CN105648095A - 人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒及其制备和应用 - Google Patents

人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒及其制备和应用。本发明所述试剂盒中包括炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，所述试剂盒检测灵敏度高，最低检出限为1×103copy/ml，准确率及阳性率均高达100%。

Description

人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒及其制备和应用
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒及其制备和应用。
背景技术
炭疽杆菌(Bacillusanthraci)属于芽孢杆菌属，是人畜共患急性传染病炭疽的病原体。人和动物通过直接或间接接触炭疽杆菌引起皮肤、肺或肠道感染，常并发败血症。牛羊的发病率最高，人常因屠宰、食用或与病死畜接触而感染。炭疽杆菌具有很强的致病性、传染性和生存能力，是高致病性病原微生物，而且能够以芽孢形式长期保持生命力，一度是制造最具有杀伤力的生物武器的病原体，对社会公共卫生和经济发展的危害巨大。
炭疽杆菌的传统检测方法通常包括染色镜检、分离培养、免疫学诊断、生理生化试验等。其中广泛使用的是免疫学诊断方法，但抗原和抗体的非特异性结合会导致免疫学检测结果的假阳性率较高而检测灵敏度较低。分离培养鉴定的结果准确性好，但实验过程繁琐，检测周期较长，不能适应现代公共卫生机构快速反应体系的需要。随着分子生物学技术的发展，基于聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)原理的检测技术，针对炭疽杆菌特异基因进行扩增和检测，数小时内即可获得检测结果，而且在检测的特异性和灵敏度上均有较大提高，因而受到许多研究者的青睐。普通的PCR法检测方法每次只能检测一个基因，效率较低；用凝胶电泳对扩增产物进行分析时，容易造成污染。多重荧光PCR方法可在一次反应中检测多个基因，节约了时间和成本；用仪器来识别荧光信号，提高了检测灵敏度，减少了人工误差；在扩增反应过程中对荧光信号进行实时检测，全程封闭进行，大大降低了样本间交叉污染的风险。
线粒体DNA是一种共价闭合环状DNA分子。在高等哺乳动物的单个细胞中，线粒体DNA分子的数量在数百乃至上万个。线粒体基因遗传稳定，进化速度快，不同物种间差异显著，常用作分子进化和系统发生学的遗传标记。根据人特异性的线粒体DNA保守区域设计引物进行PCR扩增，可以检测人源细胞的存在。由于线粒体基因的高拷贝特性，此方法具有很高的灵敏度，可以在复杂样本中检测出含量极少的人源细胞。
发明内容
针对传统检测手段中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒及其制备和应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒，所述试剂盒中包括炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，所述炭疽杆菌基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物，炭疽杆菌基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述人线粒体基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的下游引物，所述人线粒体基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述炭疽杆菌基因检测探针和人线粒体基因检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
优选地，所述炭疽杆菌基因检测探针和人线粒体基因检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
进一步优选地，所述炭疽杆菌基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
进一步优选地，所述人线粒体基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为CY5荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-3。
本发明的试剂盒采用多重荧光PCR技术在单管中同时进行炭疽杆菌基因、人线粒体基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断炭疽杆菌感染情况。因此，引物及探针的设计是本发明试剂盒的关键。
基于本发明所述试剂盒是采用多重荧光PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、无菌水(ddH2O)等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。
所述PCR反应体系中，引物、探针、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、无菌水(ddH2O)均为常见组分，其含量亦为常规。
