CN111154901B - 副溶血性弧菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了副溶血性弧菌特异性新分子靶标及其快速检测方法，本发明方法提供了用于鉴别副溶血性弧菌的20个新特异性分子检测靶标，可根据靶标分子设计相应的引物组，并通过对待检物进行PCR，分析PCR产物的电泳结果即得到是否存在副溶血性弧菌。与现有技术相比，本发明可用于检测某些生化反应不敏感的菌株，弥补生化鉴定的缺陷，同时本发明提供了副溶血性弧菌更多的特异性分子靶标，弥补常见毒力基因靶标检测区分度不足的缺陷，更加具有实用性；本发明方法还具有操作简单、检测结果特异性好，结果判定简单的优点，对于食品中的副溶血性弧菌识别具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于微生物检验技术领域，具体涉及副溶血性弧菌特异性新分子靶标及其快速检测方法。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种常见的食源性致病菌，已是我国引起食物中毒的首要因素。由于副溶血性弧菌嗜盐的特性，其主要分布在沿海和海洋水域等富盐的环境中，并附着在鳕鱼、沙丁鱼、鲭鱼、比目鱼、章鱼、虾、蟹、蛤蜊、龙虾、小龙虾、扇贝和牡蛎等海洋生物的体表生长。人们如果食用了被副溶血性弧菌污染的未煮熟的食物会引起食物中毒，其发病潜伏期一般为1～4天，引起以发热(约占中毒患者的27％)，恶心(71％)，呕吐(32％)，腹痛(82％)，腹泻(98％)等为主要症状的急性胃肠炎，严重者可发展成败血症，如若治疗不及时可引起死亡。
随着物流网络的日益完善，海产品市场流通愈加频繁，内陆地区的副溶血性弧菌检出也逐渐增多，因此该菌在我国乃至全球范围内呈现扩散趋势。由于消费者缺乏对海产品源致病菌危害的认识，会在不同程度上忽略食品加工操作的规范，例如生熟食加工和烹饪器皿的混合使用，这造成了不同类型食品的交叉污染。在对我国内陆水产市场中副溶血性弧菌的检测结果显示不同食品中该菌的检出率及致病性呈上升趋势：水产品中该菌的总污染率为68.78％，其中淡水产品的污染率高达32.78％，平均菌浓度为66.63MPN/g；罗非鱼为该菌最常污染的鱼类；海产品为36％，海虾中的检出率最高。对于非水产品中副溶血性弧菌的检出率分别为：猪肉4.81％、牛肉2.17％、鸡肉6.66％、鸭肉1.21％、禽蛋及其制品5.51％。河鲜、海鲜类产品不再是副溶血性弧菌的唯一携带者，食物链中越来越多的其他类型食品成为副溶血性弧菌感染人体的新媒介。近年来在我国由副溶血性弧菌引起的食物中毒案例已经超过沙门氏菌，居于由食源性致病菌引起的食源性疾病首位(副溶血弧菌毒力因子及致病机理的研究进展，市售海水产品副溶血性弧菌带菌状况调查)，在不同类型食品中广泛的开展副溶血性弧菌的危害分析和风险评估迫在眉睫。
副溶血性弧菌的检测主要利用国标规定的传统培养方法(GB 4789.7-2013)，该方法结果较为准确，检测时间较长(一周左右)、操作复杂(预增菌、选择性培养、显色培养、生化鉴定)、成本高，且灵敏度较低可能会出现漏检结果。以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。
目前，国内外PCR检测方法对上述副溶血性弧菌检测的分子检测靶标及引物已有一定的报道，通常采用副溶血性弧菌常见的特异性毒力基因tdh，tlh，trh，toxR和VP1332基因作为检测靶标。但是副溶血性弧菌的毒力基因与弧菌弧菌家族的其他物种均表现出不同程度的同源性，并且根据临床菌种测序结果统计发现不含有毒力基因的副溶血性弧菌依然对人体健康存在危害，因此通过毒力基因靶标还不能较好的实现副溶血性弧菌的精准筛查。根据我们目前已有报道的特异性、灵敏度高的基因靶标中十分少，难以满足实际检测的需要，基于原有的副溶血性弧菌分子靶标的精准鉴定面临了巨大的挑战；因此寻找新型特异性靶标分子用于副溶血性弧菌快速、精确检测具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是克服现有技术的不足，提供用于鉴别副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的特异性新分子靶标及其快速检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：本发明要求保护一组用于鉴别副溶血性弧菌的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1～20所示。
所述序列为通过生物信息学分析筛选得到，为副溶血性弧菌菌株的特异性基因片段。
进一步地，本发明还要求保护用于鉴别副溶血性弧菌的引物组，所述引物组为根据如SEQ ID NO.1～20所示核苷酸序列设计得到。
所述引物组对应的产物为SEQ ID NO.1～20所述核苷酸序列全部或部分序列。
通过根据相应的核苷酸序列设计对应的用于PCR的引物组，每一个引物组包括一条正向引物和一条反向引物，对应检测一个核苷酸序列。所述引物组扩增产物对应如SEQID NO.1～20所示核苷酸序列的全部或部分序列。
作为本发明的优选实施方式，所述引物组的核苷酸序列按5’到3’如SEQ ID NO.21～60所示；其中：
SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22为对应SEQ ID NO.1序列的引物组；
SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24为对应SEQ ID NO.2序列的引物组；
SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26为对应SEQ ID NO.3序列的引物组；
SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28为对应SEQ ID NO.4序列的引物组；
SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30为对应SEQ ID NO.5序列的引物组；
SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32为对应SEQ ID NO.6序列的引物组；
SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34为对应SEQ ID NO.7序列的引物组；
SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36为对应SEQ ID NO.8序列的引物组；
SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38为对应SEQ ID NO.9序列的引物组；
SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40为对应SEQ ID NO.10序列的引物组；
SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42为对应SEQ ID NO.11序列的引物组；
SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44为对应SEQ ID NO.12序列的引物组；
SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46为对应SEQ ID NO.13序列的引物组；
SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48为对应SEQ ID NO.14序列的引物组；
SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50为对应SEQ ID NO.15序列的引物组；
SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52为对应SEQ ID NO.16序列的引物组；
SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54为对应SEQ ID NO.17序列的引物组；
SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56为对应SEQ ID NO.18序列的引物组；
SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58为对应SEQ ID NO.19序列的引物组；
SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60为对应SEQ ID NO.20序列的引物组。
进一步地，本发明还要求保护所述引物组在鉴别副溶血性弧菌中的应用。
本发明还提供了用所述引物组鉴别副溶血性弧菌的方法，包括如下步骤：
S1：使用所述的引物组中的其中一种对待测样品DNA进行PCR扩增；
S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；
S3：观察扩增产物是否符合预期。
一般地，一个PCR体系中仅含有一组引物；可通过设置多个PCR体系，同时对单个菌的DNA使用不同引物进行扩增，提高检测效率。本发明的引物对应的产物特异性较好，通过观察扩增产物是否在预期位置即可判断是否存在所述副溶血性弧菌。
作为本发明的优选实施方式，所述S1中的PCR扩增体系包括PCR反应缓冲液、酶、MgCl2、dNTP、模板DNA、引物组和灭菌双蒸水。
作为本发明的优选实施方式，所述PCR扩增体系为10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mMMgCl2 2μL，2.5mMdNTP 1μL，Tag酶1U，模板DNA100ng，5μM引物各1μL，灭菌双蒸水补足体积至25μL。
作为本发明的优选实施方式，所述S1中的PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸45s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10min。
本发明公开了用于识别副溶血性弧菌的20种特异性分子靶标、相关的引物组，以及对应的PCR检测方法。与现有技术相比，本发明无需制备副溶血性弧菌单克隆抗体即可检测目标检测物是否存在副溶血性弧菌，降低了检测成本；同时本发明的检测方法提供了副溶血性弧菌更多的特异性分子靶标，弥补常见毒力基因靶标检测区分度不足的缺陷，更加具有实用性；本发明方法还具有操作简单、检测结果特异性好，结果判定简单的优点，对于食品中的副溶血性弧菌识别具有重要意义。
附图说明
图1为实施例3中副溶血性弧菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1副溶血性弧菌特异性新分子靶标的挖掘
根据GenBank数据库及本团队自测的副溶血性弧菌全基因组DNA序列，进行生物信息学分析；筛选得到副溶血性弧菌菌株特有的23个非必需基因，并进一步分析筛选得到20个副溶血性弧菌的特异性基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～20所示。
实施例2副溶血性弧菌的快速检测方法
1)引物设计
根据实施例1中的所述序列SEQIDNO.1～20设计特异性PCR扩增引物组(包括正向引物和反向引物)，引物组序列如下表1。
表1特异性PCR检测引物组
2)鉴别副溶血性弧菌的方法，步骤如下：
S1DNA模板制备：将待测菌株分别在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；
S2PCR扩增：使用所述的引物组1～20中的其中一种对待测样品DNA进行PCR扩增
①PCR检测体系：
②PCR扩增程序：
S3：取PCR扩增产物进行凝胶电泳；
S4：观察各引物组对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带。如果存在，说明样品中含有对应的副溶血性弧菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有对应的副溶血性弧菌。
实施例3PCR检测方法的特异性评价结果
取12株副溶血性弧菌，2株非目标弧菌(河流弧菌和创伤弧菌)，金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌等9株非副溶血性弧菌按照实施例2的方法进行PCR检测，其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。
所用各细菌的菌株及检测结果如下表2所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图1所示；其中，(1)～(20)分别为对应实施例1中序号分别为1～20的引物组，M为2000Maker，C为空白对照，1～23分别对应表2中的菌株。
表2本发明副溶血性弧菌检测特异性评价试验结果
| 序号 | 菌株名称 | 类型 | 菌株编号 | 菌株数 | 结果 |
| 1～12 | V.parahemolyticus | 副溶血性弧菌 | 食品源分离株 | 12 | + |
| 13 | V.vulnificus | 非目标弧菌 | 食品源分离株 | 1 | - |
| 14 | V.fluvialis | 非目标弧菌 | 食品源分离株 | 1 | - |
| 15 | P.vuigaris | 非副溶血性弧菌 | CMCC(B)49027 | 1 | - |
| 16 | S.aureus | 非副溶血性弧菌 | ATCC25923 | 1 | - |
