CN117144029A - 一种检测猪细菌性腹泻病原的荧光定量pcr引物探针组 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多重实时荧光定量PCR引物探针组，它由三组分别针对三种猪细菌性腹泻病原的引物和探针组成，所述引物和探针的序列如SEQ ID NO:1‑9所示。本发明针对胞内劳森菌(LI)的aspA基因序列、C型产气荚膜梭菌(C.perfringens)的β毒素基因序列、猪痢疾短螺旋体(B.hyo)的Hypothetical Protein基因序列设计引物，不仅能为猪细菌性腹泻病原菌的临床检测和诊断提供更多的引物探针选择，同时还提高了检测的准确性和灵敏性。

Description

一种检测猪细菌性腹泻病原的荧光定量PCR引物探针组

技术领域

本发明属于病原检测技术领域，具体涉及一种检测猪细菌性腹泻病原的多重实时荧光定量PCR引物探针组，具体而言，所述猪细菌性腹泻病原是胞内劳森菌(Lowsoniaintracellularis，LI)、C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens Type C，C.perfringen)和猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae，B.hyo)。本发明还涉及该引物探针组在制备猪腹泻性病原检测试剂盒中的应用。

背景技术

猪增生性肠炎、猪梭菌性肠炎和猪短螺旋体痢疾都是细菌性腹泻疾病，分别由胞内劳森菌(Lowsonia intracellularis，LI)、C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringensType C，C.perfringen)和猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae，B.hyo)引起。其中猪增生性肠炎为接触性传染病，急性感染可导致猪出血性下痢和死亡，C型产气荚膜梭菌感染则会引起猪出现血痢和持续性腹泻，猪短螺旋体痢疾是一种严重的肠道传染病，感染猪后可出现腹泻、黏液性出血性下痢、消瘦等症状，严重时可导致出血性、卡他性或坏死性结肠炎和盲肠炎。三种细菌都能致使感染猪出现血性下痢，急性发病死亡的症状，从临床症状上来看无法直接进行鉴别诊断，且存在混合感染的情况，这让鉴别诊断变得困难。目前使用微生物学方法和血清学方法进行细菌病原检测费时费力，因此迫切需要建立一种快速高效的检测方法，能够直接做到对这三种细菌的鉴别诊断，这样对疾病防控起到非常重要的作用。

迄今为止，只有两株胞内劳森菌分离株的全基因组序列在NCBI上公布，分别是PHE/MN1-00和N343，这两个基因组之间，基因内区域有八个单核苷酸多态性和70个插入或缺失基因，此外，在基因间区域鉴定出16个SNP和20个插入或缺失基因。目前常用的检测基因是aspA、ubiE、16SrDNA或dnaA，虽然16SrDNA高度保守但是不同细菌的16SrDNA同源性较高，容易出现假阳性。研究发现，从猪粪便中分离出的胞内劳森菌aspA检出率较高且高度保守，并且在胞内劳森菌中是高拷贝。

产气荚膜梭菌细化了四种主要毒素，分别是α、β、ε、ι4种，它们具有致死、坏死和细胞毒性活性等。按分泌毒素的类型可将该菌分为A、B、C、D、E5种，C型产气荚膜梭菌可产生α毒素和β毒素，β毒素被认为是C型菌株坏死性小肠结肠炎的病因。虽然C型菌株的基因组上同时也携带其转录其他毒素的基因，如产气荚膜梭菌α毒素和多产气荚膜梭菌裂解素等，然而研究证据表明，β毒素是C型菌株的主要致死性毒素。虽然B型产气荚膜梭菌也具有β毒素，但其主要存在于动物的肠道中，从粪便中的检出率极低。

猪痢疾短螺旋体Hypothetical Protein基因携带在约65-110kb的大毒力质粒上，所述质粒可含有编码CPE或TpeL的另外的毒素基因。B.hyo在信号转导以及氨基酸运输和代谢系统方面与其他螺旋体不同，并确定了可能的潜在毒力基因为15个蛋白水解酶和6个溶血素基因。后来，经一些研究发现溶血素、鞭毛、细菌的趋化性和运动性、外膜蛋白、NADH氧化酶和铁代谢蛋白这些因素在致病性上发挥作用。Hypothetical Protein基因在猪痢疾短螺旋体引起的疾病发病机制中发挥着重要作用，并且该基因也高度保守。

