CN111020039A - 空肠弯曲杆菌种特异性分子靶标及其快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了空肠弯曲杆菌种特异性分子靶标及其快速检测方法，其中包括专用检测引物，检测靶标的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明公开的空肠弯曲杆菌种检测靶标可以用于检测食品等样品中的空肠弯曲杆菌。本发明公开专用检测引物：正向引物607F和反向引物607R。经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，若PCR产物出现目标条带(607bp)则说明样品中含有空肠弯曲杆菌，若PCR产物不含目标条带则说明样品中不含有空肠弯曲杆菌。本发明可有效检测出食品等样品中的空肠弯曲杆菌，且特异性强、准确性好、操作简单，可应用于食品安全等领域。

Description

空肠弯曲杆菌种特异性分子靶标及其快速检测方法
技术领域
本发明属于微生物检验技术领域，具体涉及空肠弯曲杆菌种特异性分子靶标及其快速检测方法。
背景技术
空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，是一种革兰氏阴性菌，微需氧，且是一种从20世纪80年代起就受到国内外广泛重视的人畜共患病菌，可进入肠道后侵入、定居和繁殖导致人类疾病，并且是一种食物源性病原菌，被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因。空肠弯曲杆菌产生的毒素可引发急性肠炎，例如发热、头痛、腹痛、腹泻、便血、恶心、呕吐等；严重者还会导致格林-巴利综合征(GBS)。在食品中，空肠弯曲杆菌对肉及肉制品污染率相对较高，其中，禽肉是带菌率最高的。有研究发现空肠弯曲杆菌在肉鸡盲肠的定殖高达2.55×108CFU/g,在其屠宰加工过程中肠内容物以及排泄物极易造成禽类食品的污染，人类食用被污染的禽类食品是感染空肠弯曲杆菌最主要的方式。弯曲菌病的患病率较高，根据欧盟食品安全局和欧洲疾控中心2017年的报告，对欧洲37个国家的人畜共患病检测，结果显示弯曲菌病是最常见的人兽共患病，在2016年被确诊的病例有246307例，每十万人中约66.3人被感染，比沙门氏菌感染率要高很多。因此，快速检测出食品中空肠弯曲杆菌的污染情况，对于监测食品安全意义重大。
目前空肠弯曲杆菌利用国标GB4789.9-2014进行检测和鉴定，这种方法结果较为准确，但操作复杂(预增菌、选择性培养、显色培养和生化鉴定等)，成本较高，且鉴定结果需要8天甚至更长的时间，这对于安全风险的控制极为不利。在国际上广泛使用ISO10272-1鉴定空肠弯曲杆菌，但其检测时间也在6-8天左右。而以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。ISO和FDA都有提到，可使用PCR对空肠弯曲杆菌检测，最短可以在1-2天内得出结论；且检测的成本较低，可以进行大批量的检测工作。而对现有技术的文献检索，一般使用部分保守的管家基因如：hipO，作为检测基因，也有针对毒力基因检测的方法替代传统生化鉴定。但尚未发现与本发明的空肠弯曲杆菌种特异性检测靶标及PCR检测方法相关的报道。
随着微生物全基因组测序技术的发展，基于全基因组序列比对分析，获得特异性分子检测靶标，可以开发简单快速、廉价高效、高灵敏可靠的PCR鉴定技术。本发明基于比较基因组学分析，获得一段目标序列，并设计专用引物进行特异性验证，将其作为空肠弯曲杆菌种属鉴定的特异性分子靶标。
发明内容
本发明旨在针对现有技术中空肠弯曲杆菌检测所需时间过长，检测成本过高，操作复杂，检测灵敏度低等缺点，提供用于鉴别空肠弯曲杆菌的特异性检测靶标及其相应的PCR检测方法。另外本发明是针对空肠弯曲杆菌的种属特异性分子检测靶标，能将空肠弯曲杆菌从弯曲杆菌属中区分出来。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于检测空肠弯曲杆菌种特异性分子标签，所述分子标签为DNA片段，所述分子标签编码如氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。
优选地，所述分子标签具有如(a)或(b)所示的核苷酸序列：
(a)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
(b)具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白。
本发明还提供了所述分子标签在制备检测空肠弯曲杆菌种试剂中的应用。
本发明还提供一组检测所述分子标签的引物，检测所述分子标签的上游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO:3，下游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种检测空肠弯曲杆菌种的试剂盒，包括如SEQ ID NO:3～4所示的核苷酸序列。
本发明还提供一种检测空肠弯曲杆菌种的方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测微生物的DNA，以提取的DNA为模板，采用本发明特异性引物对其进行PCR扩增；
