CN102534038A

CN102534038A - 一种空肠弯曲菌的高灵敏快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN102534038A
Application number: CN2012100459649A
Authority: CN
Inventors: 李烨; 王小元; 史锋; 徐洋
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-02-27
Filing date: 2012-02-27
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明提供一种可用于食源性病原菌空肠弯曲菌的高灵敏快速分子检测试剂盒，其中包括针对特异性检测靶基因flhA的、可用于环介导等温扩增靶序列的4条高特异性引物(2条内引物flhA-FIP/flhA-BIP和2条外引物flhA-F3/flhA-B3)，以及可进行环介导等温扩增靶序列的高效反应体系。同时，本发明还提供了一种应用所述试剂盒检测空肠弯曲菌的方法。运用本发明试剂盒和方法检测空肠弯曲菌，比PCR检测灵敏度高100倍以上，且对空肠弯曲菌检测具有高度的特异性。本发明提供的试剂盒和检测方法，不仅灵敏度高特异性强，而且操作简便、耗时短、成本低，为食品中空肠弯曲杆菌的检测提供了一种高效可靠、便捷实用的手段。

Description

一种空肠弯曲菌的高灵敏快速检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种空肠弯曲菌的高灵敏快速检测试剂盒，特别是涉及了一种应用环介导等温扩增技术在DNA分子水平上高灵敏特异性检测食源性病原菌空肠弯曲菌的方法。

背景技术

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是能够引起人类急性腹泻和肠胃炎的主要食源性病原菌，具有很强的致病性，人类饮用受污染的水、鲜奶、畜禽肉等都有可能感染该菌致病。加强对空肠弯曲菌的筛查和检测，是有效防控空肠弯曲菌污染、传播及致病的根本措施，而监测和防控食品和环境中空肠弯曲菌的关键是建立高灵敏、快速、简便易行的检测体系。

目前，包括我国在内的许多国家对食源性致病菌检测和鉴定仍主要沿用传统的检测方法(分离培养、生化鉴定等)，而传统的检测方法很难有效地对空肠弯曲菌这类难培养、易形成不可培养的休眠状态的致病菌进行灵敏检测，而且传统的检测方法特异性不高、灵敏度低、操作繁琐耗时，不能实现及时准确的监测。

将现代分子生物学技术应用于食源性致病菌检测，是发展新的快速、准确、低成本检测和鉴定食源性致病菌方法的最有效途径。以核酸为基础的分子检测方法以其特异性高、检测结果稳定以及省时省力的特点，在食源性致病菌检测中具有比传统方法更多的优越性，因而也得到了更广泛的研究。目前就分子水平检测空肠弯曲菌，国内外报道最多的是应用PCR技术的检测，已经研究出多重PCR、巢式PCR、荧光定量PCR等多种检测方法。但PCR采用加热变性双链DNA来促使下轮DNA的合成，其基本原理和对于温度循环的高要求使得PCR的应用受到了限制，不仅需要精密的仪器设备，而且会有非目标DNA序列的扩增，出现假阳性。如何克服PCR技术的不足，在DNA分子水平上快速、准确、灵敏地对空肠弯曲菌进行检测，是食品卫生检测的需要和发展趋势。此外，如何在疫病现场利用匮乏的检测条件进行快速检测也是一个刻不容缓的问题。

本发明通过环介导等温扩增检测食源性病原菌空肠弯曲菌，由此建立一种空肠弯曲菌的高灵敏快速检测试剂盒及其检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一套空肠弯曲菌高灵敏快速检测试剂盒，包括：

(1)针对特异性靶基因flhA(GeneBank基因登录号905174)设计并筛选出用于环介导等温扩增的四条高特异性引物，其序列分别为：

flhA-FIP 5′-ACCCTTGTACTACCTTTTGTTACAA-GTGGAAATATGGTCA-3′

flhA-BIP 5′-ACAAGCAAGATTTACACTTGATGC-GTCCTGCATTTAAATCCG-3′

flhA-F35′-GCATTTGGAGAATTTGTTGTTG-3′

flhA-B35′-TTGACGTCTTGCTCTAGC-3′。

(2)有效的环介导等温扩增反应体系，其中内引物和外引物的浓度比是关键。本发明建立的25ulLAMP反应体系中，内引物(flhA-FIP，flhA-BIP)与外引物(flhA-F3，flhA-B3)浓度比为8∶1。

LAMP反应体系(总体积25uL)：

2.5uL 10XThermopol reaction buffer(含Mg2+)，1uL Target DNA，2uL 10umol/L flhA-FIP，2uL10umol/L flhA-BIP，0.5uL 5umol/L flhA-F3，0.5uL 5umol/L flhA-B3，4uL 10mmol/l dNTPs，1uL 8UBstDNA polymerase large fragment，11.5uL ddH2O。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种应用所述试剂盒检测空肠弯曲菌的方法，其中反应温度是影响环介导等温扩增效果的重要反应条件，通过比较6个温度梯度(60，61，62，63，64，65℃)水浴中环介导等温扩增结果，最终以63℃水浴为最佳温度条件。应用所述试剂盒检测空肠弯曲菌步骤如下：