目前，尚未发现利用aspA基因、β毒素基因、Hypothetical Protein基因设计多重实时荧光定量PCR引物探针并对猪细菌性腹泻病原同时进行检测的方法报道。CN115058528A公开了一种用于检测猪腹泻病原体的引物和探针组，可用于对包括胞内劳森菌、C型产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体在内的6种病原进行检测，申请人对其报导的引物进行匹配，证实其检测三种病原的靶基因分别为16SrDNA、GQX59-13090、plc基因，进一步地，申请人以这三种病原的引物和探针组对胞内劳森菌、C型产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体进行检测，发现其存在检测灵敏度低等缺陷。

基于此，我们设计了一种三重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针组，能快速且准确的检测出LI、C.perfringens和B.hyo三种病原菌，并选择胞内劳森菌的aspA基因，C型产气荚膜梭菌的β毒素基因，猪痢疾短螺旋体的Hypothetical Protein基因作为靶标，所设计的引物具有特异性高，灵敏度好等优点。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种可以同时检测LI、C.perfringens和B.hyo三种猪细菌性腹泻病原菌的多重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针组。一方面，本发明能为猪细菌性腹泻病原菌的临床检测和诊断提供更多的多重PCR引物探针选择；另一方面，本发明还有利于提高检测的准确性和灵敏性。

为实现上述目的，申请人针对胞内劳森菌(LI)的aspA基因序列、C型产气荚膜梭菌(C.perfringens)的β毒素基因序列、猪痢疾短螺旋体(B.hyo)的Hypothetical Protein基因序列，根据多重实时荧光定量PCR引物探针设计原则，设计了多组引物探针并进行验证，根据荧光定量PCR扩增的准确性、特异性和灵敏性对所设计的多组引物探针进行筛选，最终得到一种实时荧光定量PCR引物探针组，它由三组分别针对所述三种猪细菌性腹泻病原的引物和探针组成，具体的引物和探针序列如下：

第一组，针对胞内劳森菌aspA基因设计的引物探针，上游引物(LI-q-F)序列如SEDID NO:1所示，下游引物(LI-q-R)序列如SEQ ID NO:2所示，探针(LI-P)序列如SEQ ID NO:3所示；

第二组，针对C型产气荚膜梭菌β毒素基因设计的引物探针，上游引物(C-q-F)序列如SED ID NO:4所示，下游引物(C-q-R)序列如SEQ ID NO:5所示，探针(C-P)序列如SEQ IDNO:6所示；

第三组，针对猪痢疾短螺旋体Hypothetical Protein基因设计的引物探针，上游引物(B.hyo-q-F)序列如SED ID NO:7所示，下游引物(B.hyo-q-R)序列如SEQ ID NO:8所示，探针(B.hyo-P)序列如SEQ ID NO:9所示。

在使用时，以上三组引物探针并不是独立存在，而是将所有引物、探针按一定比例混合成一个体系。

进一步地，所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。其中，所述第一组探针(LI-P)的荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；所述第二组探针(C-P)的荧光基团为Cy3，荧光淬灭基团为BHQ1；所述第三组探针(B.hyo-P)的荧光基团为Hex，荧光淬灭基团为BHQ1。

本发明的第二个目的是提供所述的多重实时荧光定量PCR引物探针组在检测猪细菌性腹泻病原中的应用。具体而言，是利用所述引物探针组对猪细菌性腹泻进行疾病诊断，或者利用所述引物探针组对导致猪细菌性腹泻的病原进行实验室筛查鉴定。

本发明的第三个目的是提供所述的多重实时荧光定量PCR引物探针组在制备检测猪细菌性腹泻病原的试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种检测猪细菌性腹泻病原的试剂盒，该试剂盒包含以上所述的多重实时荧光定量PCR引物探针组。

本发明的第五个目的是提供一种检测猪细菌性腹泻病原的方法，该方法包括向反应体系中加入所述的引物探针组并进行多重实时荧光定量PCR扩增的步骤。

进一步地，所述反应体系如下：

进一步地，所述扩增的反应程序为：25℃反应10min，95℃预变性30s；95℃变性5s，54℃退火及延伸30s，循环45次。

本发明的有益效果是：

(1)猪增生性肠炎、猪梭菌性肠炎和猪短螺旋体痢疾三种疾病的临床主要症状是出血性腹泻和急性死亡，且存在混合感染的情况。为检测其病原，现有技术已开发出多种方法，其中微生物学和血清学方法耗时、耗力、灵敏性和特异性不高，普通PCR方法一次只能检测一种细菌，检测效率低。因此，对这些病原体的快速诊断对于提供及时有效的防控策略非常重要。为此，本发明开发了一种同时检测三种病原的多重实时荧光定量PCR方法，为临床上胞内劳森菌、C型产气荚膜梭菌、猪痢疾短螺旋体的大规模细菌监测、流行病学调查以及这些疾病的防控提供了一种高价值手段。本发明丰富了此类病原检测的引物探针种类，为临床检测和诊断提供了更多选择。