(2)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果出现大小约607bp的条带则判定样品中含有空肠弯曲杆菌，若电泳结果未出现目标大小的条带则判定样品中不含有空肠弯曲杆菌。
优选地，所述PCR扩增反应体系为12.5μl，其中包括：0.5U/μl的Taq DNApolymerase 1μl、扩增缓冲液3.25μl、100mmol/L的MgCl2 1μl、10mmol/L(each)的dNTPs 1μl；正向和反向引物各1μl；DNA模板0.5μl；无菌双蒸水3.75μl。
优选地，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59.7℃退火1min，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
本发明的有益效果：本发明的检测方法所需时间短，只需将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳即可准确知道样品中空肠弯曲杆菌的污染情况，降低了检测成本；本发明是基于全基因组测序数据，通过泛基因分析得到的空肠弯曲杆菌种的种特异性靶标，检测结果更为可靠；同时本发明是针对空肠弯曲杆菌的种的特异性检测靶标，能将空肠弯曲杆菌种从弯曲菌属中区分出来，是一种新的检测方法。
附图说明
图1为使用本发明空肠弯曲杆菌的分子标签对70株空肠弯曲杆菌及2株结肠弯曲菌进行检测其结果示意图。
图2为使用本发明空肠弯曲杆菌的分子标签对非空肠弯曲杆菌进行检测其结果示意图(图中标号23为空肠弯曲杆菌，标号24为空白对照，其余均为非弯曲杆菌的其他致病菌，目标条带大小为607bp。)
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1空肠弯曲杆菌种特异性分子靶标的挖掘
主要根据泛基因组分析结果获得空肠弯曲杆菌特有的分子靶标。其中共选取150株空肠弯曲杆菌的全基因组数据(来自NCBI数据库)、66株非空肠弯曲杆菌的其他弯曲杆菌的全基因组数据(来自NCBI数据库)、65株空肠弯曲杆菌及2株结肠弯曲杆菌全基因组草图数据(菌株为本实验室保存并在本实验室完成测序)，泛基因组采用原核生物泛基因组自动化分析软件(Pan-Genomics Analysis Pipeline，PGAP)中的MP方法来分析，通过本地Perl脚本对分析结果进行处理，得到所有菌株的核心基因及非核心基因信息。之后选取空肠弯曲杆菌特有的基因，通过本地Blast比对剔除非特异性序列，经PCR扩增验证之后得到空肠弯曲杆菌种特异性检测靶标(泛基因组分析所用菌株种类及数量见表1)。
表1：泛基因组分析所用菌株种类及数量
Figure BDA0002345627170000041
实施例2空肠弯曲杆菌种特异性靶标快速检测方法的建立
根据序列SEQ ID NO:1设计一对特异性扩增引物，引物序列如下：
正向引物607F：5'-TGATTAATTTTTCTCAATTTT-3'，
反向引物607R：5'-CCATTAATTTTTAGTTGAGG-3'。
以本实验室从食品样品中分离得到的空肠弯曲杆菌(包括2株结肠弯曲杆菌)的基因组DNA为模板进行PCR验证。
PCR反应体系为12.5μl，其中包括：0.5U/μl的Taq DNA polymerase 1μl、扩增缓冲液3.25μl、100mmol/L的MgCl2 1μl、10mmol/L(each)的dNTPs 1μl；正向和反向引物各1μl；DNA模板0.5μl；无菌双蒸水3.75μl。
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59.7℃退火1min，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
使用琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.5％)进行PCR产物的检测，判断凝胶电泳检测扩增产物在607bp是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有空肠弯曲杆菌；如果没有出现相应单一扩增条带，则说明样品中不含有空肠弯曲杆菌。检测结果如表2和图1，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表2：空肠弯曲杆菌分子靶标检测方法建立的实验结果
Figure BDA0002345627170000051
Figure BDA0002345627170000061
实施例3空肠弯曲杆菌PCR检测方法特异性评估结果
取33株铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌等非弯曲杆菌进行空肠弯曲杆菌分子靶标特异性试验。按照DNA模板提取方法提取上述菌株基因组DNA，并按照实施例2所述方法进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如表3和图2所示，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表3：使用33株非弯曲菌属的致病菌进行特异性检验的结果
Figure BDA0002345627170000062
综上，本发明的分子标签对空肠弯曲杆菌种具有特异性，在常见致病菌中检测不出该分子标签，因此，分子标签可作为专门针对检测空肠弯曲杆菌的特异标签。扩增该分子标签的引物可形成检测空肠弯曲杆菌种的试剂盒。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心），广东环凯生物科技有限公司，广东环凯生物技术有限公司
