CN115896313B - 曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针、检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针、检测方法及应用，引物包括上游引物MA‑Pf和下游引物MA‑P，探针为MA‑Probe，序列分别如SEQ ID NO.1、NO.2和SEQ ID NO.3所示，探针的5'端标记有荧光报告基团FAM，探针的3'端标记有淬灭基团BHQ1。利用引物和探针建立的TaqMan实时荧光定量PCR能在1个反应管里同时检测曼氏杆菌属全部9个种细菌，且不与牛羊常见的细菌发生交叉反应。该方法具有特异性强、灵敏性高、重复性好、检测快速、操作简便、成本低廉等优点，可用于曼氏杆菌属细菌的快速鉴定和牛羊组织样品中曼氏杆菌属细菌的绝对定量检测，为牛羊曼氏杆菌属细菌感染的高通量快速检测提供了可靠方法。

Description

曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探 针、检测方法及应用

技术领域

本发明属兽医微生物检测技术领域，具体涉及一种曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针、检测方法及应用。

背景技术

曼氏杆菌属(Mannheimia)细菌包括溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica)、反刍动物曼氏杆菌(M.ruminalis)、肉芽肿曼氏杆菌(M.granulomatis)、葡萄糖苷曼氏杆菌(M.glucosida)、豚鼠曼氏杆菌(M.caviae)、异源曼氏杆菌(M.varigena)、布莱克尔曼氏杆菌(M.pernigra)、牛曼氏杆菌(M.bovis)和绵羊曼氏杆菌(M.ovis)共9个种。曼氏杆菌属细菌是牛羊等反刍动物的重要条件致病菌，其中，溶血性曼氏杆菌感染最为常见，能引起牛羊肺炎、乳房炎^[1,2]；葡萄糖苷曼氏杆菌能引起山羊乳房炎和羚羊肺炎^[3,4]；肉芽肿曼氏杆菌能引起牛的肺炎、乳房炎和下颚肉芽肿^[5-7]；异源曼氏杆菌能引起牛的肾盂肾炎和脑膜炎^[8,9]；反刍动物曼氏杆菌能引起绵羊乳房炎^[10]；豚鼠曼氏杆菌是豚鼠结膜炎和中耳炎的相关病原体^[11]；牛曼氏杆菌是牛肺炎的相关病原体^[12]；绵羊曼氏杆菌是绵羊肺炎的相关病原体^[13]；曼氏杆菌感染严重危害牛羊等反刍的健康，给牛羊等反刍动物的养殖造成严重的经济损失^[14]，因此，建立曼氏杆菌属细菌病原快速检测方法对牛羊等反刍动物曼氏杆菌感染的预防和控制具有重要意义。

实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应)方法具有敏感性高、特异性强、反应快速和适用于高通量检测等诸多优点，广泛应用于多种动物疫病快速检测。实时荧光定量PCR检测方法分为两种，一种是染料法实时荧光定量PCR方法，另一种是探针法实时荧光定量PCR方法。染料法实时荧光定量PCR方法具有操作简便，成本也相对较低的优点，但由于染料法实时荧光定量PCR方法检测的是反应体系中所有双链DNA，一些非特异扩增或引物二聚体的出现都将严重影响检测结果的准确性，导致染料法实时荧光定量PCR方法的特异性不如探针法实时荧光定量PCR方法。

探针法实时荧光定量PCR检测的是反应体系中的目标序列，不受非特异性扩增和引物二聚体的影响，使得探针法实时荧光定量PCR方法的特异性优于染料法实时荧光定量PCR方法。目前，曼氏杆菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法相关报道少见，仅见溶血性曼氏杆菌的实时荧光定量PCR检测方法的研究报道^[15,16]和Guenther等^[17]报道的检测曼氏杆菌属5个种细菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，缺乏一种能在同一个反应管内同时检测曼氏杆菌属全部9个种细菌的实时荧光定量PCR检测方法。

参考文献

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发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有检测曼氏杆菌属细菌检测技术的不足，提供一种曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针、检测方法及应用。

本发明通过GenBank数据库下载曼氏杆菌属全部9个种细菌(溶血性曼氏杆菌、反刍动物曼氏杆菌、肉芽肿曼氏杆菌、葡萄糖苷曼氏杆菌、豚鼠曼氏杆菌、异源曼氏杆菌、布莱克尔曼氏杆菌、牛曼氏杆菌和绵羊曼氏杆菌)的16S rRNA基因序列(包含了曼氏杆菌全部9个种的模式菌株的16S rRNA基因序列)，用DNAstar软件包中的MegAlign软件进行基因相似性比对，选择曼氏杆菌属细菌特异性保守基因片段，利用Beacon Designer 7.7软件设计曼氏杆菌属细菌特异性上游引物MA-Pf、下游引物MA-Pr和探针MA-Probe。通过反应体系、反应条件的优化以及标准曲线的建立，建立了曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。所建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的准曲线Y＝43.132－4.046×logX(Y为扩增的检测样品的C_t值，X为检测样品DNA的起始拷贝数)在标准品pMD-MA-16S浓度9.78×10⁶～9.78×10¹copies/μL范围内具有良好线性关系，将检测样品的C_t值代入方程即可以计算出检测样品中曼氏杆菌属细菌的DNA的起始拷贝数，再根据提取DNA所用的检测样品的质量(单位为g)，就可以推算出检测样品中曼氏杆菌属细菌的绝对含量，从而实现对检测样品中曼氏杆菌属细菌的绝对定量检测。