| 17 | S.enteritidis | 非副溶血性弧菌 | CMCC50335 | 1 | - |
| 18 | S.typhimurium | 非副溶血性弧菌 | ATCC14028 | 1 | - |
| 19 | L.monocytogenes | 非副溶血性弧菌 | ATCC19115 | 1 | - |
| 20 | Y.enterocolitica | 非副溶血性弧菌 | CMCC52204 | 1 | - |
| 21 | E.coli | 非副溶血性弧菌 | ATCC25922 | 1 | - |
| 22 | E.Sakazakii | 非副溶血性弧菌 | ATCC29544 | 1 | - |
| 23 | S.flexneri | 非副溶血性弧菌 | ATCC12022 | 1 | - |
由图1和表2可得，20种检测方法均只有副溶血性弧菌显示出特异性扩增条带，其他弧菌及非弧菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。
实施例4副溶血性弧菌疑似菌株的检测
利用实施例1中的20种副溶血性弧菌PCR检测方法对385株从食品样品中分离的副溶血性弧菌疑似菌株进行检测，食品样品采集于广东省的超市及集贸市场，样品处理及疑似菌株的分离参见国标法；结果如表3。
表3本发明及16S rDNA对副溶血性弧菌疑似菌株的鉴定结果
| 菌株类型 | 本发明检测法 | 16SrDNA鉴定法 |
| 副溶血性弧菌 | 318 | 318 |
| 创伤弧菌 | \ | 29 |
| 拟态弧菌 | \ | 20 |
| 霍乱弧菌 | \ | 13 |
| 河流弧菌 | \ | 5 |
由表3可得，利用本发明方法，目标副溶血性弧菌检出菌株数为318株，并通过16SrDNA鉴定确证是目标副溶血性弧菌，其他疑似菌株经鉴定为创伤弧菌29株、拟态弧菌20株、霍乱弧菌13株、河流弧菌5株。通过本实施例说明本发明的20组不同引物PCR的检测方法可靠性高，可特异识别目标检测物中的副溶血性弧菌。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省微生物研究所
<120> 副溶血性弧菌特异性新分子靶标及其快速检测方法
<130> 2020
<160> 60
<170> PatentIn version 3.3
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atgtcagttt catgggatcc gtactatcaa aaagtcgctc aacaaccaca cagggtcaat 60
gtagaaaaag ccctacaatt tcacacatta gcagagaaaa ttgccgttga cgctggctgc 120
ggtacaggga gagactccaa ttttcttctc gcacaaggct ttcgtgttca cgcattcgac 180
agcaactcag atgcaataaa aacctgtgag acgcgttttt ctgaacagcc gaacttctcc 240
atctcgcaag cgtgtttcag cgattttgat taccctaagt gcaccctatt tattgctagc 300
gccagtctgt tcttttgtcc aaaagcgcac tttgaaaacg tgtggaatca aatcgattct 360
tctttgccat caggtggtgt tttctgcgga gactttttag gcgtaaacga ctcttgggtt 420
gattcaaact cgcatgctca tctaacctca ctcactcgcc agcaagtcga gcaatgtttt 480
gaaggctatg acatcgtctc catgcatgaa agagatgaag atggcaccac catagtcggg 540
acgcctaaac attggcatgt attcagcgtc acggcagtga aacgttaa 588
<210> 12
<211> 474
<212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 12
atgctcaaca atttacttac tgcatactat ggagaaatct acggtattgc ctttttcagt 60
cactatctca acaactacaa acaggcagag caacgcgcgc tttggcaaac tttagtcgac 120
gtggaaaaac tgaccgctga aaaactcaaa cctgttttgc aagcacatgg aatggagata 180
gaaaaccgtc atcaagaaat gatggaaaaa ggtctttccg atgcagaaaa gtggatcgat 240
ttaccttggt ccgagctggt tgccacgcta ctcaattggg ttgagccgta cgaagtgaca 300
taccgagaat ggcaaacact cgcgatagag aagaattcaa acgctgtcaa ttttcaaact 360
gcatttgatt tagtcgcaga acatgaaacc gccatttatc aatgttggca gcgttatcaa 420
gctaacgagt ctgggttgcc gattcttcat gcctttttgg caaaatatcg ttaa 474
<210> 13
<211> 393
<212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 13
atgaaagccg tgatttgtgg tgctgtgttg atgatggcta tttcgcttcc tactgtcgct 60
caagaagagc taaaagggtg tgatgccaaa gagtttgcac ttgagcagca aattgaatac 120
gccacagtac aaggtaatca aaagcgcatt gatggattaa aacgagccct tgctgcgatt 180
gaggatgaat gctcggaaga agatttacgc gaaaaactgc aagcagaagt cgaacaaaaa 240
gcgcaaaaag taaaagctcg cgagctagaa ttggcagagg cacaaacgtc gggttcgagc 300
gacaaaatcg agaaaaagcg ccgaaagtta gatgaagcgc aaaaagaatt gttagacgct 360
aaacgtgagt tggaatggaa ttacggccag tag 393
<210> 14
<211> 567
<212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 14