<120> 空肠弯曲杆菌种特异性分子靶标及其快速检测方法
<130> 12.23
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1122
<212> DNA
<213> 合成
<400> 1
atgaaaaaat ggatttttat tgttttttgt tttatattag gttttattat tcatatattt 60
tatataggat acgctaacga acttttattt aataaattta ttaaaaatag caatcctgat 120
tatacaatta cagatattta cttcaaaaaa ggttttttaa cctctaaagg aagttttact 180
ttaaatcact ctcatacaca gctttcaacc aaaatcaacc ttaaatttaa taattatttt 240
ttcttaaata aaattataaa aggaaatttt acaaatcctt ttgatttttt agatgaagtg 300
ttaaaaaaca ataaattagg aacttttact ctcaaattac acgataataa ctctaaaata 360
tttctaaata ttaaagatat aaatttaagc aatgaaggcg gagataccat cataaacggc 420
ggatatattg aagttttaat gaataaaaat ttagaaatta aaaacatgaa aatacatttt 480
gatatgatta atttttctca attttatact aaatttgtat tacaaaattt aaattacgaa 540
caatttttta acaatcctgt acaattttat gagttaaatt tatttagcga tagccaacaa 600
gagatcaact ttgattatct tgtgctagat aacaataaaa tcaattcttt ttacagcaaa 660
aaccaagtaa attttaatga agaaaattca gcagtaaact taaacataca aggaaaatcc 720
aatgaaattg atcttaaatc tttattgggt cagaatttga attttgacaa aacaaaattt 780
aatataacca taaacaaatt ttttaattca aatttcaata tctctcattt tattcaaaaa 840
aatcttgatc taaaaataca aaatttaatc cttgaaaaaa ataaacaaaa tatcagttta 900
caaggcaatt taaatattaa caactcttat caagcaaaat tacaagttat cagttcagac 960
gagcctgatg aaatttttcc ttggacaaag gattatggag gtttaaatca atatttttta 1020
aaagaaaata ataacttttt tctaaattta tcttatgata gcttggccaa tcctcaacta 1080
aaaattaatg gtagtgaatt ttcaaatatg gatttaaatt aa 1122
<210> 2
<211> 373
<212> PRT
<213> 合成
<400> 2
Met Lys Lys Trp Ile Phe Ile Val Phe Cys Phe Ile Leu Gly Phe Ile
1 5 10 15
Ile His Ile Phe Tyr Ile Gly Tyr Thr Asn Glu Leu Leu Phe Asn Lys
20 25 30
Phe Ile Lys Asn Ser Asn Pro Asp Tyr Thr Ile Thr Asp Ile Tyr Phe
35 40 45
Lys Lys Gly Phe Leu Thr Ser Lys Gly Ser Phe Thr Leu Asn His Ser
50 55 60
His Thr Gln Leu Ser Thr Lys Ile Asn Ile Lys Phe Asn Asn Tyr Phe
65 70 75 80
Phe Leu Asn Lys Ile Ile Lys Gly Asn Phe Thr Asn Pro Phe Asp Phe
85 90 95
Leu Asp Glu Val Leu Lys Asn Asn Lys Leu Gly Thr Phe Thr Leu Lys
100 105 110
Leu His Asp Asn Asn Ser Lys Ile Phe Leu Asn Ile Lys Asp Ile Asn
115 120 125
Leu Ser Asn Glu Gly Gly Asp Thr Ile Ile Asn Gly Gly Tyr Ile Glu
130 135 140
Val Leu Met Asn Lys Asn Leu Glu Ile Lys Asn Met Lys Ile His Phe
145 150 155 160
Asp Met Ile Asn Phe Ser Gln Phe Tyr Thr Lys Phe Val Leu Gln Asn
