CN101988123A - 人源细胞的人线粒体dna特异片段扩增检测法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，特别是涉及人类线粒体DNA特异性片段扩增技术在人源细胞检测中的应用。所述人类线粒体DNA特异片段PCR扩增技术在人源细胞DNA检测中具有良好的特异性，该方法的灵敏度比常用人类基因组Alu基因序列特异性引物PCR扩增的灵敏度要高，且操作简便、节约时间、费用低廉，能够满足常规嵌合体基因型检测的需要，因此，人mtDNA特异性保守序列PCR扩增是一种理想的人源细胞检测方法。

Description

人源细胞的人线粒体DNA特异片段扩增检测法

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别是涉及人线粒体DNA特异片段扩增技术在人源细胞检测中的应用。

背景技术

近年来，病毒性肝炎、艾滋病等疾病严重威胁人类的健康与生命安全，对这些疾病的致病机制研究迫切需要合适的动物模型，但许多感染人类的病毒无法感染小鼠或其他实验动物，并且由于人类和动物免疫系统的差异，许多对动物有效的药物在临床研究中缺没有显著功效。因此，人源化动物是感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤生物学和再生医学的临床前动物模型，对生物医学研究具有重要意义。但人源化嵌合体动物研究的发展需要一种简便易行、且灵敏度较高的人源化细胞基因检测技术。

由于人类Alu基因序列的高度物种特异性和可重复性，Alu基因特异性引物被许多研究者用于混合物种样本中人DNA的鉴定，也是目前人源化细胞检测中最灵敏的方法。如McKenzie等首次用³²P标记Alu探针检测人鼠混合样本中的人DNA的存在。Zubair等采用Alu引物分析注射人淋巴癌细胞的小鼠组织中的人源化细胞数，但只有当每μg小鼠DNA中的人DNA量达到1-10ng水平时才能检测。Kim等的方法能够检测出2×10⁶鸡细胞中的一个人类细胞，但反应体系中采用了³²P标记dCTP，且在电泳后还需要对PCR条带进行密度扫描。Schneider等以Alu基因为模板进行定量PCR，能够检测中1×10⁶个小鼠细胞中的一个人类细胞，该方法在检测技术上有了显著改进，但由于费用较昂贵，且需要LightCycler实时定量PCR系统，尚不能满足常规嵌合体基因型检测的需要。

动物线粒体DNA(Mitochondria DNA，mtDNA)是一种共价闭合、环状双链DNA分子，线粒体DNA为多拷贝基因，每个细胞器含有数个到上千个不等的线粒体，而每个线粒体可含有数个到数十个不等的线粒体DNA分子，人类细胞中的线粒体DNA基因组可以高达一万个。因此，本发明利用mtDNA的高拷贝特性和种属特异序列(相对于啮齿类)检测人类mtDNA特异性保守序列PCR扩增作为人源化动物模型中人类DNA检测方法，具有比已有方法灵敏度高和特异性强的特点。

发明内容

1、要解决的技术问题：

本发明的主要目的在于提供一种高灵敏度和特异性的人源细胞检测方法。

2、技术方案：

(1)人类特异性mtDNA序列和PCR引物

利用DNAMAN序列分析软件，对人类mtDNA(GI：17981852)和小鼠mtDNA(GI：118200767)的序列进行比对，发现下列对应片段的序列同源性仅为35％，且通过NCBI blast分析表明该人类mtDNA片段在小鼠基因组中无同源序列。

