuracy),在同一分析批内按表2.2项配制成ULOQ、HQC、MQC、LQC、LLOQ 5个浓度的质控样本各3套,至少2人分至少2天进行至少6个分析批的验证。统计各质控样本浓度批内的精密度(CV%)、平均相对误差(%RE)以及批间总的精密度(%CV)、平均相对误差(RE%)。
接受标准:各浓度批内、批间的平均相对误差(RE%)在-75%~150%以内;各浓度批内、批间的精密度(CV%)≤60.00%。
结果显示,各质控样本浓度的批内准确度%RE在-22.50~41.25%范围内,批内精密度%CV在1.37~60.00%范围内;各质控样本浓度的批间准确度%RE在-0.91~15.60%范围内,批间精密度%CV在9.28~35.71%范围内,满足批内、批间准确度、精密度要求。以上数据表明该分析方法的准确度和精密度符合要求,具体结果见表2.5。
表2.5实时荧光定量PCR检测人源视网膜色素上皮细胞注射液目的DNA序列的精密度与准确度
/>
4.3不同空白基质基因组质量及浓度对目的DNA序列检测的影响
提取空白恒河猴的全血、肺、肝脏、脉络膜+RPE(视网膜色素上皮细胞)、虹膜DNA作为干扰基质。将标准曲线样本加入分别含有空白肺、肝脏DNA总量为200ng、100ng的反应体系中;将标准曲线样本加入分别含有空白脉络膜+RPE、虹膜、全血DNA总量为100ng、40ng的反应体系中(当空白基质DNA不足以补充到相对应的DNA总量时,以实际总量进行配制)。对样本进行检测,计算添加空白基质DNA的标准曲线各浓度与理论浓度的相对误差(RE%)。
接受标准:比较每个组织添加空白基质DNA的两个标准曲线∣RE%∣总和,并将∣RE%∣总和小的总量作为实际样本检测时反应体系中模板的添加量;如果两套标准曲线∣RE%∣总和接近,则选择标准曲线上低浓度点∣RE%∣较小的这套标准曲线中总量作为实际样本检测时反应体系中模板的添加量,并计算出最佳的检测浓度。在实际样本检测时,当实际样本浓度大于最佳检测浓度20%时,要将样本稀释为最佳检测浓度,如果实际样本浓度小于最佳检测浓度,则按实际浓度进行检测。
结果显示,空白恒河猴的全血DNA的总量分别为100ng、40ng时,两个标准曲线∣RE%∣总和分别为207.11、125.32,得出全血样本检测时反应体系中模板的添加量为40ng,样本的最佳的检测浓度为20ng/μL;空白恒河猴的肺脏DNA的总量分别为200ng、100ng时,两个标准曲线∣RE%∣总和分别为549.81、311.49,得出肺脏样本检测时反应体系中模板的添加量为100ng,样本的最佳的检测浓度为50ng/μL;空白恒河猴的肝脏DNA的总量分别为200ng、100ng时,两个标准曲线∣RE%∣总和分别为98.51、113.79,得出肝脏样本检测时反应体系中模板的添加量为200ng,样本的最佳的检测浓度为100ng/μL;空白恒河猴的脉络膜+RPE DNA的总量分别为100ng、40ng时,两个标准曲线∣RE%∣总和分别为356.71、95.04,得出脉络膜+RPE样本检测时反应体系中模板的添加量为40ng,样本的最佳的检测浓度为20ng/μL;空白恒河猴的虹膜DNA的总量分别为100ng、40ng时,两个标准曲线∣RE%∣总和分别为576.19、218.31,得出虹膜样本检测时反应体系中模板的添加量为40ng,样本的最佳的检测浓度为20ng/μL。具体结果见表2.6。
表2.6恒河猴的不同空白基质基因组质量及浓度对目的DNA序列检测的影响
/>
/>
备注:“*”表示未出值,实际浓度以0计算。
4.4检测限(LOD)
用纯水将LLOQ稀释成浓度为S1(0.016ng/μL)、S2(0.008ng/μL)、S3(0.004ng/μL)、S4(0.002ng/μL)的样本,每个浓度16个单孔进行检测确定方法的灵敏度,同时以空白恒河猴的全血、肺、肝脏、脉络膜+RPE、虹膜混合DNA作为阴性对照,进行检测确定方法的检出限(LOD),若某一浓度的样本已经达不到接受标准,则不进行比该浓度低的样本的检测。
接受标准:以满足60%样本的CT值<空白混合DNA的CT值或者灵敏度样本CT有值而空白混合DNA CT无值的最低浓度作为该方法的检测限,实际检测中以此浓度作为检测限(LOD)。若待测样本CT值大于定量下限(LLOQ)的CT值,计算出的浓度大于检测限(LOD),则定义该样本为阳性,但无准确浓度。
结果显示,当浓度为S1(0.016ng/μL)时,62.50%的S1样本的CT出值,空白混合DNA未出值;当浓度为S2(0.008ng/μL)时,31.25%的S2样本的CT值<空白混合DNA的CT值,得出该方法的检出限为S1(0.016ng/μL)。具体结果见表2.7和表2.8。
表2.7实时荧光定量PCR检测人源视网膜色素上皮细胞注射液目的DNA序列的检测限测定结果(一)
备注:“NaN”表示无CT值。
表2.8实时荧光定量PCR检测人源视网膜色素上皮细胞注射液目的DNA序列的检测限测定结果(二)
备注:“NaN”表示无CT值。
4.5选择性
实际检测中的待检样本包含各待检组织及血液所有的DNA溶液,为了评价空白基质(即试验动物组织及血液基因组)对于样本检测的影响,分别提取恒河猴全血、肺、肝脏、脉络膜+RPE、虹膜的DNA,并将其稀释为上述“4.3”部分中确定的最佳检测浓度,检测空白基质的CT,需没有明显的内源性DNA干扰影响样本阴阳性判定。
接受标准:恒河猴空白恒河猴全血、肺、肝脏、脉络膜+RPE、虹膜的DNA及纯水(NTC)的每个孔的CT值>LOD复孔中大的CT(或空白基质显示无CT)。
结果显示,恒河猴空白全血、肺、脉络膜+RPE、虹膜的DNA及纯水(NTC)的CT值均显示无CT,只有肝脏的复孔中有一个CT为39.54,大于LOD复孔中大的CT值,符合要求,表明没有明显的内源性DNA干扰影响样本阴阳性判定。具体结果见表2.9。
表2.9实时荧光定量PCR检测人源视网膜色素上皮细胞注射液目的DNA序列的选择性测定结果
备注:“NaN”表示无CT
5.结论
以上验证结果表明,用实时荧光定量PCR检测恒河猴体内人源DNA(人源视网膜色素上皮细胞DNA)的方法的线性范围为:0.032~100.000ng/μL,定量下限为0.032ng/μL,检测限为0.016ng/μL;精密度及准确度符合要求,无明显的内源性DNA干扰影响样本阴阳性判定,选择性良好,可用于恒河猴组织及血液样本中人源视网膜色素上皮细胞目的DNA序列的浓度检测。