所述PCR反应体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物及探针的通用PCR反应液加入引物及探针获得。例如，所述试剂盒中还可以含有dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、无菌水(ddH2O)。加入本发明的引物及探针、待检样本即可获得PCR反应体系。
所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有炭疽杆菌特异性扩增片段的质粒或含有人线粒体基因特异性扩增片段的质粒。
优选地，炭疽杆菌特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。
优选地，人线粒体基因特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。
所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为PCR反应缓冲液、无菌水(ddH2O)、生理盐水等。
本发明的第二方面，提供了前述人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)提取样品基因组DNA；
(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针；
(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
(4)PCR反应结束后，分析结果。
步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。
优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)94℃2min；(b)94℃2min；(c)93℃5sec；(d)60℃30sec；步骤(c)-(d)循环40次。
本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备炭疽杆菌检测产品中的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用多重荧光PCR法，设计了炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，可以在单个PCR反应管中同时检测2个基因，能够准确地检测炭疽杆菌的存在以及毒力强弱，缩短了实验周期，提高了检测效率，为及时检测并诊断炭疽杆菌感染情况提供了有力工具。
本发明所采用的荧光PCR检测方法灵敏度高，最低检出限为1×103copy/ml，所用引物和探针均基于GenBank公共数据库中序列设计，特异性好；操作简便，无需对PCR产物进行额外处理。PCR扩增和荧光检测在同一反应管中进行，全程处于封闭状态，大大降低了样本间交叉污染和环境污染的风险。可直接对各种样本进行检测，无需富集培养。
附图说明
图1：不同浓度的待检阳性对照样品PA-1～PA-5(1～5)在荧光检测过程中均为阳性，表明试剂盒检测目标基因的灵敏度最高能达到1×103copy/ml。
图2：不同浓度的待检阳性对照样品MT-1～MT-5(6～10)在荧光检测过程中均为阳性，阴性对照组11的检测结果为阴性，表明试剂盒检测目标基因的灵敏度最高能达到1×103copy/ml。
图3：各样本的扩增曲线。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1试剂盒的制备
分别合成炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，其核苷酸序列如下表1所示：
表1
上述各组引物对及探针可单独包装，也可以组合配成多重荧光PCR检测混合液。所述多重荧光PCR检测混合液中，上述各引物及探针的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。
也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的各组引物对及探针，也可以是含有配置好的含有各组引物对及探针的多重荧光PCR检测混合液。
进一步地，所述试剂盒还可以含有dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、无菌水(ddH2O)、样品基因组DNA提取试剂等试剂。
采用本发明试剂盒进行检测时，质量控制标准如下：
检测结果分析参照如下：
实施例2试剂盒的灵敏度评价
实验目的：确定本发明(实施例1)多重荧光PCR试剂盒的检出限(最低检测浓度)
实验方法：
1.阳性对照品的准备：
构建含有炭疽杆菌特异性扩增片段的炭疽杆菌pagA质粒作为阳性对照品。炭疽杆菌pagA质粒的构建方法包括步骤：
采用PCR法对炭疽杆菌样本的DNA进行扩增，引物序列如SEQIDNO.1-2所示，获得目的区域的核酸片段；将扩增获得的片段纯化后，以TA克隆的方法连接至pGEM-T载体上；经测序鉴定，连接成功的重组T载体转化DH5-α细胞，扩增，获得炭疽杆菌pagA质粒。
其中，炭疽杆菌特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQIDNO.7所述，具体为：