atgatcataa actacgccct gacaactgct ccttattcaa atgatattga atcatgtatc 60
aatgtaatga cagcgagtat gtttgctctt gtcgaccaag gagaagagac cgaagtcgct 120
acgtgtgact tttacatcgt agatttatcc agagcctcga gtactatcag ctgtcataaa 180
ttattgaaca taaacgccag cattgcccac tttatccaaa ttcttgatga tgattacttg 240
ctaaaagaaa gcatcgcaaa acgtaacgaa accatgcgtt ggggtgtctg tccagaacca 300
gatcgcctca ttgtgattca cgaactaaag gtaaagaaag agcatcgagg aaataagtat 360
tccaaagcct taattgagga ctttattgaa cgctttacat cgatttacga catcattggt 420
ctaaaggctc ttcctttaga agatcgctca gaggaaagcg tagaagcgct taaaagctat 480
tactcaaaga taggctttaa ggacgttggt attgatgatt tgatgctctg gccagcgtta 540
gaagaaccaa actggaacga agcctaa 567
<210> 15
<211> 513
<212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 15
atgagagtgt tgattgcgtc cacttggttt caactgtgct ggtttattgc tgtgcttggt 60
acgtttgagt ggcaatggtt gatgatgata ctggcgttgg cgactttggt gtattccatt 120
ctgacggcgt ttcactcggt gaaagcgatc tcctttgtca ccattttcgg gctagttctc 180
gatacgctaa atcaacactt cttgcttttg gttttcccta ccccttggct ccctgtgtgg 240
ttgattggtc tatgggtatt gtttgcatgg tatgcctacc aactgaaagt gcttttgtac 300
cgcttcgcca aaatctacgt atcaatatta ggtgggcttg gaggaatgct cagctacttc 360
gctggctaca agcttcaagc ggtagagttt ggattcgata caagtattac gttactggcc 420
ttgtttgtgg aatggttggt gttaatgctg gtgattctca aggtgtatga caatggcaag 480
cttaaagaga aaactcgtca ggggtatggg tag 513
<210> 16
<211> 560
<212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 16
ttgagcaccc tactctccaa tatcaagggg aggcgtttta tgaactacat atcaattttc 60
agagggcttg cgaccagtgt gtttgtcatg atacttggca caacaacatt acaggcaaaa 120
cctcatccgc aacattcggt gaaacccatt actcaaccgg gcaataagca ccacagtcat 180
cctgtaaatc gtccggagcg accgattcgg ccgccgcatc accatcgccc ttcacacgac 240
tacagaccac cttactacca tcgtccaccc gtcgtaataa gaccgccgcg ataccattcc 300
tctttcattt atgtgcgacc tggttattgg tatccacctt atcgtggtcg ttattactat 360
taccataacg atctggttgg catcgctacg tttgcgattt tcgctggagt aacctatgcc 420
attgtgcaag acgcctatta tcaacagcgc ggcagtcgtt acgtgtatgt ccaaaaccca 480
ccagccggaa attacacagt catcagtggt agtgatgttt tacctaactc agcgtcaaca 540
acaacgagct taagtactgt 560
<210> 17
<211> 312
<212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 17
atgtctaatg acatccaatc tgcacgcaac agccaaccca ttcacggatt ggagcaagta 60
gaacaacgtg aacttgcgcc acaaggaacg tttcaaggtc gcaaagtaac cctactctct 120
tcatcagaaa acaaacaggc acgcatgagc tcaaagcgag agctgagcga atgtttaaac 180
cagttcgcga gccttgaatc gtgcaatcaa gtgttggatt ttgaaaagcc aactggattt 240
gagaagcaaa gcgctgctat cgaaaagctt tttgagcgaa agatagatgt gattgctcga 300
agcgaaaagt aa 312
<210> 18
<211> 555
<212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 18
atgtctttta catggagaaa gaagatggac gcgaaaacga acaatgcaat ctcaaaatca 60
atgatgtttt tccattgggt tatcgggctt ggaatgattg cggtactcat ttctggtcta 120
gttatggatg atgaatcaaa caacttactt tttaatgctc acatgtcatt cggactttta 180
gtcttagcct tgagcgtgcc taggttagtt gggagactca ttgcgggtat gccaaaacct 240
atgactgaaa gaagtaaatt tgagtctatc gcggcggctg tggttatgta ctctcttttg 300
