CN105886622A - 一种用于空肠弯曲菌快速分型的引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物分子分型领域，尤其涉及一种用于空肠弯曲菌快速分型的引物及方法。本发明提供的用于空肠弯曲菌快速分型的引物，包括13对空肠弯曲菌引物。本发明提供的用于空肠弯曲菌快速分型的引物具有更好的分型能力和更高的分辨指数，可以对空肠弯曲菌进行更精确的分型。此外，本发明提供的用于空肠弯曲菌快速分型的方法具有操作简便快捷、稳定性和可重复性好的优点，可以有效的辅助空肠弯曲菌感染疾病的临床诊断，是一种较为理想的空肠弯曲菌分型方法。
Description
技术领域
本发明属于微生物分子分型领域，尤其涉及一种用于空肠弯曲菌快速分型的引物及方法。
背景技术
弯曲菌是一类重要的食源性人兽共患病原菌，可引起人和动物胃肠道感染，早在1980年，世界卫生组织已将弯曲菌肠炎列为最常见的肠道传染病之一，其中空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是弯曲菌感染中最常见的一个种，约占80-90％。
近年来，空肠弯曲菌感染率在世界各地普遍呈上升趋势。在欧美发达国家的感染率为50-100/10万，引起的腹泻病例数甚至超过了沙门氏菌和志贺氏菌，居于第一位。此外，空肠弯曲菌还可引发格林巴利综合症(Guillain-Barre symdrome，GBS)、急性神经肌肉瘫痪和反应性关节炎等疾病。其中，GBS是空肠弯曲菌感染后最严重的并发症，可导致呼吸肌麻痹而死亡。空肠弯曲菌广泛分布于自然界及家畜、家禽的肠道内，虽然该菌在食物中不容易生长繁殖，但其感染所需剂量低，大约摄入400-500cfu便可引发肠道感染，这对畜禽食品安全和人类健康造成了严重的威胁。因此，对空肠弯曲菌的检测研究已成为当前研究的热点。
中国专利申请201110276557.4公开了一种空肠弯曲杆菌PCR检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括一对针对空肠弯曲杆菌马尿酸酶(Hip0)基因的保守区域设计的特异性引物，对空肠弯曲杆菌具有较高的检测灵敏度。中国专利申请201510573715.0公开了一种检测空肠弯曲菌的方法及其单抗，该方法是利用抗空肠弯曲菌的单克隆抗体与空肠弯曲菌特异性结合，从而可以快速检测出空肠弯曲菌。但是，上述方法仅可以检测出空肠弯曲菌，无法对空肠弯曲菌进行进一步的分型，无法满足临床诊断的需求。
由于空肠弯曲菌的抗原结构较复杂，其抗原分型尚未完全确定，目前我国已报道的空肠弯曲菌分离菌株共有57个血清型，其中人源菌株常见有10个血清型。随着近年分子生物学 及相关技术的迅猛发展，使基于其基础上的各种空肠弯曲菌基因分型方法不断推陈出新，并因其分辨力、分型率和敏感性高于表型分型方法而越来越受到人们的广泛重视。空肠弯曲菌的基因分型方法主要包括脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)、限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)等。PFGE方法分辨力高，重复性好，是目前所有分型方法中的金标准，但耗时长，费用高，且需要特定的仪器设备。RFLP技术可以区分不同的基因型，但该方法分辨力不高，检测周期相对较长。RAPD技术使用一系列具有10个碱基左右的单链随机引物，对全基因组DNA进行PCR扩增，以检测其多态性，该方法具有成本低，速度快、易于操作的优点，但重复性较差，影响因素较多。
扩增基因间片断多态性(Amplified intergenic locus polymorphism，AILP)技术作为一种最新的分子分型技术在2005年建立。AILP技术对细菌分型仅需知道该菌种的全基因组或部分基因组序列，粗提DNA即可做为PCR扩增的模板，该技术操作简便，在保证分型结果具有较好的稳定性、可重复性和较高分辨率的同时可以大大节约时间与成本。但是，目前，尚未见有AILP技术应用于空肠弯曲菌基因分型的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于空肠弯曲菌快速分型的引物及方法，以弥补现有空肠弯曲菌分型技术中的不足。
本发明提供了一种用于空肠弯曲菌快速分型的引物，包括以下13对空肠弯曲菌引物：