GCAACTAACATATATACTGTATTAGATAAAATCAAATTAAATGCAAAAATGAATATTTTAATAAGAGATAAACGTTTTCATTATGATAGAAATAACATAGCAGTTGGGGCGGATGAGTCAGTAGTTAAGGAGGCTCATAGAGAAGTAATTAATTCGTC。
构建含有人线粒体基因特异性扩增片段的人线粒体基因质粒作为阳性对照品。人线粒体基因质粒的构建方法包括步骤：
采用PCR法对人DNA样本进行扩增，引物序列如SEQIDNO.4-5所示，获得目的区域的核酸片段；将扩增获得的片段纯化后，以TA克隆的方法连接至pGEM-T载体上；经测序鉴定，连接成功的重组T载体转化DH5-α细胞，扩增，获得人线粒体基因质粒。
其中，人线粒体基因特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，具体为：
CACCCTATTAACCACTCACGGGAGCTCTCCATGCATTTGGTATTTTCGTCTGGGGGGTGTGCACGCGATAGCATTGCGAGACGCTGGAGCCGGAGCACCCTATGTCGCAGTATCTGTCTTTGATTCCTGCCTCATCCTATTATTTATCGCACCTACGTTCAATATTACAGGCGAACATACTTACTAAAGTGTGTTAATTAATTAATGCTTGTAGGACATAATAATAACAATTGATGTCTGCACAGCCGCTTTCCACACAGACAT。
取1×107copy/ml的炭疽杆菌pagA质粒作为阳性对照品，分为5份，分别按1：1、1：10、1：100、1：1000、1：10000的比例用ddH2O做梯度稀释，最终获得待检阳性对照样品PA-1、PA-2、PA-3、PA-4、PA-5，浓度分别为1×107copy/ml、1×106copy/ml、1×105copy/ml、1×104copy/ml、1×103copy/ml。
2.PCR扩增反应
同样的，取人线粒体基因质粒作为阳性对照品，分为5份，分别按1：1、1：10、1：100、1：1000、1：10000的比例用ddH2O做梯度稀释，最终获得待检阳性对照样品MT-1、MT-2、MT-3、MT-4、MT-5，浓度分别为1×107copy/ml、1×106copy/ml、1×105copy/ml、1×104copy/ml、1×103copy/ml。
首先，配置多重荧光PCR检测混合液，具体组成成分及含量可如下表2所示：
表2
成分 含量
PCR buffer(10×) 2.5ul
MgCl2(25mM) 2.5ul
两种引物(20uM) 0.5ul(×4)
四种探针(20uM) 0.2ul(×2)
dNTP(10mM each) 0.8ul
ddH2O 补足至18ul
总计 18ul
然后，配制PCR反应体系，如下表3所示：
表3
此次灵敏度检测共设5个浓度梯度，对应上述待检阳性对照样品PA-1、PA-2、PA-3、PA-4、PA-5、MT-1、MT-2、MT-3、MT-4、MT-5，加阴性对照(ddH2O)一管，共进行11个PCR反应。配置过程中在一总管中加入多重荧光PCR检测混合液11×18ul，TaqDNA聚合酶+UNG酶11×0.4ul，ddH2O11×2.6ul，振荡混匀并瞬时离心后取混合液21ul分置于11个PCR反应管中。然后向1～5号管中分别加入4ul浓度依次为浓度分别为1×107copy/ml、1×106copy/ml、1×105copy/ml、1×104copy/ml、1×103copy/ml的待检阳性对照样品PA-1、PA-2、PA-3、PA-4、PA-5，再向6～10号管中分别加入4ul浓度依次为浓度分别为1×107copy/ml、1×106copy/ml、1×105copy/ml、1×104copy/ml、1×103copy/ml的待检阳性对照样品MT-1、MT-2、MT-3、MT-4、MT-5，最后向11号管中加入4ulddH2O作为阴性对照。
3.PCR反应
此次PCR反应在SLAN-965Real-Time荧光PCR仪上进行，按说明书中推荐的参数将反应条件设置为：
步骤(3)-(4)循环40次。
4.结果分析
不同浓度待检阳性对照样品炭疽杆菌pagA质粒检测结果如图1所示。
各样品的CT值如下表4所示：
表4
反应管号 样品 浓度 CT值 结果
1 PA-1 1×107copy/ml 22.01 阳性
2 PA-2 1×106copy/ml 25.15 阳性
3 PA-3 1×105copy/ml 28.89 阳性
4 PA-4 1×104copy/ml 32.03 阳性
5 PA-5 1×103copy/ml 37.09 阳性
该实验结果表明：不同浓度的待检阳性对照样品PA-1～PA-5在荧光检测过程中均为阳性，表明试剂盒检测目标基因的灵敏度最高能达到1×103copy/ml。线性检测范围在1×104copy/ml～1×108copy/ml。
不同浓度待检阳性对照样品人线粒体基因质粒检测结果如图2所示。
各样品的CT值如下表5所示：
表5
反应管号 样品 浓度 CT值 结果
6 MT-1 1×107copy/ml 21.79 阳性
7 MT-2 1×106copy/ml 24.62 阳性
8 MT-3 1×105copy/ml 28.66 阳性
9 MT-4 1×104copy/ml 31.82 阳性
10 MT-5 1×103copy/ml 34.96 阳性
11 ddH2O -- No Ct 阴性