(2)目前针对aspA基因、β毒素基因、Hypothetical Protein基因的检测大多是进行单重PCR，而申请人针对这些检测靶基因，根据多重PCR引物和探针的设计原则并进行大量筛选，最终筛选出的引物探针组具有扩增效率高、荧光信号强、无干扰等优点。本发明不仅实现了三种病原的检测，而且还提高了检测的准确性和灵敏性。

在特异性方面，本发明建立的方法只对LI、C.perfringens和B.hyo三种细菌有扩增信号，而对大肠杆菌核酸，沙门氏菌核酸，金黄色葡萄球菌核酸，流行性腹泻病毒核酸，传染性胃肠炎病毒核酸，轮状病毒核酸，球虫核酸的DNA没有扩增信号，表明方法特异性良好。

在灵敏性方面，本发明建立的方法对LI质粒的最低检测量为10¹拷贝/μL，对C.perfringens质粒和B.hyo质粒的最低检测量为10⁰拷贝/μL。另外，该方法对LI菌液核酸的检出限度为300pg/uL，对C.perfringens、B.hyo两种菌液核酸的检出限度为30pg/uL。本发明的检测灵敏性要显著高于文献报道的同类方法。

(3)实时荧光定量PCR无需通过凝胶电泳观察PCR产物，减少了时间和交叉污染风险，具有方法简便、快捷等优点。

附图说明

图1是三重实时荧光定量PCR引物探针组的筛选试验结果。

图2是本发明对LI质粒的检测灵敏度，图中1-9为10⁸-10⁰拷贝/μL的混合质粒模版，10为阴性对照。

图3是本发明对C.perfringens质粒的检测灵敏度，图中1-9为10⁸-10⁰拷贝/μL的混合质粒模版，10为阴性对照。

图4是本发明对B.hyo质粒的检测灵敏度，图中1-9为10⁸-10⁰拷贝/μL的混合质粒模版，10为阴性对照。

图5是本发明对LI菌液核酸的检测灵敏度。

图6是本发明对C.perfringens菌液核酸的检测灵敏度。

图7是本发明对B.hyo菌液核酸的检测灵敏度。

图8是文献方法(CN 115058528A)改进后对三种病原菌液核酸的检测灵敏度，图中A为LI，B为C.perfringens，C为B.hyo。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当理解，所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明的试验流程主要包括以下步骤：

1)LI、C.perfringens和B.hyo三重实时荧光定量PCR引物及探针组合筛选：根据多重PCR引物探针设计原则设计多组PCR引物探针并进行筛选，得到最佳组合；

2)三重实时荧光定量PCR反应条件的确定：对多重实时荧光定量PCR扩增的反应体系和条件进行优化；

3)对确定的检测方法进行验证，包括敏感性、特异性、重复性等。

实施例1：三重实时荧光定量PCR引物及探针组合筛选

1.首先从NCBI检索胞内劳森菌完整aspA基因序列、C型产气荚膜梭菌完整β毒素基因序列、猪痢疾短螺旋体完整Hypothetical Protein基因序列，然后将所有序列下载后导入CLC Genomics Workbench进行比对，分析每个基因的保守序列，从保守度高的序列处设计引物，每条引物最多允许有一个碱基错配，根据三重实时荧光定量PCR引物探针设计原则，共设计出三组引物探针，共9对(分别编号1-9，编号1-3为第一组，编号4-6为第二组，编号7-9为第三组)，每对均由一个上、下游引物和一个TaqMan探针组成，见表1。

表1：三重实时荧光定量PCR引物和探针

2.三重实时荧光定量PCR引物筛选

(1)三个基因重组表达质粒的制备

从NCBI检索胞内劳森菌完整aspA基因序列、C型产气荚膜梭菌完整β毒素基因序列、猪痢疾短螺旋体完整Hypothetical Protein基因序列后下载并从每个序列的两端设计引物，扩增出完整的序列后将序列连接到pMD19-T载体并导入大肠杆菌，挑选阳性菌落扩大培养提取质粒。

