CN108660192A

CN108660192A - 一种快速检测溶血性曼氏杆菌的lamp引物组及其应用

Info

Publication number: CN108660192A
Application number: CN201810543501.2A
Authority: CN
Inventors: 李军; 吴翠兰; 彭昊; 潘艳; 冯世文; 陶立; 李常挺; 钟舒红; 马春霞; 谢永平; 胡帅; 贺会利
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2018-10-16

Abstract

本发明公开了一种快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组及其应用，属于动物细菌学及分子生物学技术领域。所述LAMP引物组如SEQ ID NO：1~5所示；所述LAMP引物组用于制备检测溶血性曼氏杆菌的LAMP试剂盒，该试剂盒提供的LAMP检测方法具有高度的特异性和敏感性，重复性好，可信度高，特异性检测出溶血性曼氏杆菌的特异性核苷酸片段，并且可对溶血性曼氏杆菌拷贝数进行定量检测，快速准确的获得检测结果，为简便、快速地检测溶血性曼氏杆菌带来便利，本发明解决了传统鉴别方法分离率低，耗时费力等不足，适合基层使用，可作为溶血性曼氏杆菌实验室快速检测和流行病学调查的一种快速、准确、简便的检测工具。

Description

一种快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组及其应用

技术领域

本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速并且可实时定量检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组及其应用。

背景技术

溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica ）属于巴氏杆菌科，为革兰阴性的球杆菌，是存在于牛、绵羊、山羊等反刍动物以及其他多种动物上呼吸道的常在菌和机会致病菌。在某些诱发因素作用下，溶血性曼氏杆菌可导致上述动物引发致死性肺炎。病毒和支原体的感染使得机体溶血性曼氏杆菌更易感，如副流感病毒及绵羊肺炎支原体等。此外，环境骤变、运输等造成的机体应激以及动物整体健康状况降低均可以使这两种细菌引发呼吸道疾病或影响疾病的严重程度。目前，溶血性曼氏杆菌在全球范围内均有分布，给养牛业、养羊业造成了重大的经济损失。在临床上，溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌不仅可以单独感染，两者也可以继发感染或混合感染，且引起的呼吸道症状相似，这为采取针对性的防治措施带来困难。

目前，溶血性曼氏杆菌的检测技术主要有常规方法和分子生物学方法。常规方法是传统的病原分离鉴定，即通过对细菌的表型特征和生化指标进行鉴定，常规鉴定方法费时费力，此外，溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌在形态大小、染色特性等方面也很相似，从而为这两种细菌的准确鉴定造成不便。因此，建立一种可以快速、准确检测和鉴定溶血性曼氏杆菌的方法具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种快捷准确检测鉴别溶血性曼氏杆菌的方法，公开一种快速、实时定量检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组及其应用。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组，所述LAMP引物组由具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的内引物FIP和BIP、具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的外引物F3和B3、具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的环引物LB组成。

优选的，所述LAMP引物组是依据溶血性曼氏杆菌gcp基因进行设计。

优选的，所述LAMP引物组在制备检测溶血性曼氏杆菌试剂盒的应用。

本发明还提供一种快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP试剂盒，所述LAMP试剂盒包括SEQ ID 1~5所示的核苷酸序列。

优选的，所述LAMP试剂盒还包括以下组分：

（1）2×反应缓冲液：包含Buffer、dNTPs、Mg²⁺

（2）Bst DNA聚合酶

（3）超纯水

（4）阳性对照：溶血性曼氏杆菌DNA。

优选的，所述的引物组使用浓度为25 pmol/μL。

优选的，所述LAMP试剂盒的反应程序为63℃恒温保持60 min，扩增结束后85℃灭活5 min，反应在20-25 min出现扩增。

结果判定：

实时浊度仪实时监测反应扩增情况，仪器通过读取反应管的浊度值绘制浊度曲线，出现浊度上升曲线的为阳性结果，没有出现浊度上升曲线的为阴性结果。反应结束，即可获得结果，避免通过人为肉眼观察的主观判断失误。

本发明的实质性特点和显著进步是：

1）特异性强

所检测的阴性对照细菌和水对照均无阳性结果出来。

2）灵敏度高

利用本发明的溶血性曼氏杆菌LAMP扩增引物组建立的LAMP 检测方法具有高度敏感性，检测限约为0.855×10^-4ng/μL。

3）迅速得出结果

溶血性曼氏杆菌在血平板上需要20小时以上才长出明显菌落，生化试验通常耗时24-72小时，做出正确的鉴定将花费3-4天时间。本发明提供的LAMP检测方法反应在20-25分钟间出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且扩增结束即可判断结果，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析，从样品的基因组DNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。

