CN105821160A

CN105821160A - 一种猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN105821160A
Application number: CN201610254481.8A
Authority: CN
Inventors: 张宁; 卢冰霞; 刘磊; 何颖; 秦毅斌; 郭旋; 蓝常力; 赵武; 李斌; 段群棚; 周英宁; 梁家幸; 杨思仪; 蒋冬福; 苏乾莲
Original assignee: Guangxi State Farms Yongxin Animal Husbandry Group Co Ltd; Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi State Farms Yongxin Animal Husbandry Group Co Ltd; Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2016-04-22
Filing date: 2016-04-22
Publication date: 2016-08-03

Abstract

本发明公开了一种猪嵴病毒的可视化逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括RT‑LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪嵴病毒RNA模板；所述的RT‑LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB，其应用包括使用该试剂盒检测猪嵴病毒病变组织和带毒粪便。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的逆转录环介导等温扩增试剂盒可实时监测反应并且定量检测出猪嵴病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪嵴病毒带来便利。

Description

一种猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪嵴病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用。

背景技术

猪嵴病毒（Kobuvirus,Kobu）为单股正链RNA病毒，属于微RNA病毒科嵴病毒属，病毒颗粒直径约30nm，呈20面体对称，无嚢膜。1998年在日本爱知（Aichi）县肠胃炎病人粪便标本中发现一种新型RNA病毒，根据发现地点命名为爱知病毒（Aichi virus），1997年通过基因分析，证实爱知病毒是一种新型的微RNA病毒。因病毒粒子电镜下崎岖不平呈嵴状，命名为嵴病毒。目前，嵴病毒已经在牛、猪和绵羊3种动物和人体内被发现，另外在蝙蝠体内也检测出类似嵴病毒的病毒。嵴病毒已经被证实与人的腹泻疾病相关，并且在不同人群中广泛流行。自2008年匈牙利Pankovic博士在利用RT-PCR方法检测10日龄仔猪腹泻样品中否存在诺瓦克病毒（Norovirus）感染时，扩增出猪嵴病毒，此后，猪嵴病毒在匈牙利、中国、泰国、日本和韩国等国家相继被报道。有资料表明，2010～2011年，我国不同省份猪嵴病毒阳性率高达82.9%，表明我国猪群中存在嵴病毒感染，并且感染率较高，可能与猪腹泻疾病的诱发有关。

对猪嵴病毒的快速准确诊断，可以进一步研究猪嵴病毒是否猪群肠道疾病的继发或诱导因素，及之与人类腹泻疾病之间的相关性。目前实验室诊断PKV的方法主要为普通RT-PCR和实时荧光定量PCR，虽然PCR方法较准确，但需要昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，用时也较长，不适合基层和现场检测。

发明内容

本发明的目的是为了解决基层检测猪嵴病毒困难、耗时长和仪器昂贵等问题，提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪嵴病毒的试剂盒，为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪嵴病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）、内引物FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）和环引物LF（SEQ ID NO：5）与LB（SEQ ID NO：6）；

其中：

F3 ACATCGCGATCTCCGTCG

B3 CTGCTGGATCATCCGTGATG

FIP CGCAGGTAAACAGGAGGGCC GCTACCACCCCTATCCCAC

BIP ACCTCCCCGGTGTTGTGGAA GTGCACCACAGAGACCCT

LF AGAGAGAGTGGAAATAAGATGTCCA

LB AACCTACAGCTTATGGTTACAAAGC；

所述的2×反应缓冲液是Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

以上所述的猪嵴病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪嵴病毒的RNA。

以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

以上所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL 35-50mM、KCL 15-35mM、MgSO₄ 15-20mM、(NH₄)₂SO₄ 15-25mM、Tween20 0.4-0.8℅、Betaine 1.5-3.0M 和dNTPs 2.5-4mM，其配制方法在pH为8.7条件下，将上述溶剂混合均匀获得。

一种猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于兽医临床上检测疑似猪嵴病毒病变组织、猪粪便排泄物或培养物中是否含有猪嵴病毒，具体检测步骤包括：

（1）RT-LAMP引物的设计与合成

（2）猪嵴病毒RNA模板的提取

（3）RT-LAMP反应体系建立

（4）RT-LAMP检测方法。

以上所述的RT-LAMP反应体系建立以25μL计，

2×反应缓冲液 12.5μL

EM 1μL

FIP 40 pmol

BIP 40 pmol

LF 20 pmol

LB 20 pmol

F3 5 pmol

B3 5 pmol

猪嵴病毒RNA 5μL

超纯水补足25μL。

以上所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。

以上所述的RT-LAMP检测方法采用Loopamp LA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应温度为63℃、反应在20-30分钟间出现扩增。