(2)表达质粒的混合(不同浓度模版的配制)

用K5800/C/H/T超微量分光光度计测定提取标准质粒的浓度，计算单位体积质粒所含DNA的拷贝数，然后将三种质粒混合并稀释到三种质粒浓度均为10⁸-10⁰拷贝/μL的混合模版。

(3)三重实时荧光定量PCR扩增

反应体系：模板2μL、LI-q-F(10μmol/L)0.25μL、LI-q-R(10μmol/L)0.25μL、LI-P(10μmol/L)0.5μL、C-q-F(10μmol/L)0.25μL、C-q-R(10μmol/L)0.25μL、C-P(10μmol/L)1.5μL、B.hyo-q-F(10μmol/L)0.5μL、B.hyo-q-R(10μmol/L)0.5μL、B.hyo-P(10μmol/L)0.5μL、2×Probe qPCR Mix(with UNG)12.5μL、ROX 0.4μL、ddH₂O 5.6μL，总计25μL。

反应程序：25℃10min、95℃30s、95℃5s、54℃30s，其中95℃5s、54℃30s各循环45次。

3.试验结果

图1是分别用所设计的三组引物探针扩增浓度为10⁸拷贝/μL的LI、C.perfringens和B.hyo质粒混合模板的扩增曲线。从图1可以看出，当使用第一组引物探针时，第1号、2号、3号引物探针能够分别扩增出LI、C.perfringens和B.hyo三个基因且扩增曲线良好；当使用第二组引物探针时，4号引物探针虽然可以扩增出aspA基因，但其扩增曲线不如1号引物，5号、6号引物探针的扩增荧光信号不强；当使用第三组引物探针时，7号引物探针可以扩增出aspA基因，但与8号、9号引物探针存在干扰，导致β毒素基因、Hypothetical Protein基因无扩增曲线。

因此从准确性、特异性和灵敏性综合比较，确定第一组引物探针为三重实时荧光定量PCR最佳引物探针组并在此基础上优化反应体系和条件。

实施例2三重实时荧光定量PCR反应体系和条件的优化

三重实时荧光定量PCR的反应体系和反应条件影响二聚体、非特异性扩增以及扩增曲线，因此PCR的反应体系和条件对扩增效果也会产生一定影响，基于此，我们继续对三重实时荧光定量PCR的反应体系和条件进行了优化，选择扩增效率高，荧光信号强度强，Ct值小的为最佳体系。具体方法如下：

(1)首先确定最佳的退火温度范围，将上、下游引物Tm值之和除以二得到一个中间值，以此为参考将温度梯度分别设为51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃。在实验中将10⁵拷贝/μL为质粒混合模板加入反应体系，采用矩阵法进行梯度荧光定量PCR反应，以确定最佳退火温度。结果显示，在54℃时，LI的Ct值为20.35，C.perfringens的Ct值为21.17，B.hyo的Ct值为19.9，荧光信号强度较强，Ct值小，因此确定54℃为最佳退火温度。

(2)其次确定上下游引物和探针浓度，按照200-1000nmol/L的终浓度，以200nmol/L的间隔分别设置4个梯度，进行矩阵法优化。根据单重实时荧光定量PCR的最优体系为基础，先固定B.hyo和C.perfringens的反应体系，B.hyo的引物(10μmol/L)加入量为1μL，探针(10μmol/L)加入量为1μL，C.perfringens的引物(10μmol/L)加入量为0.8μL，探针(10μmol/L)加入量为0.8μL，以0.25μL、0.5μL、1μL、1.5μL的量将LI引物和探针交叉反应，寻找LI的最佳反应体系，见表2。结果显示LI最佳引物加入量为0.25μL，探针加入量为0.5μL。

表2：LI不同引物和探针量对应的LI、C.perfringens和B.hyo的Ct值

再以同样的方法固定LI和B.hyo的反应体系，LI的引物(10μmol/L)加入量为0.25μL，探针(10μmol/L)加入量为0.5μL，B.hyo的引物(10μmol/L)加入量为0.4μL，探针(10μmol/L)加入量为0.8uL，以0.25μL、0.5μL、1μL、1.5μL的C.perfringens引物和探针交叉反应，探索C.perfringens的最佳反应体系，见表3。结果显示C.perfringens最佳引物加入量为0.25μL，探针加入量为1.5μL。