4）准确性高

使用传统方法检测溶血性曼氏杆菌—体外分离培养，当样品的溶血性曼氏杆菌含量较低时，或者样品在保存运输不当时，会出现分离不到细菌的情况，因而做出该样品不存在溶血性曼氏杆菌的误判。

目前建立的大多数LAMP方法，在反应结束后打开反应管加入荧光染料进行显色反应，观察是否有显色来判读试验结果，或者通过跑电泳的方法进行结果判定，无法区分特异性扩增与非特异性扩增，因此增加了假阳性诊断结果的几率；而且对于弱阳性反应，通过人为肉眼判读的方式很可能误判为阴性。本方法通过浊度仪实时监控反应管的扩增情况，能够避免上述的缺陷，具有更高的准确性。

此外，利用本发明的溶血性曼氏杆菌LAMP扩增引物组建立的LAMP 检测方法具有高度敏感性，高灵敏度保证了在样品DNA含量极低的情况下，使用本发明溶血性曼氏杆菌的PCR扩增引物也可以扩增出目的DNA片段，检测结果更准确。

5）不造成污染

常规的LAMP方法在反应结束后通过凝胶电泳的方法来判读结果，或者开盖加入荧光染料进行判断，凝胶电泳使用的染料对环境也造成污染，且打开反应管容易造成实验室气溶胶污染。本方法通过浊度仪实时监控反应管的扩增情况，反应结束即可获得结果，不需要打开反应管的盖子，能有效避免气溶胶污染。

6）可实时定量

本发明利用Tubidimeter real-time LA-320 浊度仪来实时分析LAMP反应的结果，不同标准样品浓度的负对数及其对应的浊度值达到0.1所需的时间成线性关系，由此绘制标准曲线，获得标准曲线方程，即可进行定量检测。

附图说明

图1是本发明LAMP引物组的特异性检测结果，其中1：溶血性曼氏杆菌、2：隐秘杆菌、3：克雷伯氏菌、4：大肠杆菌、5：牛支原体、6：沙门氏菌、7：巴氏杆菌、8：水对照；结果显示，只有溶血性曼氏杆菌的反应管出现浊度的上升曲线，为阳性结果，6个对照菌反应管和水对照反应均无扩增，为阴性结果。

图2是本发明LAMP引物组的敏感性检测结果，其中1：0.855×10¹ng/μL；2：0.855×10⁰ng/μL；3：0.855×10^-1ng/μL；4：0.855×10^-2ng/μL；5：0.855×10^-3ng/μL；6：0.855×10^-4ng/μL；7：0.855×10^-5ng/μL。溶血性曼氏杆菌DNA的起始浓度为0.855×10¹ng/μL，经10倍倍比稀释后进行LAMP和PCR扩增，结果显示LAMP法检测限约为0.855×10^-4ng/μL。

图3是本发明定量检测溶血性曼氏杆菌LAMP方法的标准曲线：不同标准样品浓度的负对数及其对应的浊度值达到0.1所需的时间成线性关系，由此绘制标准曲线，获得标准曲线方程，即可进行定量检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、材料的准备

溶血性曼氏杆菌、隐秘杆菌、克雷伯氏菌、大肠杆菌、牛支原体、沙门氏菌、巴氏杆菌，为广西壮族自治区兽医所分离鉴定和保存。BstDNA 聚合酶购自北京蓝谱生物科技有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

2 、LAMP引物组的设计与合成

根据GenBank 中的溶血性曼氏杆菌gcp基因序列，进行gcp基因序列比对，选取保守区域，设计特异性LAMP引物，其中F3、B3 为外引物，FIP、BIP 为内引物，LB为环引物，其中 F3、B3为溶血性曼氏杆菌的PCR检测引物，其中

F3 GGGCAATACGAACTACTCGG（SEQ ID NO：1）

B3 TCGTATTCGCAGCAAAGGTT（SEQ ID NO：2）

FIP GCTACACCGGCAGGGTAATCCCCGGTGAAGCCTTTGACAA （SEQ ID NO：3）

BIP ATTAGCCGAATCCGGCACGCATCCAGTCCCGGTCTGTC（SEQ ID NO：4）

LB GTTTTAAATTCCCTCGTCCAATGAC（SEQ ID NO：5）。

引物组由上海英骏生物有限公司合成。

3、细菌基因组DNA提取

样品处理：

病原菌培养物：取适量至于灭菌离心管中，若为液体培养物，则离心后去上清，取沉淀。

组织样品：首先进行研磨，反复冻融，离心后取上清。

再使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌基因组DNA。

4、LAMP反应体系建立

按25μl体系配置：

2×反应缓冲液 12.5 μL

BstDNA 聚合酶 1 μL

F3 5 pmol

B3 5 pmol

FIP 40 pmol

BIP 40 pmol

LB 25 pmol

隐秘杆菌DNA 2 μL

超纯水补足25 μL。

5、LAMP反应程序

LAMP反应在实时浊度仪( LA-320C，日本荣研公司) 密闭进行，浊度仪实时监控扩增情况，反应程序为63℃保持60 min，反应结束后85℃灭活5 min。

6、结果判定

7、LAMP扩增引物组在LAMP扩增试剂中的使用

7.1 标准品制备

以溶血性曼氏杆菌DNA为模板，以本LAMP方法设计的外引物F3和B3为PCR扩增引物，将PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒DNA，经测序确认后，测定重组质粒pMD18-T-gcp的起始浓度，作为标准样品，-70℃保存备用。