针对mnmA基因的上游引物CJF1：5’-TTTCTCCGTAGTTGGGTCC-3’(SEQ ID NO.1)和下游引物CJR1：5’-GGTGCTTTGCCTTATCGTG-3’(SEQ ID NO.2)；针对trpC基因的上游引物CJF2：5’-AGGAACAAGCAAAGTAGGTGG-3’(SEQ ID NO.3)和下游引物CJR2： 5’-AGCCATTCTAAGTCCAAAGC-3’(SEQ ID NO.4)；针对rpmH基因的上游引物CJF3：5’-TATCCCAAGATGGTAAAAGCA-3’(SEQ ID NO.5)和下游引物CJR3：5’-CACCCCATTGGATAACAGAG-3’(SEQ ID NO.6)；针对acs基因的上游引物CJF4：5’-TGCTACAGGCACAGGAAAA-3’(SEQ ID NO.7)和下游引物CJR4：5’-AAGCTGAGTCGCATAAGAAAA-3’(SEQ ID NO.8)；针对ansA基因的上游引物CJF5：5’-GGAAACAACCCAGACTACCA-3’(SEQ ID NO.9)和下游引物CJR5：5’-GACTAACCCTACGATGACGAG-3’(SEQ ID NO.10)；针对ppk基因的上游引物CJF6：5’-TGAAGCAAGTATGGAAGGAGT-3’(SEQ ID NO.11)和下游引物CJR6：5’-AGATGAGCGAAGTAGGGTGA-3’(SEQ ID NO.12)；针对metB基因的上游引物CJF7：5’-GCGACATTATCTCCCGAACT-3’(SEQ ID NO.13)和下游引物CJR7：5’-AGGCTTAGGCTTGAACTGC-3’(SEQ ID NO.14)；针对surE基因的上游引物CJF8：5’-CTTGGTGGAGTGGGTGGAA-3’(SEQ ID NO.15)和下游引物CJR8：5’-CAGAAGTGGGAGATAARGTGA-3’(SEQ ID NO.16)；针对rplT基因的上游引物CJF9：5’-GTCATTCAAACTCCCCTCTG-3’(SEQ ID NO.17)和下游引物CJR9：5’-GCTGGAAAACTTGGTCGTG-3’(SEQ ID NO.18)；针对dnaB基因的上游引物CJF10：5’-AGGTGAAGAAATGGAAAGGG-3’(SEQ ID NO.19)和下游引物CJR10：5’-GCCGCTGAAATACATAAAGAA-3’(SEQ ID NO.20)；针对arsR基因的上游引物CJF11：5’-AGGGAACTTGGGCGTATTA-3’(SEQ ID NO.21)和下游引物CJR11：5’-CCATCGTTTGCTTTTGTATTT-3’(SEQ ID NO.22)；针对ksgA基因的上游引物CJF12：5’-AGTGCAGGGGAGATAGTYG-3’(SEQ ID NO.23)和下游引物CJR12：5’-AAGCATCAAAAGCATAAGAGG-3’(SEQ ID NO.24)；针对tonB基因的上游引物CJF13：5’-GCTTGACACTGCTACTTGGAT-3’(SEQ ID NO.25)和下游引物CJR13： 5’-TTCTATGCCTTGATTTTCTGC-3’(SEQ ID NO.26)。
进一步地，所述空肠弯曲菌的上游引物与下游引物的浓度比为1∶1。
进一步地，所述mnmA靶基因间隔片断的长度为201bp，trpC靶基因间隔片断的长度为253bp，rpmH靶基因间隔片断的长度为315bp，acs靶基因间隔片断的长度为436bp，ansA靶基因间隔片断的长度为500bp，ppk靶基因间隔片断的长度为3170bp，metB靶基因间隔片断的长度为637bp，surE靶基因间隔片断的长度为1270bp，rplT靶基因间隔片断的长度为823bp，dnaB靶基因间隔片断的长度为923bp，arsR靶基因间隔片断的长度为1176bp，ksgA靶基因间隔片断的长度为2545bp，tonB靶基因间隔片断的长度为1763bp。
另外，本发明还提供了一种用于空肠弯曲菌快速分型的方法，包括如下步骤：
S1应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取待测标本中的细菌基因组DNA；
S2以待测标本中的细菌基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的13对空肠弯曲菌引物分别进行PCR扩增；
S3将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
进一步地，所述步骤S1中待测标本中的细菌基因组DNA提取后的浓度为10-200ng/μl。