本发明的实质性特点和进步是：

1）特异性强

本发明的RT-LAMP检测试剂盒特异性检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。

2）灵敏度高

普通PCR检测方法的灵敏度为9.38×10^-8ng/μL，而使用本发明的RT-LAMP检测方法，检测限约为9.38×10^-9ng/μL，是普通PCR的10倍。

3）迅速获得结果

普通的RT-PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的RT-LAMP反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组RNA提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的RT-LAMP检测方法反应在23 分钟左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进行比较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管底部有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性反应管在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从基因组RNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。

4）不造成污染

目前RT-LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料（非syber-green），检测过程不需要开盖。此外，本发明的RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。

5）可实时定量

本发明利用Tubidimeter real-time LA-320 浊度仪来实时分析RT-LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪嵴病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。

附图说明

图1是本发明的RT-LAMP方法特异性检测结果，其中1：猪嵴病毒；2：猪蓝耳病病毒；3：猪圆环病毒2型；4：猪瘟病毒；5：猪轮状病毒；6：流行性腹泻病毒；7：传染性胃肠炎病毒；8：猪伪狂犬病毒；9：空白对照（水）。猪嵴病毒反应管出现浊度的上升曲线，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增。

图2和图3是分别使用本发明RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法进行的猪嵴病毒敏感性检测的结果。其中1：9.38×10¹ ng/μL；2：9.38 ng/μL；3：9.38×10^-1ng/μL； 4：9.38×10^- ²ng/μL；5：9.38×10^-3ng/μL；6：9.38×10^-4ng/μL；7：9.38×10^-5ng/μL；8：9.38×10^-6ng/μL；9：9.38×10^-7ng/μL；10：9.38×10^-8ng/μL；11：9.38×10^-9ng/μL；12：水（空白对照）。猪嵴病毒基因组RNA的起始浓度为9.38×10¹ ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和PCR扩增，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为9.38×10^-9 ng/μL，而普通PCR方法检测限约为9.38×10^-8ng/μL。

图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪嵴病毒基因组RNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。

图5是本发明猪嵴病毒定量标准曲线：利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪嵴病毒拷贝数。

具体实施方式

1、材料的准备

猪嵴病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪轮状病毒、流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和猪伪狂犬病毒，均为市售疫苗。RT-LAMP RNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号LMP204；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548。

2 、RT-LAMP引物的设计与合成

根据GenBank 中的猪嵴病毒3D基因序列，利用RT-LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorer V4 软件设计一套RT-LAMP引物，其中F3、B3 为外引物，FIP、BIP 为内引物，LF和LB为环引物，其中

F3 ACATCGCGATCTCCGTCG

B3 CTGCTGGATCATCCGTGATG

FIP CGCAGGTAAACAGGAGGGCC GCTACCACCCCTATCCCAC

BIP ACCTCCCCGGTGTTGTGGAA GTGCACCACAGAGACCCT

LF AGAGAGAGTGGAAATAAGATGTCCA

LB AACCTACAGCTTATGGTTACAAAGC；

3、病毒基因组RNA提取

使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548）提取猪嵴病毒或疑似猪嵴病毒感染的病变组织和粪便的DNA/RNA，以及对照病毒的基因组DNA/RNA。

4、RT-LAMP反应体系建立

按照试剂盒说明书，按25μL体系配置：

2×反应缓冲液 12.5μL

EM 1μL

FIP 40 pmol

BIP 40 pmol

LF 20 pmol

LB 20 pmol

F3 5 pmol

B3 5 pmol

猪嵴病毒RNA 5μL

超纯水补足25μL。

RT-LAMP反应在以实时浊度仪( LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达到0.1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度以63℃做为反应温度。

5、RT-LAMP检测方法

1）特异性检测

使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取猪嵴病毒以及对照毒株-猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪轮状病毒、流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和猪伪狂犬病毒的基因组DNA/RNA，作为RT-LAMP反应的模板，同时以水作为空白对照，检验RT-LAMP方法的特异性。

2）敏感性检测

提取的猪嵴病毒基因组RNA，测定其浓度，用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释成11个稀释度，以各RNA稀释度作为模板，进行RT-LAMP扩增和PCR扩增，对比本发明的RT-LAMP方法和普通PCR方法对检测猪嵴病毒的敏感性。

3）荧光可视化检测

根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应30分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染实验室。

实施例1 RT-LAMP检测方法的特异性结果

对1株猪嵴病毒、7株对照病毒和水对照进行RT-LAMP扩增，结果如图1所示，猪嵴病毒反应管在23分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增情况出现，为阴性结果。

实施例2 RT-LAMP检测方法的敏感性结果

猪嵴病毒基因组RNA的起始浓度为9.38×10¹ ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和普通PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为9.38×10^-9ng/μL，而普通PCR 法检测限为9.38×10^-8ng/μL。