该实验结果表明：不同浓度的待检阳性对照样品MT-1～MT-5在荧光检测过程中均为阳性，表明试剂盒检测目标基因的灵敏度最高能达到1×103copy/ml。线性检测范围在1×104copy/ml～1×108copy/ml。
实施例3试剂盒检测效果评价
实验方法：
1.样本处理：
所用样本包括：购买的炭疽杆菌Ⅱ号菌株(疫苗株)，炭疽病牛组织样本，健康人血清样本。
上述组织和血清样本按一下方法进行DNA提取，具体为：
所购买菌株的DNA提取方法按常规实验室提取细菌DNA的方法进行，具体为：细菌用0.5ml生理盐水重悬，悬液经沸水浴20min后13000rpm离心15min，取上清用于PCR反应。记为1号样品。
组织样本预先剪碎，放入含有0.5ml生理盐水的离心管中，振荡混匀，13000rpm离心2min；去尽上清，沉淀中直接加入100ul试剂盒中提供的核酸提取液，沸水浴10min；13000rpm离心5min，取上清用于PCR反应。记为2号样本。
健康人血清样本直接取50ul加入50ul试剂盒中提供的核酸提取液，充分混匀，沸水浴10min；13000rpm离心5min，取上清用于PCR反应。记为3号样本。
2.配制PCR反应体系，如下表6所示：
表6
此次选取不同类型的样本共3个，加阴性对照/阳性对照反应各一，共需进行6管PCR反应。配置过程中在一总管中加入多重荧光PCR检测混合液6×18ul，TaqDNA聚合酶+UNG酶6×0.4ul，ddH2O6×2.6ul，振荡混匀并瞬时离心后取混合液21ul分置于6个PCR反应管中，最后向1～3号反应管中分别加入4ul1～3号样品，4号管中加入4ul1×107copy/ml阳性对照样品炭疽杆菌pagA质粒，5号管中加入4ul1×107copy/ml阳性对照样品人线粒体基因质粒，6号反应管中加入4ulddH2O作为阴性对照。加样完成后迅速盖好管盖，进行PCR扩增反应。
3.PCR扩增
此次PCR反应在SLAN-965Real-Time荧光PCR仪上进行，按上述推荐的参数将反应条件设置为：
步骤(3)-(4)循环40次。
阈值设定原则为：阈值线刚好超过阴性对照(ddH2O)的最高点。
4.结果分析：
各样本的扩增曲线如图3所示。
实验结果如下表7所示：
表7
实验结果表明，样品1,2检测结果为炭疽杆菌阳性，人线粒体基因阴性；样本3检测结果为炭疽杆菌阴性，人线粒体基因阳性；阳性对照品扩增正常，阴性对照品无荧光信号，说明此次实验扩增效果正常，无污染。所有阳性结果均经过Sanger测序法验证无误，可见本试剂盒的检测结果具有很好的特异性和准确度。本发明提供的试剂盒检测结果稳定可靠，阳性率及正确率高达100％，可以用于样本的直接检测。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒，所述试剂盒中包括炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，所述炭疽杆菌基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物，炭疽杆菌基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述人线粒体基因检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的下游引物，所述人线粒体基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述炭疽杆菌基因检测探针和人线粒体基因检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述炭疽杆菌基因检测探针和人线粒体基因检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述炭疽杆菌基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述人线粒体基因检测探针5’端标记的荧光报告基团为CY5荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-3。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、无菌水中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性对照或阴性对照中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有炭疽杆菌特异性扩增片段的质粒或含有人线粒体基因特异性扩增片段的质粒。
8.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，阴性对照为PCR反应缓冲液、无菌水或生理盐水。
9.如权利要求1～8任一权利要求所述的检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)提取样品基因组DNA；
(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有如权利要求1～4任一权利要求中PCR检测引物及探针；
(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
(4)PCR反应结束后，分析结果。
10.如权利要求1～8任一权利要求所述的检测试剂盒在制备炭疽杆菌检测产品中的用途。
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