表3：C.perfringens不同引物和探针量对应的LI、C.perfringens和B.hyo的Ct值

最后再摸索B.hyo的引物探针最优比例，LI的引物(10μmol/L)加入量为0.25μL，探针(10μmol/L)加入量为0.5μL，C.perfringens的引物(10μmol/L)加入量为0.25μL，探针(10μmol/L)加入量为1.5μL，以0.25μL、0.5μL、1μL、1.5μL的B.hyo引物和探针交叉反应，探索B.hyo的最佳反应体系，见表4。结果显示B.hyo最佳引物加入量为0.5μL，探针加入量为0.5μL。

表4：B.hyo不同引物和探针量对应的LI、C.perfringens和B.hyo的Ct值

最终确定最佳三重实时荧光定量PCR反应体系和条件如下：

表5三重实时荧光定量PCR最佳反应体系

三重实时荧光定量PCR扩增反应程序为：25℃10min、95℃30s、95℃5s、54℃30s，其中95℃5s、54℃30s各循环45次。

LI、C.perfringens和B.hyo三重实时荧光定量PCR的标准曲线，LI扩增效率为100.8％，C.perfringens扩增效率为110.074％，B.hyo扩增效率为100.788％。线性方程分别为Y(LI)＝-3.303X(LI)+40.846，Y(C.perfringens)＝-3.102X(C.perfringens)+40.462，Y(B.hyo)＝-3.303X(B.hyo)+42.625。

实施例3检测效果验证试验

1.特异性试验

使用三重实时荧光定量PCR的最佳反应体系和条件，进行特异性试验研究。分别以LI核酸，C.perfringens核酸，B.hyo核酸，大肠杆菌核酸，沙门氏菌核酸，金黄色葡萄球菌核酸，流行性腹泻病毒核酸，传染性胃肠炎病毒核酸，轮状病毒核酸，球虫核酸，双蒸水为模版进行扩增，验证三重实时荧光定量PCR的特异性。

试验结果表明建立的三重实时荧光定量PCR方法仅对LI，C.perfringens，B.hyo 3种细菌基因有阳性扩增信号，对大肠杆菌核酸，沙门氏菌核酸，金黄色葡萄球菌核酸，流行性腹泻病毒核酸，传染性胃肠炎病毒核酸，轮状病毒核酸，球虫核酸，双蒸水均未检测到荧光信号，表明建立的三重实时荧光定量PCR方法特异性好。

2.敏感性试验

(1)对质粒的检测敏感性

使用三重实时荧光定量PCR的最佳反应体系和条件，扩增制备好的不同拷贝数(10⁸-10⁰拷贝/μL)的混合质粒模版，进行敏感性试验，结果见图2-4，对质粒的最低检测限度为LI：10¹拷贝/μL(图2)，C.perfringens：10⁰拷贝/μL(图3)，B.hyo：10⁰拷贝/μL(图4)。

(2)对菌液的检测敏感性

首先制备不同浓度菌液核酸模版，将三种细菌分别提取核酸，并测定每种细菌的核酸浓度。将三种细菌的核酸浓度均稀释为90ng/μL，然后将三种细菌的核酸按照1:1:1比例混合，得到每种细菌核酸浓度为30ng/μL的模版。再对此模版进行10倍梯度稀释，最终得到浓度为30ng/μL，3ng/μL，300pg/μL，30pg/μL，3pg/μL，0.3pg/μL的混合模版。使用最佳反应体系和反应条件，扩增制备好的不同浓度的菌液混合核酸模版。结果见图5-7，本发明的三重实时荧光定量PCR对LI菌液核酸的检出限度为300pg/μL(图5)，C.perfringens，B.hyo两种菌液核酸的检出限度为30pg/μL(图6，7)。

另外，使用CN 115058528A中公开的引物并设计相应的探针，制备不同浓度菌液核酸模版，将三种细菌分别提取核酸，并测定每种细菌的核酸浓度。将三种细菌的核酸浓度均稀释为30ng/μL，然后按照1:1:1比例混合，得到每种细菌核酸浓度为10ng/μL的模版。再对此模版进行10倍梯度稀释，最终得到浓度为10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL的混合模版。按照以下条件进行检测，结果见图8，该方法对LI，C.perfringens，B.hyo三种核酸的检出限度为1ng/μL。