人类线粒体DNA(GI：17981852)的特异性序列：

  1gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt

 61cgtctggggg gtgtgcacgc gatagcattg cgagacgctg gagccggagc accctatgtc

121gcagtatctg tctttgattc ctgcctcatt ctattattta tcgcacctac gttcaatatt

181acaggcgaac atacctacta aagtgtgtta attaattaat gcttgtagga cataataata

241acaattgaat gtctgcacag ccgctttcca cacagacatc ataacaaaaa atttccacca

301aacccccccc tccccccgct tctggccaca gcacttaaac acatctctgc caaaccccaa

361aaacaaagaa ccctaacacc agcctaacca gatttcaaat tttatcttta ggcggtatgc

421acttttaaca gtcacccccc aactaacaca ttattttccc ctcccactcc catactacta

481atctcatcaa

小鼠线粒体DNA(GI：118200767)的对应序列：

  1gttaatgtag cttaataaca aagcaaagca ctgaaaatgc ttagatggat aattgtatcc

 61cataaacaca aaggtttggt cctggcctta taattaatta gaggtaaaat tacacatgca

121aacctccata gaccggtgta aaatccctta aacatttact taaaatttaa ggagagggta

181tcaagcacat taaaatagct taagacacct tgcctagcca cacccccacg ggactcagca

241gtgataaata ttaagcaata aacgaaagtt tgactaagtt atacctctta gggttggtaa

301atttcgtgcc agccaccgcg gtcatacgat taacccaaac taattatctt cggcgtaaaa

361cgtgtcaact ataaataaat aaatagaatt aaaatccaac ttatatgtga aaattcattg

421ttaggaccta aactcaataa cgaaagtaat tctagtcatt tataatacac gacagctaag

481acccaaactg

本发明针对这段特异性序列设计了人线粒体DNA特异性引物。引物序列：

hmtDNA-FP：5′CAC CCTATTAAC CAC TCA CG 3′；

hmtDNA-RP：5′ATG TCTGTG TGGAAAGCG 3′。

扩增产物大小为264bp。

同时针对小鼠与人类线粒体DNA同源序列设计了一对通用引物作为内参对照引物。引物序列如下：

mtDNA-FP：5′GGA TTA GATACC CCA CTA TGC3′；

mtDNA-RP：5′GCT ACA CCT TGA CCTAAC GT3′。

PCR产物大小为268/273bp(人/小鼠)。

具体实施方式

以下结合具体实施对本发明的应用做进一步说明，但不作为对本发明的限定：

例1.对人鼠混合DNA样本具有特异性

在小鼠DNA中分别添加0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％和10％的人DNA样本时，分别采用人线粒体DNA特异性引物和人鼠线粒体DNA通用引物对梯度稀释的人DNA进行PCR扩增，结果表明PCR产物电泳条带的亮度随样本中人DNA含量的增加而增加，当混合样本中的人DNA量为0.01％时也能够检测到清晰而特异性的PCR产物电泳条带。

例2.比Alu序列检测灵敏性高

根据文献合成人类Alu基因特异性引物hAlu-FP：5′-CTG GGC GAC AGA ACG AGA TTC TAT-3′；hAlu-RP：5′-CTC ACT ACT TGG TGA CAG GT TCA-3′，PCR产物大小224bp。同时采用hmtDNA特异性引物和hAlu引物对嵌合小鼠DNA进行PCR扩增，结果表明hmtDNA引物PCR扩增的电泳条带亮度极显著高于hAlu引物的PCR扩增电泳条带。

例3.可检测低嵌合率的人源化小鼠

经EasySep负选人造血干祖细胞试剂盒分选获得人造血干祖细胞，囊胚显微注射法，将显微注射后重新扩张的囊胚移植到假孕2.5d子宫中，获得人造血干细胞嵌合体小鼠。分别提取出生1w、2w、4w和8w的小鼠鼠尾DNA，用hmtDNA特异性引物进行PCR扩增，在110只小鼠中检测到25只嵌合体阳性小鼠，阳性率为23％。

参考文献

[1]McKenzie BA，Barrieux A，Varki NM.A novel detection system for submicroscopic human metastasis in athymic mice[J].Cancer Commun，1991，3(1)：15-19.

[2]Zubair AC，Ali SA，Rees RC et al.Investigation of the effect of BB-94(batimastat)on the colonization potential of human lymphoma cells in SCID mice[J].Cancer Lett，1996，107(1)：91-95.

[3]Kim J，Yu W，Kovalski K et al.Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by anovel semiquantitative PCR-based assay[J].Cell，1998，94(3)：353-362.

[4]Schneider T，Osl F，Friess T，et al.Quantification of human Alu sequences by real-time PCR-an improved method to measure therapeutic efficacy of anti-metastatic drugs in human xenotransplants[J].Clin ExpMetastasis，2002，19：571-582.

Claims (2)

1.以人类线粒体DNA特异性片段为引物进行聚合酶链式反应作为人源细胞DNA检测方法的应用。

2.根据权利要求1所述人类线粒体DNA特异性片段聚合酶链式反应在人源细胞DNA检测方法的应用，其特征在于引物序列不仅包括本方法中所述片段，也包括本方法所述人类线粒体DNA特异性片段内的其他引物序列。