本发明的第一个目的是提供一种曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针。

所述引物包括上游引物MA-Pf和下游引物MA-Pr，所述探针为MA-Probe。上游引物MA-Pf序列为:5'-GAGCGAATCTCASAAAGTA-3'(S代表碱基G或C)(详见序列表SEQ ID NO.1)；下游引物MA-Pr序列为:5'-GTATTCACCGCAACATTC-3'(详见序列表SEQ ID NO.2)；探针序列为：MA-Probe:5'-FAM-TGCGATTACTAGCGATTCCGAC-BHQ1-3'(详见序列表SEQ ID NO.3)，探针的5'端标记有荧光报告基团FAM，其3端'标记有淬灭基团BHQ1。

本发明的第二个目的是提供一种基于上述本发明的引物和探针的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

提取检测样品的细菌基因组DNA作为模板；

使用上述检测引物和检测探针进行实时荧光定量PCR反应；

反应结束后，根据检测样品是否出现扩增曲线直接判定检测样品中是否存在曼氏杆菌属细菌。

进一步地：

(1)20μL最佳反应体系：ddH₂O 8.0μL，荧光定量预混试剂2×SuperReal PreMix10μL，50×ROX Preference Dye 0.3μL，上游引物MA-Pf(10μmol/L)0.3μL，下游引物MA-Pr(10μmol/L)0.2μL，探针MA-Probe(10μmol/L)0.2μL，模板1μL。其中，所述TaqMan实时荧光定量PCR SuperReal PreMix预混试剂包含有实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合酶，缓冲液和dNTP。

(2)最佳反应条件：95℃15min；95℃3s、64℃30s并收集荧光信号，40个循环，标准曲线方程为：

Y＝43.132－4.046×logX (1)

公式中：Y为扩增的检测样品的C_t值，X为检测样品DNA的起始拷贝数。

将检测样品的C_t值代入方程(1)中即可以计算出检测样品中曼氏杆菌属细菌DNA的起始拷贝数，再根据提取DNA所用的检测样品的质量，进而推算出检测样品中曼氏杆菌属细菌的绝对含量，从而实现对检测样品中曼氏杆菌属细菌的绝对定量检测。

(3)定性检测结果判定标准：荧光定量PCR反应出现增曲线(曲线起峰)为阳性，表示检测样品中存在曼氏杆菌属细菌DNA；不出现扩增曲线(曲线不起峰，近似水平直线)为阴性，表示检测样品中不存在曼氏杆菌属细菌DNA。

所述曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法不仅可以应用于曼氏杆菌属细菌的快速鉴定，更重要的是还可以根据检测样品的循环次数Ct值和标准曲线方程对检测样品中的曼氏杆菌属细菌进行绝对定量检测。

本发明的第三个目的是提供一种曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法在曼氏杆菌属细菌的快速鉴定以及在牛羊组织样品中的曼氏杆菌属细菌的定性或者绝对定量检测中的应用。

本发明所建立的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法克服了Guenther等人报道的曼氏杆菌属细菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的诸多缺陷，具有以下特点：

(1)Guenther等人所述SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法是一种染料法实时荧光定量PCR方法，而本发明所述实时荧光定量PCR方法是一种探针法实时荧光定量PCR方法，二者有着本质区别，探针法实时荧光定量PCR方法克服了染料法实时荧光定量PCR方法固有的由于反应体系中引物二聚体和非特异性扩增导致检测样品出现的假阳性结果；

(2)本发明所述TaqMan实时荧光定量PCR方法能够检测曼氏杆菌属全部9个种细菌(包括溶血性曼氏杆菌、异源曼氏杆菌、反刍动物曼氏杆菌、肉芽肿曼氏杆菌、葡萄糖苷曼氏杆菌、布莱克尔曼氏杆菌、牛曼氏杆菌和绵羊曼氏杆菌)，克服了Guenther等人所述SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法只能检测曼氏杆菌属5个种细菌(包括溶血性曼氏杆菌、异源曼氏杆菌、反刍动物曼氏杆菌、肉芽肿曼氏杆菌和葡萄糖苷曼氏杆菌)的缺陷；

(3)本发明所述TaqMan实时荧光定量PCR方法操作简便，成本低。Guenther等人所述SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法实际上是5种单一实时荧光定量PCR方法的组合(这5种实时荧光定量PCR方法的温度循环条件相同)，即该方法需要在5个反应管内(各反应管内含有1对引物，检测曼氏杆菌属的1个种细菌)同时进行一次实时荧光定量PCR反应才能实现同时检测曼氏杆菌属5个种细菌的目的。而本发明所述TaqMan实时荧光定量PCR方法是单一实时荧光定量PCR检测方法，即在同一个反应管内(只有1对引物和1条探针)进行一次实时荧光定量PCR反应就能实现同时检测曼氏杆菌属9个种细菌的目的。