前述实施例被认为是说明性的,而不是对本文所述的本发明的限制。本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述说明书表示,并且意在将落入权利要求书的等同物的含义和范围内的所有改变包括在其中。
序列表
<110> 江苏艾尔康生物医药科技有限公司
<120> 一种基于荧光定量PCR技术区分人源DNA的方法
<130> AJ2349PI19001
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 205
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
tttaaaaacc tccctatcac ctccgatcac tgttgaaaaa gcattaaact gtaagaaggg 60
gttagtattg ggggaagcat gtcgtttcta aggatgggaa aggaaaatga agtgcttctc 120
ctccctgatc caagagaggc agcttcatga aacttctgta tgaaaatggg agcgtctgta 180
ggaagaggga ctctatttac ataac 205
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物R1
<400> 2
ggggaagcat gtcgtttcta 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物F1
<400> 3
tcttggatca gggaggagaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物R2
<400> 4
acctccctat cacctccgat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物F2
<400> 5
cttcctacag acgctcccat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物R3
<400> 6
gggttagtat tgggggaagc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物F3
<400> 7
atgaagctgc ctctcttgga 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物R4
<400> 8
ggatgggaaa ggaaaatgaa g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物F4
<400> 9
ttcctacaga cgctcccatt 20
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 探针Probe1
<400> 10
cacttcattt tcctttccca tcctt 25
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 探针Probe2
<400> 11
cctccctgat ccaagagagg cagc 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物SRGAP2-F
<400> 12
cgatactcag gtcaaaggta agg 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物SRGAP2-R
<400> 13
ctgcaaatca cggtggaaat ac 22
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 探针SRGAP2-Probe
<400> 14
tgcaaatgct ctgtggactg gtga 24
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物Qhomo2-F
<400> 15
gtgggtggga agagggaagc 20
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物Qhomo2-R
<400> 16
actcggcatt cacacatttc tcag 24
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 探针Qhomo2-Probe
<400> 17
cagcagtggc gtgtgggaac ctg 23
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物Alu-F
<400> 18
gtcaggagat cgagaccatc ct 22
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_structure
<223> 下游引物Alu -R
<400> 19
agtggcgcaa tctcggc 17
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 探针Alu -Probe
<400> 20
agctactcgg gaggctgagg cagga 25
Claims (13)
1.一种检测DNA序列的试剂在制备用于在混有人类与非人类动物组织样本中区分人类和非人类动物DNA的试剂或试剂盒中的用途,其中所述DNA序列选自如SEQ ID NO:1所示序列或其片段、与SEQ ID NO:1的反向互补序列或其片段组成的组,
其中所述检测DNA序列的试剂选自通过PCR技术扩增所述DNA序列所需的引物和探针,其中所述探针的序列如SEQ ID NO:10所示,其中所述引物的序列选自由如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列;如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5所示的序列;如SEQ ID NO:4和SEQID NO:3所示的序列;如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的序列;和如SEQ ID NO:4和SEQID NO:7所示的序列组成的组。