LI引物及探针：

LI-F：5'-CCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTC-3'

LI-R：5'-TCTAGAGTGCCCAACTTTACTTGATG-3'

LI-P：ROX-CGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAG-BHQ2

C.perfringens引物及探针：

Cp-F：5'-GCAGAGGAAAGAAAAGAACAGTA-3'

Cp-R：5'-ACCTCTTGCATATTCTTTTGACC-3'

Cp-P：HEX-AAAATAAACACAGTAGGTTGC-BHQ1

B.hyo引物及探针：

BH-F：5'-GGAATGTGGGAGAGATTGATCAA-3'

BH-R：5'-TCGGCAGATCTTTGGTATAAATGA-3'

BH-P；CY5-ATCTTCCTCCATGCCATATGATGTGCCA-BHQ3

反应体系：

反应程序：

50℃2min、93℃2min、93℃15s、56℃30s，其中93℃15s、56℃30s各循环40次。

3.重复性试验

将培养的不同批次的三种细菌分别提取核酸后混合，使用三重实时荧光定量PCR最佳反应体系和条件检测10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL的混合质粒，计算组内与组间变异系数。重复性检测结果显示，不同稀释梯度的质粒标准品批内和批间重复性试验Ct值的变异系数在4以下，表明重复性良好(见表6)。

表6三重实时荧光定量PCR重复性试验结果

4.临床样品检测

(1)单重荧光定量PCR临床样品检测结果

通过对226份临床粪便样品进行单重荧光定量PCR检测，检出LI阳性样品73份(检出率32.30％)，C.perfringens阳性样品41份(检出率18.14％)，B.hyo阳性样品29份(检出率12.83％)(见表7)。

表7单重荧光定量PCR方法临床样品检测结果

(2)三重荧光定量PCR临床样品检测结果

通过对226份临床粪便样品进行三重荧光定量PCR检测，检出LI阳性样品69份(检出率30.53％)，C.perfringens阳性样品41份(检出率18.14％)，B.hyo阳性样品29份(检出率12.83％)。其中LI和C.perfringens共同被检出有4份，LI和B.hyo共同被检出有20份，C.perfringens和B.hyo共同被检出有4份，LI、C.perfringens和B.hyo共同被检出有10份(见表8)。

表8三重荧光定量PCR方法临床样品检测结果

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种多重实时荧光定量PCR引物探针组，其特征在于由三组分别针对三种猪细菌性腹泻病原的引物和探针组成，所述三种猪细菌性腹泻病原为胞内劳森菌、C型产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体，所述引物和探针的序列如下：

第一组，针对胞内劳森菌aspA基因设计的引物探针，上游引物序列如SED ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；

第二组，针对C型产气荚膜梭菌β毒素基因设计的引物探针，上游引物序列如SED IDNO:4所示，下游引物序列如SEQ ID NO:5所示，探针序列如SEQ ID NO:6所示；

第三组，针对猪痢疾短螺旋体Hypothetical Protein基因设计的引物探针，上游引物序列如SED ID NO:7所示，下游引物序列如SEQ ID NO:8所示，探针序列如SEQ ID NO:9所示。

2.如权利要求1所述的多重实时荧光定量PCR引物探针组，其特征在于：所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

3.如权利要求2所述的多重实时荧光定量PCR引物探针组，其特征在于：所述第一组探针的荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；所述第二组探针的荧光基团为Cy3，荧光淬灭基团为BHQ1；所述第三组探针的荧光基团为Hex，荧光淬灭基团为BHQ1。

4.权利要求1-3任一项所述的多重实时荧光定量PCR引物探针组在非诊断目的检测猪细菌性腹泻病原中的应用。

5.权利要求1-3任一项所述的多重实时荧光定量PCR引物探针组在制备检测猪细菌性腹泻病原的试剂盒中的应用。

6.一种检测猪细菌性腹泻病原的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1-3任一项所述的多重实时荧光定量PCR引物探针组。

7.一种非诊断目的检测猪细菌性腹泻病原的方法，其特征在于：包括向反应体系中加入权利要求1-3任一项所述的引物探针组并进行多重实时荧光定量PCR扩增的步骤。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述反应体系如下：

9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为：25℃反应10min，95℃预变性30s；95℃变性5s，54℃退火及延伸30s，循环45次。