另外，由于实时荧光定量PCR反应管和试剂昂贵，所以本发明所述TaqMan实时荧光定量PCR方法检测1份检测样品的成本仅为Guenther等人所述SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方检测方法成本的20％；另外，Guenther等人所述SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的5种反应体系中需要分别加入5对引物，反应体系配制过程繁琐，而本发明所述TaqMan实时荧光定量PCR方法的反应体系中只需加1对引物和1条探针，大大简化了反应体系的配制，从而降低人为误差；

(4)Guenther等人所述SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方检测法只利用了曼氏杆菌属细菌以外的6种细菌(包括多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、海藻巴氏杆菌(Pasteurella trehalosia)、睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)、牛支原体(Mycoplasmabovis)、猪肺支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)和埃希氏大肠杆菌(Escherichiacoli))对其方法的特异性进行评价，结果显示该方法与上述细菌存在交叉反应(出现非特异性扩增曲线)，导致检测样品出现假阳性结果，限制了其在牛羊组织样品检测中的应用。而本发明所述TaqMan实时荧光定量PCR方法利用了曼氏杆菌属细菌以外多达38种细菌(包括多杀性巴氏杆菌、产气巴氏杆菌、海藻佰伯史坦菌、大肠杆菌等)进行特异性评价，结果均无交叉反应，特异性高，保证了其在牛羊组织样品检测中的准确性。

(5)Guenther等人所述SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法未建立其标准曲线，未见其在牛羊组织样品绝对定量检测中的应用。本发明所述TaqMan实时荧光定量PCR方法的标准曲线方程Y＝43.132－4.046×logX(Y为扩增的检测样品的C_t值，X为检测样品DNA的起始拷贝数)，将检测样品的C_t值代入方程即可以计算出牛羊组织样品中曼氏杆菌属细菌DNA的起始拷贝数，再根据提取DNA所用的牛羊组织样品的质量(单位为g)，就可以推算出牛羊组织样品中曼氏杆菌属细菌的绝对含量，从而实现对牛羊组织样品中曼氏杆菌属细菌的绝对定量检测；

(6)Guenther等人所述SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方检测方法从收到组织样品到出检测结果需要5h，而本发明所述TaqMan实时荧光定量PCR检测方法从收到组织样品到出检测结果只需要1.5h，检测速度快，大大提高了检测效率；

(7)结果判定方法简单准确。Guenther等人所述SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方检测方法，阴性对照出现非特异性扩增曲线，不能直接根据实时荧光定量PCR扩增曲线对检测结果进行快速判定，需要比较Ct值、分析实时荧光定量PCR产物的溶解曲线，甚至需要对实时荧光定量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的复杂过程才能对检测结果进行准确判定；而本发明所述TaqMan实时荧光定量PCR检测方法只需要根据实时荧光定量PCR扩增曲线直接进行结果判定，有扩增曲线(曲线起峰)判定为阳性，无扩增曲线(曲线不起峰，近似水平直线)判定为阴性。因此，本发明所述TaqMan实时荧光定量PCR检测方法克服了现有实时荧光定量PCR存在的诸多技术缺陷，具有实质的进步和良好的实际应用价值。

附图说明

图1为TaqMan实时荧光定量PCR的标准曲线。

图2为TaqMan实时荧光定量PCR的特异性评价结果。

图3为TaqMan实时荧光定量PCR的敏感性评价结果。

图4为TaqMan实时荧光定量PCR快速鉴定曼氏杆菌属细菌。

图5为TaqMan实时荧光定量PCR绝对定量检测组织样品中的曼氏杆菌属细菌。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。除非特别说明，本发明采用的试剂、耗材、设备为本技术领域常规试剂、耗材和设备。实施例中所述检测样品可以是取自牛羊的任何组织、体液和排泄物样品以及细菌分离株等样品。

图2中的1—12分别为：溶血性曼氏杆菌NCTC 9380^T、绵羊曼氏杆菌ZY180512、溶血性曼氏杆菌ASV20119、肉芽肿曼氏杆菌ATCC 49224^T、葡萄糖苷曼氏杆菌CCUG 38457^T、溶血性曼氏杆菌ASV17113、豚鼠曼氏杆菌CCUG 59995^T、异源曼氏杆菌CCUG 38462^T、绵羊曼氏杆菌CGMCC 1.13620^T、布莱克尔曼氏杆菌CCUG 74657^T、牛曼氏杆菌KCTC 25018^T和反刍动物曼氏杆菌CCUG 38470^T；13—50分别为鲁氏不动杆菌20083、伪鲁氏不动杆菌211144、马尿气球菌ASV210852、沙福芽孢杆菌ASV21102、海藻百伯史坦菌ASV21108、魏氏梭菌ASV200849、伪结核棒状杆菌ASV220610、海水肠球菌ASV220416、粪肠球菌ASV210624、埃希氏大肠杆ASV210723菌、费格森埃希氏菌ASV220419、鲁斯埃希氏菌ASV210736、乳酸乳球菌ASV22069、单增李氏杆菌DSM 20600、英诺克李氏杆菌ASV201080、牛眼莫拉菌ASV211134、绵羊莫拉菌ASV210756、产气巴氏杆菌ASV20097、多杀性巴氏杆菌ASV201160、奇异变形杆菌ASV210740、绿脓杆菌200921、鼠鼻罗斯氏菌ASV210634、肠炎沙门氏菌ASV201158、普城沙雷氏菌ASV201241、费氏志贺氏菌ASV211126、金黄色葡萄球菌ASV201020、表皮葡萄球菌ASV220412、产色葡萄球菌ASV210921、停乳链球菌ASV201139、巴黎链球菌ASV200845、副猪链球菌ASV211143、多动物链球菌ASV210759、小肠结肠炎耶尔森菌ASV211212、无枝菌酸棒状杆菌YN21088、流产布氏杆菌A19、化脓隐秘杆菌YN170843、牛支原体YN13077和山羊支原体YN191154。