进一步地，所述步骤S2中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：94℃5min；阶段2：94℃30s；阶段3：51℃30s；阶段4：72℃2min；阶段5：72℃7min；阶段2-阶段4循环35次；在4℃贮存。
除此之外，本发明还提供了所述的用于空肠弯曲菌快速分型的引物在制备用于快速分型空肠弯曲菌试剂盒中的应用。
本发明提供的用于空肠弯曲菌快速分型的方法：是利用空肠弯曲菌全基因组核酸序列基因间隔片断中相似度较低的基因间隔区域为靶序列，根据所有引物间的退火温度差在3℃以内，PCR产物长度为100-3500bp，分别设计出13对空肠弯曲菌引物。使用这13对空肠弯曲 菌引物分别对待测菌株进行PCR扩增，依据所有扩增产物琼脂糖凝胶电泳后呈现条带的数目及位置的多态性可达到对空肠弯曲菌分型的目的。
本发明提供的用于空肠弯曲菌快速分型方法的结果判定方法是：对PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图的条带数目和产物DNA片段长度进行分析，对于不同株的空肠弯曲菌13组PCR产物琼脂糖凝胶电泳图完全一致的判断为相同的基因型。
本发明提供的用于空肠弯曲菌快速分型的引物具有较好的分型能力和较高的分辨指数，可以对空肠弯曲菌进行精确的分型。将本发明提供的13对空肠弯曲菌引物采用相同的扩增反应条件，可一次性完成13个不同引物对的PCR反应，观察凝胶电泳图呈现条带的数目及位置可达到对空肠弯曲菌的分型，该方法具有操作简便快捷、特异性好和准确度高的优点，可以有效的辅助空肠弯曲菌感染疾病的临床诊断。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的用于空肠弯曲菌快速分型的引物具有更好的分型能力和更高的分辨指数，可以对空肠弯曲菌进行更精确的分型。此外，本发明提供的用于空肠弯曲菌快速分型的方法具有操作简便快捷、特异性好的优点，可以有效的辅助空肠弯曲菌感染疾病的临床诊断，是一种较为理想的空肠弯曲菌分型方法。
具体实施方式
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
实施例1、引物
本发明提供的用于空肠弯曲菌快速分型的引物。
表1 本发明提供的引物
实施例2、空肠弯曲菌各靶基因间隔片断的长度
本发明提供的mnmA靶基因间隔片断的长度为201bp，trpC靶基因间隔片断的长度为253bp，rpmH靶基因间隔片断的长度为315bp，acs靶基因间隔片断的长度为436bp，ansA靶基因间隔片断的长度为500bp，ppk靶基因间隔片断的长度为3170bp，metB靶基因间隔片断的长度为637bp，surE靶基因间隔片断的长度为1270bp，rplT靶基因间隔片断的长度为823bp，dnaB靶基因间隔片断的长度为923bp，arsR靶基因间隔片断的长度为1176bp，ksgA靶基因间隔片断的长度为2545bp，tonB靶基因间隔片断的长度为1763bp。
表2 空肠弯曲菌靶基因间隔片断的长度
实施例3、一种用于空肠弯曲菌快速分型的方法
1、空肠弯曲菌基因组DNA的提取：
取待测的36株空肠弯曲菌，分别在血琼脂平板培养基上密集划线，置于5％O2、10％CO2和85％N2的微需氧条件下，37℃增菌培养24-48h后，刮取培养基上全部菌落至2ml ddH2O中，涡旋振荡混匀后再于10000rpm离心2min，弃其上清液，按照Takara公司的细菌基因组DNA小量纯化试剂盒进行操作，分别提取36株空肠弯曲菌基因组DNA，提取后的DNA浓度为10-200ng/μl。所得的基因组DNA在检测前于-20℃保存备用。
2、待测菌株不同基因间隔片断的PCR扩增：
以本发明实施例1提供的空肠弯曲菌基因分型的13对空肠弯曲菌引物，分别对36株待测菌株中的13个靶基因间隔片断进行PCR扩增：
2.1、扩增体系为25μl：在PCR反应管中分别加入反应液22μl，其组成均包括：2.5μl10×Taq DNA Polymerase Buffer，0.5μl 10mM dNTPs，0.15μl 5U/μl Taq DNA Polymerase，17.85μl ddH2O和1μl待检模板；然后再于相应管中分别加入10μM的两条引物各1.5μl；
2.2、将上述各PCR管混匀稍离心后置于PCR仪上进行以下反应：①94℃预变性5min，②94℃变性30s，③51℃退火30s，④72℃延伸2min，⑤72℃延伸7min，其中②-④步循环35次。3、PCR产物的电泳检测：