7.2 特异性检测

分别提取溶血性曼氏杆菌、隐秘杆菌、克雷伯氏菌、大肠杆菌、牛支原体、沙门氏菌、巴氏杆菌的基因组DNA作为LAMP反应的模板，检验LAMP方法的特异性。

7.3 敏感性检测

取标准样品--重组质粒pMD18-T-gcp，测定其起始浓度，用RNA-Free Water进行连续10倍倍比稀释8个稀释度，取各稀释度2 μL作为模板进行LAMP扩增，进行敏感性检测。

3）定量检测

设置对照：浓度为0.855×10¹ng/μL、0.855×10⁰ng/μL、0.855×10^-1ng/μL、0.855×10^-2ng/μL、0.855×10^-3ng/μL的重组质粒pMD18-T-gcp标准样品各一个，因为标准样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，即可对未知样品的基因拷贝数进行定量检测。

实施例1 LAMP扩增引物组的特异性试验结果

对1溶血性曼氏杆菌、6株阴性对照菌和水对照进行LAMP扩增，结果如图1所示，隐秘杆菌反应管在25 min左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，6株阴性对照菌反应管和水对照反应管曲线均无扩增情况出现，为阴性结果。

实施例2 LAMP扩增引物组的敏感性试验结果

溶血性曼氏杆菌重组质粒pMD18-T-gcp起始浓度为0.855×10¹ng/μL，经10倍倍比稀释后进行LAMP扩增，结果如图2所示， LAMP法检测限约为0.855×10^-4ng/μL。

实施例3绘制定量检测溶血性曼氏杆菌的定量标准曲线

设置对照：浓度为0.855×10¹ng/μL、0.855×10⁰ng/μL、0.855×10^-1ng/μL、0.855×10^-2ng/μL、0.855×10^-3ng/μL的重组质粒pMD18-T-gcp标准样品各一个，因为标准样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y = 0.3519x - 8.5797，如图3所示，相关系数R² = 0.9925，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10^-y，再乘以基数1.05，即为0.855 ×10^-y ng/μL。依据拷贝数换算公式copies/μL=（6.02 ×10²³ × (ng/ul × 10^-9)） / (DNA length × 660)，DNA length为载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+220=2913 bp，将其换算成拷贝数（copies/μL）：6.02×10²³×（0.855×10^-y ×10^-9）/ (2913× 660)，简化之后为：2.67× 10⁸× 10^-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为30分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于1.97，则其拷贝数为：2.67× 10⁸ ×10^-1.97=2.67×10^6.03copies/μL，从而达到定量的效果。

表1 标准样品浓度负对数与对应反应管浊度值为0.1的时间

时间(min)	21.5	24.9	26.7	29.9	33.1
						标准值（-LOG）	-1	0	1	2	3

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 一种快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组及其应用

<141> 2018-05-30

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 1

gggcaatacg aactactcgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 2

tcgtattcgc agcaaaggtt 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 3

gctacaccgg cagggtaatc cccggtgaag cctttgacaa 40

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 4

attagccgaa tccggcacgc atccagtccc ggtctgtc 38

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 5

gttttaaatt ccctcgtcca atgac 25

Claims

1.一种快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组由具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的内引物FIP和BIP、具有SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示核苷酸序列的外引物F3和B3、具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的环引物LB组成。

2.根据权利要求1所述快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组是依据溶血性曼氏杆菌gcp基因进行设计。

3.根据权利要求1或2所述快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组在制备检测溶血性曼氏杆菌试剂盒的应用。

4.一种快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂盒包括如权利要求1所述的SEQ ID 1~5所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂盒还包括以下组分：

（1）2×反应缓冲液：包含Buffer、dNTPs、Mg²⁺

（2）Bst DNA聚合酶

（3）超纯水

（4）阳性对照：溶血性曼氏杆菌DNA。

6.根据权利要求4所述的快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP试剂盒，其特征在于，所述的引物组使用浓度为25 pmol/μL。

7.根据权利要求4或5所述的快速检测溶血性曼氏杆菌的LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂盒的反应程序为63℃恒温保持60 min，扩增结束后85℃灭活5 min，反应在20-25 min出现扩增。