图3中的1—8分别为：浓度为9.78×10⁶～9.78×10^-1copies/μL的标准品pMD-MA-16S。

图4中：1为菌株ASV170220；2为阳性对照(标准品pMD-MA-16S)；3—5分别为：菌株YN180721、菌株YN210811和阴性对照(大肠埃希氏菌ATCC 11775^T的基因组DNA)。

图5中：1为奶牛肺脏组织样品KM002；2为阳性对照(标准品pMD-MA-16S)；3为山羊肺脏组织样品YL001；4为山羊乳腺组织样品ML001；5—7分别为：奶牛肺脏组织样品KM001、山羊肺脏组织样品YL002和阴性对照(大肠埃希氏菌ATCC 11775^T的基因组DNA)。

实施例1引物设计与合成

通过GenBank数据库下载曼氏杆菌属全部9个种细菌模式菌株的16S rRNA基因序列。

所述模式菌株及其16S rRNA基因登录号分别为溶血性曼氏杆菌NCTC 9380^T(基因登录号AF060699)、反刍动物曼氏杆菌CCUG 38470^T(基因登录号AF053900)、肉芽肿曼氏杆菌ATCC 49224^T(基因登录号AF053902)、葡萄糖苷曼氏杆菌CCUG 38457^T(基因登录号AF053889)、豚鼠曼氏杆菌CCUG 59995^T(基因登录号HM439607)、异源曼氏杆菌CCUG 38462^T(基因登录号AF053893)、布莱克尔曼氏杆菌CCUG 74657^T(基因登录号MT596512)、牛曼氏杆菌KCTC 25018^T(基因登录号MT974312)和绵羊曼氏杆菌CGMCC 1.13620^T(基因登录号MN745099)。

用DNAstar(版本号7.0.1)软件包中的MegAlign软件进行基因相似性比对，选择曼氏杆菌属细菌的保守基因片段，其序列如序列表中SEQ ID NO.4所示 利用Beacon Designer(版本号7.7)软件设计曼氏杆菌属细菌特异性上游引物MA-Pf和下游MA-Pr，以及特异性探针MA-Probe。上游引物MA-Pf的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示(5'-GAGCGAATCTCASAAAGTA-3')；下游引物MA-Pr的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示(5'-GTATTCACCGCAACATTC-3')；探针MA-Probe的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示(5'-FAM-TGCGATTACTAGCGATTCCGAC-BHQ1-3')，探针的5'端标记有荧光报告基团FAM，3'端标记有淬灭基团BHQ1。引物和探针均由Invitrogen公司合成。

实施例2TaqMan实时荧光定量PCR方法的优化及标准曲线的建立

1.菌株

溶血性曼氏杆菌模式菌株NCTC 9380^T保存于云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室。

2.细菌样品基因组DNA的提取

利用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取溶血性曼氏杆菌NCTC 9380^T的基因组DNA作为TaqMan实时荧光定量PCR反应的模板，细菌基因组DNA提取方法按照试剂盒操作说明进行，提取所得细菌基因组DNA，-20℃保存备用。本发明对所述细菌样品基因组DNA的提取方法没有特殊的限定，采用常规方法进行DNA提取即可。

3.TaqMan实时荧光定量PCR标准品的制备

TaqMan实时荧光定量PCR标准品的制备的方法如下：

(1)目的片段PCR扩增：以溶血性曼氏杆菌NCTC 9380^T的DNA作为模板，以2×EasyTaq PCR SuperMix(购自北京全式金生物技术有限公司)作为PCR预混液，以MA-Pf/MA-Pr为引物进行普通PCR扩增获得目的基因片段(大小为105bp)，其PCR反应条件为94℃预变性3min；94℃30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；

(2)目的片段胶回收：将上述PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)回收目的条带；

(3)目的片段与载体连接：用pMD19-T载体克隆试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)将目的基因片段克隆于pMD19-T载体中构建pMD-MA-16S重组质粒；

(4)重组质粒转化大肠杆菌：将连接所得重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑单菌落扩大培养得到菌液；

(5)重组质粒提取：用质粒小提试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取菌液中的重组质粒；

(6)重组质粒浓度测定及浓度换算：用紫外分光光度法测定其浓度为30ng/μL，利用公式(copies/μL＝(6.02×10²³)×(ng/μL×10^-9)/(DNA长度×660)将质量浓度换算为拷贝数浓度9.78×10⁹copies/μL，作为TaqMan实时荧光定量PCR标准品。