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取3μl扩增产物与0.5μl上样缓冲液混匀后点样于含0.5mg/L GoldView的1.5％琼脂糖凝胶孔中，100V电泳45min后置于凝胶成像系统中成像，观察PCR扩增产物条带情况，以实施例2的靶基因间隔片断的长度进行结果判断。结果如表3所示：
表3 36株空肠弯曲菌PCR产物及基因型
如表3所示：0代表没有出现扩增产物，1代表扩增产物长度与靶基因间隔片断预期长度相同，1a-1h分别代表扩增产物电泳条带为1条，但产物长度与靶基因间隔片断预期长度不相同，且相互之间也不相同。2a和2b分别代表扩增产物电泳条带为2条，其中一个条带呈现的序列长度与靶基因间隔片断预期长度相同，另一个条带呈现的序列长度互不相同。3a和3b分别代表扩增产物电泳条带为3条，其中一个条带呈现的序列长度与靶基因间隔片断预期长 度相同，另外两个条带呈现的序列长度各不相同。
4、扩增产物的基因测序鉴定：
对出现电泳条带的菌株，采用上述方法重新进行PCR扩增，扩增体系按比例扩大至50μl，将PCR产物全部点样进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后切取凝胶上的条带，按照Takara公司的DNA凝胶回收试剂盒进行操作，分别回收所有PCR产物。将纯化的PCR产物分别与pGEM-T克隆质粒用T4连接酶连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α，挑取白色菌落进行PCR扩增鉴定，增菌后送广州英骏生物技术有限公司测序。按照表3所示的结果，将显示为1的PCR产物测序结果与美国国立卫生研究院GenBank数据库(DNA序列数据库)中的基因序列进行比对，结果与相应的靶基因间隔片断序列完全相同。将表3中显示为其它相同字符的PCR产物测序结果分组比对，同源性均达100％。显示了本发明提供的空肠弯曲菌引物的准确性。
5、AILP基因分型能力比较：
根据前期基因分型金标准PFGE分型的结果，待测的36株空肠弯曲菌分为21个基因型，如表3所示，根据表3中琼脂糖凝胶电泳图的条带数目和产物DNA片段长度，36株菌株中，13组PCR产物琼脂糖凝胶电泳图完全一致的判断为相同的基因型。
本发明提供的AILP方法可将这36株菌株分为24个基因型，其中CJ21和CJ22为不同的型，CJ32和CJ33为不同的型，但PFGE分型结果是CJ21和CJ22为相同的型，CJ32和CJ33为相同的型。两种分型方法对其它菌株的分型结果均一致。表明了本发明提供的基因分型方法比PFGE方法具有更好的分型能力。
6、AILP基因分型的分辨指数：
采用Hunter-Gaston分辨指数(Hunter-Gaston discriminatory index，HGDI)评价AILP基因 分型对空肠弯曲菌菌株的分辨能力，公式如下：
其中，N为实验菌株总数，S代表不同基因型的数目，nj代表第j个基因型的菌株数。
采用上述公式分别计算本发明提供的空肠弯曲菌基因分型检测引物组所对应的13个靶基因间隔位点、各种不同位点组合及PFGE基因分型的分辨指数，并从每类位点个数相同的组合中优选出分辨指数最高的位点组合，如表4所示。
表4 不同位点组合及PFGE基因分型分辨能力比较
由表4可知，本发明提供的空肠弯曲菌基因分型检测引物组所对应的13个位点可将36株空肠弯曲菌分为24个基因型，分型指数为0.968；表4第3行所示的8个位点也可将36株空肠弯曲菌分为24个基因型，分型指数同为0.968；表4第4-8行所示的2-7个位点可将36株空肠弯曲菌分为10-21个基因型，分型指数为0.832-0.954；单个位点呈现多态性最好的是 tonB，分型指数为0.706。证明本发明提供的AILP分型检测引物组分辨指数极高，最低优选7对引物对应的7个位点就可实现比PFGE分型更高的分辨指数。
7、AILP基因分型检测重复性的评价：
将待测36株空肠弯曲菌的AILP基因分型实验分别由不同的操作者使用不同的PCR仪重复3次，结果与表3显示的结果完全一致。证明本发明提供的分型方法具有很好的重复性。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东药学院
<120> 一种用于空肠弯曲菌快速分型的引物及方法
<130>
<160> 26
<170> PatentIn
version 3.3
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<400> 26
ttctatgcct tgattttctg c
21
Claims (7)