2.如权利要求1所述的用途,其中所述探针上带有检测标记,所述检测标记选自由FAM、TET、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine 6G、TMR、TMRITC、x-rhodamine、Texas red、生物素、和亲和素所组成的组。
3.如权利要求1或2所述的用途,其中所述非人类动物选自由恒河猴、绿猴、食蟹猴、大鼠、小鼠、兔组成的组。
4.如权利要求1或2所述的用途,其中所述混合人类与非人类动物组织为非人类动物的组织及血液样本中混合了人源DNA,所述人源DNA来源于人源细胞,所述非人类动物为恒河猴。
5.如权利要求4所述的用途,其中所述人源细胞为人源视网膜色素上皮细胞。
6.一种组合物,包含引物和探针,其中所述探针的序列如SEQ ID NO:10所示,其中所述引物的序列选自由如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列;如SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:5所示的序列;如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:3所示的序列;如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的序列;和如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示的序列组成的组。
7.如权利要求6所述的组合物,其中所述探针上带有检测标记,所述检测标记选自由FAM、TET、Alexa 488、Alexa 532、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine 6G、TMR、TMRITC、x-rhodamine、Texas red、生物素、和亲和素所组成的组。
8.一种试剂盒,包含如权利要求6或7所述的组合物。
9.一种非诊断治疗目的在混合人类与非人类动物组织中区分人类和非人类动物DNA序列的方法,其中使用如权利要求6或7所述的组合物或如权利要求8所述的试剂盒对混合了人类和非人类动物组织的样本进行DNA的PCR扩增。
10.如权利要求9所述的方法,其步骤具体包括:
1)使用组合及细胞DNA提取试剂盒对混合了人类和非人类动物组织的样本进行DNA提取;
2)使用如权利要求6或7所述的组合物或如权利要求8所述的试剂盒中所述的引物和探针进行Taqman qPCR扩增;
3)收集荧光信号,计算循环阈值CT值,计算样本中人类DNA的浓度。
11.如权利要求9或10所述的方法,其中所述非人类动物选自由恒河猴、绿猴、食蟹猴、大鼠、小鼠、兔组成的组。
12.如权利要求9或10所述的方法,其中所述混合人类与非人类动物组织为非人类动物的组织及血液样本中混合了人源DNA,所述人源DNA来源于人源细胞,所述非人类动物为恒河猴。
13.如权利要求12所述的方法,其中人源细胞为人源视网膜色素上皮细胞。
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Families Citing this family (3)
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CN116103379A (zh) * | 2023-01-18 | 2023-05-12 | 广东医科大学附属医院 | 一种动物体内人源细胞的检测方法及用途 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107960107A (zh) * | 2015-06-15 | 2018-04-24 | 默多克儿童研究所 | 测量嵌合状态的方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7537889B2 (en) * | 2003-09-30 | 2009-05-26 | Life Genetics Lab, Llc. | Assay for quantitation of human DNA using Alu elements |
CN101988123A (zh) * | 2010-08-24 | 2011-03-23 | 中国医学科学院医学实验动物研究所 | 人源细胞的人线粒体dna特异片段扩增检测法 |
WO2018101375A1 (ja) * | 2016-11-30 | 2018-06-07 | 国立大学法人秋田大学 | ヒトゲノムdna検出方法 |
CN108384842B (zh) * | 2018-02-27 | 2021-04-27 | 宁波海尔施基因科技有限公司 | 一种对疑是人源的未知生物样本进行物种及人源个体识别鉴定的复合pcr扩增方法 |
CN110218770B (zh) * | 2019-06-03 | 2023-09-12 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 特异性检测人源性基因组dna引物及其应用 |
US20230279504A1 (en) * | 2019-12-30 | 2023-09-07 | Eyecure Therapeutics, Inc. (Jiangsu) | A fluorescent quantitative PCR technology-based method for distinguishing human DNA |
-
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107960107A (zh) * | 2015-06-15 | 2018-04-24 | 默多克儿童研究所 | 测量嵌合状态的方法 |
Also Published As
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