本发明对所述PCR扩增、目的基因片段胶回收、目的片段与载体连接、质粒转化大肠杆菌、质粒提取、质粒浓度测定和质粒浓度换算方法没有殊的限定，采用常规方法进行即可。4.TaqMan实时荧光定量PCR反应体系的优化

在基础反应条件(95℃15min；95℃3s、60℃30s，40个循环)保持不变的条件下，采用方阵法对20μL基础反应体系{ddH₂O 8.1μL，2×SuperReal PreMix(Probe)10μL，50×ROXPreference Dye 0.3μL，引物MA-Pf(10μmol/L)和MA-Pr(10μmol/L)各0.2μL，探针MA-Probe(10μmol/L)0.2μL，模板1μL)}中的上游引物体积(0.1μL、0.2μL、0..3μL和0.4μL)、下游引物体积(0.1μL、0.2μL、0..3μL和0.4μL)和探针体积(0.1μL、0.2μL、0.3μL和0.4μL)进行优化，得到20μL最佳反应体系：

ddH₂O 8.0μL，2×SuperReal PreMix 10μL，50×ROX Preference Dye 0.3μL，上游引物MA-Pf(10μmol/L)0.3μL，下游引物MA-Pr(10μmol/L)0.2μL，探针MA-Probe(10μmol/L)0.2μL，模板1μL。

5.TaqMan实时荧光定量PCR反应条件的优化

在上述最佳20μL反应体系保持不变的条件下，对基础反应条件(95℃ 15min；95℃3s、60℃ 30s，40个循环)中的退火温度(58℃、60℃、62℃、64℃和66℃)进行优化，得到最佳退火温度为64℃，即最佳反应条件为：95℃ 15min；95℃ 3s、64℃ 30s，40个循环。

6.标准曲线的建立

用TE缓冲液将上述标准品pMD-MA-16S(浓度为9.78×10⁹copies/μL)进行10倍系列稀释7个梯度(9.78×10⁶～9.78×10¹copies/μL)作为模板，用建立的TaqMan实时荧光定量PCR方同时对各稀释度样品(每个稀释度样品设置3个重复)进行1次检测，利用ABI7500Software v 2.0.1软件建立标准曲线(如图1所示)。结果显示：

标准品pMD-MA-16S浓度在9.78×10⁶～9.78×10¹copies/μL范围内具有良好的线性关系，其标准曲线方程Y＝43.132－4.046×logX(其中Y为扩增的检测样品的C_t值、X为检测样品DNA的起始拷贝数)，相关系数R²值为0.996。

在组织样品绝对定量检测中，将检测样品的Ct值代入方程及可计算出DNA样品中曼氏杆菌属细菌DNA的起始拷贝数，再根据提取DNA所用的检测样品的质量，从而推算出组织样品中曼氏杆菌属细菌的绝对含量。

7.阳性对照和阴性对照

阳性对照为阳性质粒标准品pMD-MA-16S，其浓度为9.78×10³copies/μL；阴性对照为大肠埃希氏菌ATCC 11775^T的基因组DNA。

8.检测结果判定标准

定性检测中：出现增曲线(曲线起峰)为阳性，表示检测样品中存在曼氏杆菌属细菌DNA；不出现扩增曲线(曲线不起峰，近似水平直线)为阴性，表示检测样品中不存在曼氏杆菌属细菌DNA。

相对定量检测中：检测样品的Ct值越小则检测样品中曼氏杆菌属细菌DNA的浓度(或含量)越高。

绝对定量检测中：将检测样品的Ct值代入标准曲线方程Y＝40.304－3.28×logX(Y为扩增的检测样品的C_t值，X为检测样品DNA的起始拷贝数)即可计算出DNA样品中曼氏杆菌属细菌的DNA的拷贝数浓度，再根据提取DNA所用的检测样品的质量，从而推算检测样品中曼氏杆菌属细菌的绝对含量。

实施例3TaqMan实时荧光定量PCR方法的性能评价

1.特异性评价

(1)菌株

曼氏杆菌属全部9个种细菌模式菌株和牛羊常见的41种细菌均由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室保存。所述曼氏杆菌属全部9个种细菌模式菌株包括溶血性曼氏杆菌NCTC 9380^T、反刍动物曼氏杆菌CCUG 38470^T、肉芽肿曼氏杆菌ATCC 49224^T、葡萄糖苷曼氏杆菌CCUG 38457^T、豚鼠曼氏杆菌CCUG 59995^T、异源曼氏杆菌CCUG 38462^T、布莱克尔曼氏杆菌CCUG 74657^T、牛曼氏杆菌KCTC 25018^T和绵羊曼氏杆菌CGMCC 1.13620^T)。所述牛羊常见的41种细菌分离自云南省牛、羊养殖场的牛羊。50株细菌的拉丁名称、菌株编号、来源及16S rRNA基因的GenBank登录号见表1。

(2)细菌基因组DNA的提取

用实施例2中所述的细菌基因组DNA提取方法提取曼氏杆菌属全部9个种细菌模式菌株和牛羊常见的41种细菌的基因组DNA作为TaqMan实时荧光定量PCR检测样品，-20℃保存备用。