1.一种用于空肠弯曲菌快速分型的引物，其特征在于，包括以下13对空肠弯曲菌引物：针对mnmA基因的上游引物CJF1：5’-TTTCTCCGTAGTTGGGTCC-3’和下游引物CJR1：5’-GGTGCTTTGCCTTATCGTG-3’；针对trpC基因的上游引物CJF2：5’-AGGAACAAGCAAAGTAGGTGG-3’和下游引物CJR2：5’-AGCCATTCTAAGTCCAAAGC-3’；针对rpmH基因的上游引物CJF3：5’-TATCCCAAGATGGTAAAAGCA-3’和下游引物CJR3：5’-CACCCCATTGGATAACAGAG-3’；针对acs基因的上游引物CJF4：5’-TGCTACAGGCACAGGAAAA-3’和下游引物CJR4：5’-AAGCTGAGTCGCATAAGAAAA-3’；针对ansA基因的上游引物CJF5：5’-GGAAACAACCCAGACTACCA-3’和下游引物CJR5：5’-GACTAACCCTACGATGACGAG-3’；针对ppk基因的上游引物CJF6：5’-TGAAGCAAGTATGGAAGGAGT-3’和下游引物CJR6：5’-AGATGAGCGAAGTAGGGTGA-3’；针对metB基因的上游引物CJF7：5’-GCGACATTATCTCCCGAACT-3’和下游引物CJR7：5’-AGGCTTAGGCTTGAACTGC-3’；针对surE基因的上游引物CJF8：5’-CTTGGTGGAGTGGGTGGAA-3’和下游引物CJR8：5’-CAGAAGTGGGAGATAARGTGA-3’；针对rplT基因的上游引物CJF9：5’-GTCATTCAAACTCCCCTCTG-3’和下游引物CJR9：5’-GCTGGAAAACTTGGTCGTG-3’；针对dnaB基因的上游引物CJF10：5’-AGGTGAAGAAATGGAAAGGG-3’和下游引物CJR10：5’-GCCGCTGAAATACATAAAGAA-3’；针对arsR基因的上游引物CJF11：5’-AGGGAACTTGGGCGTATTA-3’和下游引物CJR11：5’-CCATCGTTTGCTTTTGTATTT-3’；针对ksgA基因的上游引物CJF12：5’-AGTGCAGGGGAGATAGTYG-3’和下游引物CJR12：5’-AAGCATCAAAAGCATAAGAGG-3’；针对tonB基因的上游引物CJF13：5’-GCTTGACACTGCTACTTGGAT-3’和下游引物CJR13：5’-TTCTATGCCTTGATTTTCTGC-3’。
2.如权利要求1所述的用于空肠弯曲菌快速分型的引物，其特征在于，所述空肠弯曲菌的上游引物与下游引物的浓度比为1∶1。
3.如权利要求1所述的用于空肠弯曲菌快速分型的引物，其特征在于，所述mnmA靶基因间隔片断的长度为201bp，trpC靶基因间隔片断的长度为253bp，rpmH靶基因间隔片断的长度为315bp，acs靶基因间隔片断的长度为436bp，ansA靶基因间隔片断的长度为500bp，ppk靶基因间隔片断的长度为3170bp，metB靶基因间隔片断的长度为637bp，surE靶基因间隔片断的长度为1270bp，rplT靶基因间隔片断的长度为823bp，dnaB靶基因间隔片断的长度为923bp，arsR靶基因间隔片断的长度为1176bp，ksgA靶基因间隔片断的长度为2545bp，tonB靶基因间隔片断的长度为1763bp。
4.一种用于空肠弯曲菌快速分型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取待测标本中的细菌基因组DNA；
S2以待测标本中的细菌基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的13对空肠弯曲菌引物分别进行PCR扩增；
S3将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
5.如权利要求4所述的用于空肠弯曲菌快速分型的方法，其特征在于，所述步骤S1中待测标本中的细菌基因组DNA提取后的浓度为10-200ng/μl。
6.如权利要求4所述的用于空肠弯曲菌快速分型的方法，其特征在于，所述步骤S2中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：94℃5min；阶段2：94℃30s；阶段3：51℃30s；阶段4：72℃2min；阶段5：72℃7min；阶段2至阶段4循环35次；在4℃贮存。
7.如权利要求1所述的用于空肠弯曲菌快速分型的引物在制备用于快速分型空肠弯曲菌试剂盒中的应用。
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