gccttaactg tggtgttgcc tttgtctggc atcgcggttt ctgtaggaga agggtacggc 360
ctgagcctgt ttggttttga attagtgagt tctggcagag aaatacacat gctgaaagag 420
ttgggcgagg ggatccacga gcttagtggt gaagcgttgt tgccattcct attggttttg 480
caccttggtg ccagctttat gcatcacttt attaagcagg acggaacgtt gctgagaatg 540
ttgggcaaag cttga 555
<210> 19
<211> 933
<212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 19
atgagcgccc caccaaaatc ttcaagtcga ttgccactgc atctcgattc cgaactctgc 60
tttgtattgc ctgattttct tgcgagagag tttgagtatg ctcgttcgtt agagcaaggg 120
atcatggata accttcaccc tgaatttaca catcaatatc gcgtcacgtt acgacgcatg 180
cgctctttat gcattttact cagcgaagtg attccctgtt ttgagttagc catcctcaag 240
cctcatttaa agacattaat gaaacaaacg aacttattgc gagacctaga tgtgttcact 300
ttagacacca atcagtatct tgcgatgttg ccagaacagc attcatcatt aacgcgcatt 360
ttcgcggata ttgatgccat gaagaatgct gaacaagtgc gcgtagcaag ttggttggca 420
tcacttgctt accaagcgca ttgcgctatg gttcgaaaca gccttgagcg aactaaacaa 480
tacgacttgc taaaaaacga cattgaatta gtgacgttcg caaatcaaaa gattgccgac 540
cagtttagaa aagtaaataa ctcacaaaga aaaatctcgc cagcgagtaa agacgatgtc 600
attcacgcat tacgcattaa atgcaaagca ctgcgctact tgctggagtg cttctctgct 660
ctctatcccg cgcaacaaca caaagaaaat gtgaagcaac ttaagctgct tcaagacaag 720
ctcggcgact tcaatgacac ttcgactcaa attgcgtttt tcacccagct ccgcaaagac 780
aaacgctaca acaaacaaga tcgccaagta ctcaaatctc tgattaagga aataaaacag 840
gctcatgagc aatctcggca atctacctta cttcgtctaa aaagttttga ttcatttatc 900
aatgacgctt ctacgttaga gatttaccgt taa 933
<210> 20
<211> 1536
<212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 20
ttggccgagg ggagagtcgc cgttggtgat atcaatatcc tggtcgttga tgactgttct 60
acatcatcac tgctagtgaa acaccaactc attgcattag gcgcaaaagc ttctaacatc 120
acttgcgtga ctaacacgca agcggccttg ctcgccgcaa aaactcgctt ttattccttc 180
ttagtgattg attaccatct tgcagaaaaa tatacaggtt tggatctcgt tcacctcctg 240
agcagagcac aactgatttc agacacaacc gctgtgctta tgatttctag cgatgccaca 300
aaagagacag ttctcacagc actttctagc tctgggcggg ttcgtcacct gctaacaaaa 360
ccccttcaaa caaaagcact ttacacgaaa atgctccaag cactgcaaga acaacagcac 420
attgccgctg taacaacaag actgctggct tcacaacctc tcttactatc tgatgtcatc 480
ttgcttcaca agacccacgc gtccagtatt tgtgttgaat ctctgattat cgatacttta 540
gttgaaagac gtgactacac actacttgag gattatttac ctctctgcag tcagaaagag 600
catgcaagta aagtatgtgc gaccgcgttt ttgttgcatc atcaaggcca catatctgaa 660
gcagtcaaag ttctggctga ttatgtaact cggaatccgc tctgcttggc tgccattgac 720
agtttgatcg gtctttatga aagcttgggg caacaacgac atgcgctctg tttggcaaaa 780
agagcttttt cgctcacgcc aagtaatggt tctcgttttc tctcagcatc ccgaattact 840
gccaagttgg gcctgtttga agatctctat gagctaggcc gtacctatgc agcccattta 900
tcacaaaccg atgcccaatg gcttaatgtc ctttcttctt acgttgattt agtcagcgac 960
cattttaaaa cgcttactca tattcatacc aagaggaaag tgcttgttca actgaatgaa 1020
ctctgtttac tcacgcaaaa gcagttgggt aaagagcagc aagtcagtct attagctttt 1080
aagcagctca tgcagtgcaa gctacttctc gtcgagtctc gcgcggcaga agcgcaccta 1140
aaattgctag agtcattgag ttacttttac gatattccaa cacaaatgcc gatagcatta 1200
ttgaaacaag cccttccgct attagcattt tttggtgagt tttctatcag acgcagcttg 1260