(3)特异性评价

用实施例2中优化所得的TaqMan实时荧光定量PCR方法对曼氏杆菌属全部9个种细菌模式菌株和牛羊常见的41种细菌的基因组DNA样品进行检测，检测结果显示：仅曼氏杆菌属全部9个种细菌模式菌株(溶血性曼氏杆菌NCTC 9380^T、反刍动物曼氏杆菌CCUG 38470^T、肉芽肿曼氏杆菌ATCC 49224^T、葡萄糖苷曼氏杆菌CCUG 38457^T、豚鼠曼氏杆菌CCUG 59995^T、异源曼氏杆菌CCUG 38462^T、布莱克尔曼氏杆菌CCUG 74657^T、牛曼氏杆菌KCTC 25018^T和绵羊曼氏杆菌CGMCC 1.13620^T)和2株溶血性曼氏杆菌云南分离株ASV17113和ASV20119以及1株绵羊曼氏杆菌云南分离株ZY180512的DNA样品出现扩增曲线(曲线起峰)，检测为阳性；其他牛羊常见的38种细菌的DNA样品未出现扩增曲线(曲线近似水平)，检测为阴性(如图2和表1所示)。检测结果与预期结果一致，表明该TaqMan实时荧光定量PCR方法能够特异检测曼氏杆菌属全部9个种细菌，不与牛羊常见的其他38种细菌发生交叉反应，特异性强。

表1.TaqMan实时荧光定量PCR的特异性试验结果

注：+，表示阳性；–，表示阴性；ND，表示未检测到。

2.敏感性评价

将标准品pMD-MA-16S(浓度为9.78×10⁹copies/μL)10倍稀释8个梯度(10^-3～10^-10)，即稀释后的标准品的浓度分别为9.78×10⁶～9.78×10^-1copies/μL，用实施例2优化所得TaqMan实时荧光定量PCR方法对各稀释度样品进行检测，确定pMD-MA-16S标准品的最低检出浓度。检测结果显示：出现扩增曲线的标准品最低浓度为9.78copies/μL(如图3所示)，即本方法能检测到标准品的最低浓度为9.78copies/μL，表明该TaqMan实时荧光定量PCR方法具有较高的敏感性。

3.重复性评价

将标准品pMD-MA-16S(浓度为9.78×10⁹copies/μL)10倍稀释4个梯度(10^-3～10^-6)，稀释后的4个标准品的浓度分别为9.78×10⁶～9.78×10³copies/μL，用实施例2优化所得TaqMan实时荧光定量PCR方法对各稀释度样品(每个浓度设立3个重复)进行1次荧光定量PCR反应，根据Ct值计算批内变异系数。批间重复性试验：实施例2优化所得TaqMan实时荧光定量PCR方法对各稀释度样品进行3次荧光定量PCR反应，根据Ct值计算批间变异系数，以批内和批间变异系数评价该方法的稳定性。结果显示批内和批间重复性试验的变异系数均小于3％(如表2所示)，表明该方法具有较好的重复性。

表2.TaqMan实时荧光定量PCR的重复性试验结果

注：，表示平均数；SD，表示标准差；CV，表示变异系数。

实施例4TaqMan实时荧光定量PCR方法在曼氏杆菌属细菌快速鉴定中的应用

1.菌株

菌株YN180721分离自云南省某牛场的奶牛，菌株ASV170220分离自云南省某羊场的绵羊，菌株YN210811分离自云南省某羊场的山羊，3株细菌保存于云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室。

2.细菌基因组DNA的提取

用实施例2中所述的细菌基因组DNA提取方法提取3株细菌YN180721、ASV170220和YN210811的基因组DNA作为荧光定量PCR的检测样品，-20℃保存备用。

3.TaqMan实时荧光定量PCR快速鉴定曼氏杆菌属细菌

为了比较用实施例2优化所得TaqMan实时荧光定量PCR方法鉴定菌株的准确性，本实施例将实施例2优化所得TaqMan实时荧光定量PCR方法与传统的细菌16S rRNA基因相似性比对鉴定方法进行比较。所述细菌16S rRNA基因相似性比对鉴定方法具体步骤如下：

(1)分别以3株细菌YN180721、ASV170220和YN210811的DNA为模板，用细菌通用引物27F和1492引物进行普通PCR反应扩增16S rRNA基因；

(2)分别对3株细菌的PCR扩增产物进行测序得到16S rRNA基因序列，基因序列提交GenBank数据库，3株细菌YN180721、ASV170220和YN210811的16S rRNA基因GenBank登录号分别为MT516321、ON715870和MZ841816；

(3)分别将3株细菌的16S rRNA基因序列在EzTaxon-e数据库(https://www.ezbiocloud.net/)中进行比对鉴定，结果显示菌株YN180721与Streptococcusparasuis DSM 29126T相似性最高为98.9％，鉴定为副猪链球菌(非曼氏杆菌属细菌)；菌株ASV170220与Mannheimia haemolytica NCTC 9380T相似性最高为99.9％，鉴定为溶血性曼氏杆菌(曼氏杆菌属细菌)；菌株YN210811与Corynebacterium amycolatum DSM 6922^T相似性最高为98.7％，鉴定为无枝菌酸棒状杆菌(非曼氏杆菌属细菌)。