实施例3 RT-LAMP检测方法的荧光可视化检测结果

根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，63℃反应60分钟后，在紫外灯下观察，图4为观察结果，左管为以猪嵴病毒RNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照，为阴性结果。试验结果表明，建立的RT-LAMP方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合本方法设计的RT-LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63℃ 60分钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。

实施例4猪嵴病毒定量标准曲线的绘制

以猪嵴病毒RNA为模板，以本RT-LAMP方法设计的外引物F3和B3为PCR扩增引物，将PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒RNA，经测序确认后，作为标准样品，测定重组质粒pMD18-T-3D的起始浓度，用RNA-Free Water进行连续10倍倍比稀释11个稀释度，取各稀释度5μL作为模板进行RT-LAMP扩增。

设置对照：浓度为9.38×10¹ ng/μL、9.38 ng/μL、9.38×10^-1 ng/μL、9.38×10^-2ng/μL、9.38×10^-3ng/μL、9.38×10^-4ng/μL、9.38×10^-5 ng/μL、9.38×10^-6ng/μL 、9.38×10^-7 ng/μL、9.38×10^-8 ng/μL和9.38×10^-9ng/μL的标准重组质粒pMD18-T-3D样品各一个，因为浓度的负对数值与浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y = 0.3055x - 7.8446，如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R² = 0.9928，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10^-y，再乘以基数9.38，即为9.38 ×10^-yng/μL。依据拷贝数换算公式copies/μL =（6.02×10²³× (ng/μL × 10^-9)） / (RNA length × 660)，RNAlength为载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+218=2911 bp，将其换算成拷贝数（copies/μL）：6.02× 10²³ ×（9.38 ×10^-y × 10^-9）/ (2911×660)，简化为：2.94×10⁹×10^-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为30分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于1.324，则浓度为10^-1.324，再乘以基数9.38，即为该试验样品的浓度9.38×10^-1.324ng/μL，拷贝数为9.38×10⁹×10^-1.324，即为9.38 ×10^7.68 copies/μL，从而达到定量的效果。

表1样品浓度负对数值与PKV-LAMP浊度值时间线性关系表

时间（分）	23	27	28	31	36	38	49	52
									浓度负对数	-1	0	1	2	3	4	7	8

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120>一种猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用

<160> 6

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ACATCGCGATCTCCGTCG

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

CTGCTGGATCATCCGTGATG

<210> 3

<211>39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CGCAGGTAAACAGGAGGGCC GCTACCACCCCTATCCCAC

<210> 4

<211>38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ACCTCCCCGGTGTTGTGGAA GTGCACCACAGAGACCCT

<210>5

<211>25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

AGAGAGAGTGGAAATAAGATGTCCA

<210>6

<211>25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

AACCTACAGCTTATGGTTACAAAGC

Claims

1.一种猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，包括RT-LAMP引物，其引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）、内引物FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQID NO：4）和环引物LF（SEQ ID NO：5）与LB（SEQ ID NO：6）；引物的序列分别为：

F3 ACATCGCGATCTCCGTCG

B3 CTGCTGGATCATCCGTGATG

FIP CGCAGGTAAACAGGAGGGCC GCTACCACCCCTATCCCAC

BIP ACCTCCCCGGTGTTGTGGAA GTGCACCACAGAGACCCT

LF AGAGAGAGTGGAAATAAGATGTCCA

LB AACCTACAGCTTATGGTTACAAAGC。

2.根据权利要求1所述的猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪嵴病毒RNA模板；所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

3.根据权利要求2所述的猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

4.根据权利要求2所述的猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL 35-55mM、KCL 15-35mM、MgSO₄ 15-20mM、(NH₄)₂SO₄ 15-25mM、Tween20 0.4-0.8℅、Betaine 1.5-3.0M 和dNTPs 2.5-4mM。

5.根据权利要求2所述的猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，具体操作步骤包括：

（1）RT-LAMP引物的设计与合成

（2）猪嵴病毒RNA模板的提取

（3）RT-LAMP反应体系的建立

（4）RT-LAMP检测方法。

6.根据权利要求5所述的猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP反应体系建立以25μL计，

2×反应缓冲液 12.5μL

EM 1 μL

FIP 40 pmol

BIP 40 pmol

LF 20 pmol

LB 20 pmol

F3 5 pmol

B3 5 pmol

猪嵴病毒RNA 5μL

超纯水补足25μL。

7.根据权利要求5所述的猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。

8.根据权利要求5所述的猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。

9.根据权利要求5所述的猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP检测方法反应温度为63℃、反应时间在20-30分钟出现扩增。