ctcggagtca tcaatcaatc gtgttcatca gtccgacttc aagagtgcaa tatcgtacca 1320
cacgaatacg actatccatt ttcagtagag acaaaactga acgctctggc agcgccggac 1380
caacaatacc attctaattc ggagtcggtg gttaacttcc taaaacaaag ggcattgcca 1440
ccaaattggt cgcgatggtt aagcgattat ctctctggtt ctttttctag ccagataccc 1500
gaaccgttta gctatcacat aaccgataga gagtga 1536
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
acgatgctcc acttatatga 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
attcacgctt agctctagat 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ttcatcttgt tcaccgcaca 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
caggcagtaa gtgaggattg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ttgccaacct taacgtctga 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acccttacgg tgaattgtct 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgattggctg ggtcatcgtc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ttaacaaagg cactgcatcg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tcaatacatg gacaatgacg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
taattgtcac cagctcgtta 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gtgcgtgctc ttcttattag 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tcgagcgtga ataaaccgat 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tgatgacgga ttttgctcac 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ctgattgttg agttggtcgt 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tgttacagag tttgagcatc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
actcaactca ttcaactgac 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
tcttggcatc gcactattgt 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gctttagcga gaccatgttg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ataatcatgc cagtttcagg 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
accaatacgg ttgtaacttg 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
aagtcgctca acaaccacac 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tggagacgat gtcatagcct 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cagtcactat ctcaacaact 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ccagactcgt tagcttgata 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ccacagtaca aggtaatcaa 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gtaattccat tccaactcac 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tgacaactgc tccttattca 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ttaggcttcg ttccagtttg 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
atgagagtgt tgattgcgtc 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
caccttgaga atcaccagca 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
gcaccctact ctccaatatc 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ttacaaaggt gactcaacga 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
taatgacatc caatctgcac 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ttcgagcaat cacatctatc 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
tggaatgatt gcggtactca 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