用实施例2中优化所得的TaqMan实时荧光定量PCR方法对3株细菌的DNA样品进行检测，同时设立阳性对照(标准品pMD-MA-16S)和阴性对照(大肠埃希氏菌ATCC 11775^T的基因组DNA)，结果显示：阳性对照出现扩增曲线，阴性对照未出现扩增曲线，对照成立；菌株ASV170220出现扩增曲线(曲线起峰)，其Ct值为19.807，鉴定为曼氏杆菌属细菌(如图4和表3所示)；菌株YN180721和YN210811未出现扩增曲线(曲线近似水平)，鉴定为非曼氏杆菌属细菌(如图4和表3所示)。

实施例2中优化所得的TaqMan实时荧光定量PCR方法与传统的细菌16S rRNA基因相似性比对鉴定方法对3株分离株的鉴定结果一致(即两种方法均将菌株ASV170220鉴定为曼氏杆菌属细菌，菌株YN180721和YN210811鉴定为非曼氏杆菌属细菌)，表明用实施例2优化所得TaqMan实时荧光定量PCR方法鉴定菌株的准确性较高。但是，用16S rRNA基因相似性比对鉴定方法所需时间约为24h，而用实时例2优化所得TaqMan实时荧光定量PCR方法鉴定曼氏杆菌属细菌所需时间约为2h，因此，用实施例2优化所得TaqMan实时荧光定量PCR方法鉴定曼氏杆菌属细菌还具有快速的优点。

表3.两种方法的菌株鉴定结果

菌株编号	来源	GenBank号	荧光定量PCR鉴定结果	16S rRNA基因相似性鉴定结果
					YN180721	奶牛	MT516321	非曼氏杆菌属细菌	非曼氏杆菌属细菌(副猪链球菌)
ASV170220	绵羊	ON715870	曼氏杆菌属细菌	曼氏杆菌属细菌(溶血性曼氏杆菌)
					YN210811	山羊	MZ841816	非曼氏杆菌属细菌	非曼氏杆菌属细菌(无枝菌酸棒杆菌)

实施例5TaqMan实时荧光定量PCR在组织样品绝对定量检测中的应用

1.组织样品

2份来源于云南省某牛场具有呼吸道疫病的奶牛肺脏组织样品KM001和KM002，2份来源于云南省某羊场具有呼吸道疫病的山羊肺脏组织样品YL001和YL002，1份来源于云南省某羊场具有乳房炎的山羊乳房样品ML001。5份组织样品保存于云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室。

2.组织样品基因组DNA的提取

在提取组织样品的细菌基因组DNA前，组织样品进行前处理：取肺脏或乳腺组织样品1g和PBS缓冲液5mL于研钵中，用研钵棒将肺脏组织充分研磨成浆液，用PBS缓冲调整浆液体积至10mL，取浆液500μL(相当于1/20g肺脏组织)于1.5mL离心管中，12000rpm离心10min，弃上清取沉淀用于细菌基因组DNA的提取。用实施例2中所述的细菌基因组DNA提取方法分别提取5份组织样品KM001、KM002、YL001、YL002和ML001的基因组DNA，所得DNA样品体积均为100mL(即细菌基因组提取方法的最后一步用100mL洗脱液将样品的细菌基因组DNA洗脱下来，所得DNA样品体积为100mL)作为TaqMan实时荧光定量PCR的检测样品。即在组织样品的细菌基因组DNA提取过程中，每1/20g肺脏或乳腺组织样品(500μL浆液)提取得到100μL基因组DNA样品。

3.TaqMan实时荧光定量PCR绝对定量检测组织样品中的曼氏杆菌属细菌

用实施例2优化所得TaqMan实时荧光定量PCR方法对5份组织的细菌基因组DNA样品进行检测，同时设立阳性对照(标准品pMD-MA-16S)和阴性对照(大肠埃希氏菌ATCC11775^T的基因组DNA)，结果显示：阳性对照出现扩增曲线，阴性对照未出现扩增曲线，对照成立；KM002、YL001和ML001样品扩增曲线良好，其Ct值分别为20.924、28.789、32.671(如图5所示)，将Ct值代入实施例2所述其标准曲线方程Y＝43.132－4.046×logX(Y为扩增的检测样品的C_t值，X为检测样品DNA的起始拷贝数)，即可得到1μL(反应体系中细菌DNA模板的体积为1μL)DNA样品中曼氏杆菌属细菌DNA的拷贝数X。可以推算100μL DNA样品(相当于1/20g肺脏组织样品)中曼氏杆菌属细菌DNA的拷贝数为100×X，进一步推算1g肺脏组织样品中曼氏杆菌属细菌DNA的拷贝数为100×X×20，即1g组织样品中曼氏杆菌属细菌的数量为100×X×20。例如，将奶牛肺脏组织样品KM002的Ct值20.924代入标准曲线方程Y＝43.132－4.046×logX(Y为扩增的检测样品的C_t值，X为检测样品DNA的起始拷贝数)即可得到1μL DNA样品中曼氏杆菌属细菌DNA的拷贝数为10^5.489。可以推算100μL DNA样品(相当于1/20g肺脏组织样品)中曼氏杆菌属细菌DNA的拷贝数为10^7.489，进一步推算1g奶牛肺脏组织样品中曼氏杆菌属细菌DNA的拷贝数为2×10^8.489，利用Microsoft Office Excel2007中的POWER函数POWER(number,power)(其中参数number表示底数；参数power表示指数)将10^8.489换算为308318795，即2×10^8.489＝2×308318795＝616637590＝6.17×10⁸，即奶牛肺脏组织样品KM002中曼氏杆菌属细菌DNA的拷贝数浓度为6.17×10⁸copies/g，即奶牛肺脏组织样品KM002中曼氏杆菌的含量为6.17×10⁸CFU/g(如表4所示)，其中所述CFU为菌落形成单位(Colony forming units,CFU)。用同样方法可计算得到山羊肺脏组织样品YL001和山羊乳腺组织样品ML001中曼氏杆菌的含量分别为7.02×10⁶CFU/g和7.71×10⁵CFU/g(如表4所示)。