165 170 175
Leu Asn Tyr Glu Gln Phe Phe Asn Asn Pro Val Gln Phe Tyr Glu Leu
180 185 190
Asn Leu Phe Ser Asp Ser Gln Gln Glu Ile Asn Phe Asp Tyr Leu Val
195 200 205
Leu Asp Asn Asn Lys Ile Asn Ser Phe Tyr Ser Lys Asn Gln Val Asn
210 215 220
Phe Asn Glu Glu Asn Ser Ala Val Asn Leu Asn Ile Gln Gly Lys Ser
225 230 235 240
Asn Glu Ile Asp Leu Lys Ser Leu Leu Gly Gln Asn Leu Asn Phe Asp
245 250 255
Lys Thr Lys Phe Asn Ile Thr Ile Asn Lys Phe Phe Asn Ser Asn Phe
260 265 270
Asn Ile Ser His Phe Ile Gln Lys Asn Leu Asp Leu Lys Ile Gln Asn
275 280 285
Leu Ile Leu Glu Lys Asn Lys Gln Asn Ile Ser Leu Gln Gly Asn Leu
290 295 300
Asn Ile Asn Asn Ser Tyr Gln Ala Lys Leu Gln Val Ile Ser Ser Asp
305 310 315 320
Glu Pro Asp Glu Ile Phe Pro Trp Thr Lys Asp Tyr Gly Gly Leu Asn
325 330 335
Gln Tyr Phe Leu Lys Glu Asn Asn Asn Phe Phe Leu Asn Leu Ser Tyr
340 345 350
Asp Ser Leu Ala Asn Pro Gln Leu Lys Ile Asn Gly Ser Glu Phe Ser
355 360 365
Asn Met Asp Leu Asn
370
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成
<400> 3
tgattaattt ttctcaattt t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成
<400> 4
ccattaattt ttagttgagg 20

Claims (8)

1.一种用于检测空肠弯曲杆菌种特异性分子标签，其特征在于，所述分子标签为DNA片段，所述分子标签编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。
2.如权利要求1所述的用于检测空肠弯曲杆菌种特异性分子标签，其特征在于，所述分子标签具有如(a)或(b)所示的核苷酸序列：
(a)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
(b)具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白。
3.如权利要求1或2所述的分子标签在制备检测空肠弯曲杆菌种试剂中的应用。
4.一组检测如权利要求1所述的分子标签的引物，其特征在于，检测所述分子标签的上游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO:3，下游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5.一种检测空肠弯曲杆菌种的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4所述的核苷酸序列。
6.一种检测空肠弯曲杆菌种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检测微生物的DNA，以提取的DNA为模板，采用如权利要求4所述的引物对其进行PCR扩增；
(2)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果出现大小约607bp的条带则判定样品中含有空肠弯曲杆菌，若电泳结果未出现目标大小的条带则判定样品中不含有空肠弯曲杆菌。
7.如权利要求6所述的检测空肠弯曲杆菌种的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系为12.5μl，其中包括：0.5U/μl的Taq DNA polymerase 1μl、扩增缓冲液3.25μl、100mmol/L的MgCl2 1μl、10mmol/L(each)的dNTPs 1μl；上游引物和下游引物各1μl；DNA模板0.5μl；无菌双蒸水3.75μl。
8.如权利要求6所述的检测空肠弯曲杆菌种的方法，其特征在于，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59.7℃退火1min，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
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