ggaatggcaa caacgcttca 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
actctgcttt gtattgcctg 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
ggtagattgc cgagattgct 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
gcttctaaca tcacttgcgt 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
agataatcgc ttaaccatcg 20
Claims (7)
1.核苷酸序列组合作为被检测靶标在非疾病诊断和治疗目的的鉴别副溶血性弧菌的应用，其特征在于，所述核苷酸序列组合如SEQ ID NO.1 - SEQ ID NO.20所示。
2.用于鉴别副溶血性弧菌的引物组，其特征在于，所述引物组为根据如权利要求1所述核苷酸序列组合设计得到；所述引物组的序列按5’到3’如SEQIDNO.21~60所示；其中：
SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22为对应SEQ ID NO.1序列的引物对；
SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24为对应SEQ ID NO.2序列的引物对；
SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26为对应SEQ ID NO.3序列的引物对；
SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28为对应SEQ ID NO.4序列的引物对；
SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30为对应SEQ ID NO.5序列的引物对；
SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32为对应SEQ ID NO.6序列的引物对；
SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34为对应SEQ ID NO.7序列的引物对；
SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36为对应SEQ ID NO.8序列的引物对；
SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38为对应SEQ ID NO.9序列的引物对；
SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40为对应SEQ ID NO.10序列的引物对；
SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42为对应SEQ ID NO.11序列的引物对；
SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44为对应SEQ ID NO.12序列的引物对；
SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46为对应SEQ ID NO.13序列的引物对；
SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48为对应SEQ ID NO.14序列的引物对；
SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50为对应SEQ ID NO.15序列的引物对；
SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52为对应SEQ ID NO.16序列的引物对；
SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54为对应SEQ ID NO.17序列的引物对；
SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56为对应SEQ ID NO.18序列的引物对；
SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58为对应SEQ ID NO.19序列的引物对;
SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60为对应SEQ ID NO.20序列的引物对。
3.如权利要求2所述引物组在非疾病诊断和治疗目的的鉴别副溶血性弧菌中的应用。
4.用于鉴别副溶血性弧菌的非疾病诊断和治疗目的的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：使用如权利要求2所述引物组对待测样品DNA进行PCR扩增；
S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；
S3：观察引物组中各引物对对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明待测样品中含有副溶血性弧菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则待测样品中不含有副溶血性弧菌。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中的PCR扩增体系包括PCR反应缓冲液、酶、MgCl2、dNTP、模板DNA、引物组和灭菌双蒸水。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液2.5 μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTP 1μL，Tag酶1U，模板DNA100ng，5 μM上下游引物各1 μL，灭菌双蒸水补足体积至25 μL。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中的PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸45 s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10 min。
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|---|---|
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