表4.组织样品绝对定量检测结果

样品编号	来源	疾病	Ct值	曼氏杆菌属细菌的含量(CFU/g)
					KM001	奶牛肺脏	呼吸道疫病	ND	0
KM002	奶牛肺脏	呼吸道疫病	20.924	6.17×108
					YL001	山羊肺脏	呼吸道疫病	28.789	7.02×106
YL002	山羊肺脏	呼吸道疫病	ND	0
					ML001	山羊乳腺	乳房炎	32.671	7.71×105

注：ND表示未检测到。

Claims (9)

1.一种曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物MA-Pf和下游引物MA-Pr，所述上游引物MA-Pf的序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物MA-Pr的序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针为MA-Probe，该探针MA-Probe的序列如SEQ ID NO.3所示；所述探针MA-Probe的5'端标记有荧光报告基团FAM，其3'端标记有淬灭基团BHQ1。

2.如权利要求1所述的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针，其特征在于，所述曼氏杆菌属细菌包括溶血性曼氏杆菌、反刍动物曼氏杆菌、肉芽肿曼氏杆菌、葡萄糖苷曼氏杆菌、豚鼠曼氏杆菌、异源曼氏杆菌、布莱克尔曼氏杆菌、牛曼氏杆菌和绵羊曼氏杆菌共9个种细菌。

3.一种非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述TaqMan实时荧光定量PCR检测所用的引物和探针为如权利要求1所述的引物和探针；该检测方法包括以下步骤：

(1)提取检测样品的细菌基因组DNA作为模板；

(2)使用所述引物和探针进行实时荧光定量PCR反应；

(3)反应结束后，根据检测样品的扩增曲线直接判定检测样品中是否存在曼氏杆菌属细菌。

4.如权利要求3所述的非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应包括：

PCR反应体系为：ddH₂O 8.0μL，荧光定量预混试剂2×SuperReal PreMix 10μL，50×ROXPreference Dye 0.3μL，浓度为10μmol/L的上游引物MA-Pf 0.3μL，浓度为10μmol/L的下游引物MA-Pr 0.2μL，浓度为10μmol/L的探针MA-Probe 0.2μL，模板1μL；

PCR反应条件为：(1)95℃15min；(2)95℃3s、64℃30s并收集荧光信号，40个循环；

标准曲线方程为：

Y＝43.132-4.046×logX (1)

公式(1)中：Y为扩增的检测样品的C_t值，X为检测样品DNA的起始拷贝数。

5.如权利要求4所述的非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：

将检测样品的C_t值代入方程(1)中即可以计算出检测样品中曼氏杆菌属细菌DNA的起始拷贝数，再根据提取DNA所用的检测样品的质量，推算出检测样品中曼氏杆菌属细菌的绝对含量，从而实现对检测样品中曼氏杆菌属细菌的绝对定量检测。

6.如权利要求3所述的非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：

所述判定检测样品中是否存在曼氏杆菌属细菌属于定性检测，所述定性检测结果判定标准为：检测样品的荧光定量PCR反应出现扩增曲线为阳性，表示检测样品中存在曼氏杆菌属细菌DNA；检测样品的荧光定量PCR不出现扩增曲线为阴性，表示检测样品中不存在曼氏杆菌属细菌DNA。

7.如权利要求3-6任一项所述的非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：

所述曼氏杆菌属细菌包括溶血性曼氏杆菌、反刍动物曼氏杆菌、肉芽肿曼氏杆菌、葡萄糖苷曼氏杆菌、豚鼠曼氏杆菌、异源曼氏杆菌、布莱克尔曼氏杆菌、牛曼氏杆菌和绵羊曼氏杆菌共9个种细菌。

8.如权利要求7所述的非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：能够在1个反应管里同时检测所述9个种细菌。

9.一种如权利要求3-8任一项所述的一种非疾病诊断目的的曼氏杆菌属细菌特异性TaqMan实时荧光定量PCR检测方法在实现对曼氏杆菌属细菌的非疾病诊断目的的快速鉴定中的应用。