(1)提取细菌基因组DNA。

(2)混合LAMP反应体系：在无菌的微量离心管中加入2.5uL 10×buffer、2uL10 umol/LflhA-FIP、2uL 10 umol/L flhA-BIP、0.5uL5umol/L flhA-F3、0.5uL5umol/L flhA-B3、4uL10mmol/LdNTPs、1uLDNA模板、11.5uL的ddH2O，该步暂不加BstDNA polymerase largefragment。

(3)加热变性：将上述混合体系置95℃水浴5分钟，迅速插入冰中30秒。

(4)在混合体系中加入1uL8 U BstDNA polymerase large fragment(New England Biolabs)，完全混合。

5)LAMP扩增：将反应混合物置63℃水浴中60分钟，然后80℃水浴放置20分钟终止LAMP反应。

6)电泳分析LAMP扩增结果：取4uL扩增反应混合物，用2.0％琼脂糖凝胶电泳(GoldView染色)分析，紫外光下观察扩增结果。

本发明提供了一种可用于食源性病原菌空肠弯曲菌的高灵敏快速分子检测试剂盒，其中包括针对特异性检测靶基因flhA的、可用于环介导等温扩增靶序列的4条高特异性引物(2条内引物和2条外引物)，以及可进行高效环介导等温扩增靶基因的反应体系。同时，本发明还提供了一种应用所述试剂盒检测空肠弯曲菌的方法步骤。

附图说明

图1高特异性引物的筛选

1、3道为阴性对照，2道为ID-8号引物LAMP扩增结果，4道为ID-90号引物LAMP扩增结果，M道为DNA Marker。

图2灵敏度分析

(A)PCR检测空肠弯曲菌灵敏度

1-9道空肠弯曲杆菌ATCC33291模板DNA量分别是：83ng/uL、8.3ng/uL、8.3x10^-1ng/uL、8.3x10^-2ng/uL、8.3x10^-3ng/uL、8.3x10^-4ng/uL、8.3x10^-5ng/uL、8.3x10^-6ng/uL、8.3x10^-7ng/uL，10道为阴性对照，M道为DNAMarker。

(B)LAMP检测空肠弯曲菌灵敏度

图3LAMP法检测空肠弯曲菌的特异性分析

1道为空肠弯曲菌ATCC33291，2道为大肠杆菌，3道为阪崎杆菌ATCCBAA-894，4道为单增李斯特菌，5道为金黄色葡萄球菌ATCC25923，6道为阴性对照，M道为DNA Marker。

具体实施方法

实施例1：用于检测空肠弯曲菌的环介导等温扩增高特异性引物的设计和筛选

(1)从NCBI(美国国立生物技术信息中心)上获取空肠弯曲菌NCTC11168鞭毛合成相关基因flhA的核苷酸序列(GeneBank基因登录号为905174)；

(2)针对flhA的核苷酸序列，应用PrimerExploerV4软件设计LAMP扩增内引物和外引物，通过生物信息学分析，初步筛选到2套引物，编号ID-8和ID-90：

ID-8号引物：

D-90号引物：

(3)用初筛得到的引物ID-8和ID-90分别进行环介导等温扩增(模板DNA提取自空肠弯曲菌ATCC33291，25uLLAMP反应体系，63℃水浴60分钟)，取4uL扩增产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳(GoldView染色)，根据紫外光下电泳特征性梯形条带的有无，最终得到最有效的空肠弯曲菌LAMP扩增引物ID-8(见附图1)。

实施例2：检测空肠弯曲菌的灵敏度比较分析

(1)提取空肠弯曲菌ATCC33291基因组，用做模板DNA。

(2)以flhA-F3和flhA-B3为引物进行PCR扩增，以flhA-FIP、flhA-BIP、flhA-F3、flhA-B3为引物进行LAMP扩增，LAMP反应体系和反应条件同上述，25uLPCR反应体系如下：

PCR反应体系(总体积25uL)：

PCR反应程序：94℃预变性5分钟，然后进入以下循环：94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环后，72℃再延伸10分钟，4℃下保温。

(3)分别用1％和2％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外光下观察LAMP扩增和PCR扩增产物，结果显示，LAMP扩增灵敏度达8.3x10^-4ng，比PCR法检测高2个数量级(见附图2)。

实施例3：本发明提供的试剂盒和检测方法能高特异性检测空肠弯曲菌

(1)分别提取空肠弯曲菌ATCC33291、阪崎杆菌ATCCBAA-894、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌、单增李斯特菌基因组DNA。

(2)用上述基因组DNA为模板，用本发明设计的LAMP扩增引物、建立的LAMP反应体系和反应条件同时进行产物扩增，来检验反应的特异性。

(3)紫外观察2％琼脂糖凝胶电泳结果显示，只有空肠弯曲菌有LAMP扩增条带，大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、阪崎杆菌均呈现阴性，表明本发明提供的试剂盒和检测方法能够高特异的检测空肠弯曲菌(见附图3)。

Claims

1.一种空肠弯曲菌的高灵敏快速检测试剂盒，其特征在于包括检测靶点为空肠弯曲菌高度保守的鞭毛合成相关基因flhA，其核苷酸序列GeneBank基因登录号为905174；四条可环介导等温扩增靶序列的特异性引物、2条内引物flhA-FIP、flhA-BIP和2条外引物flhA-F3、flhA-B3，引物序列如下：

flhA-FIP 5′-ACCCTTGTACTACCTTTTGTTACAA-GTGGAAATATGGTCA-3′

flhA-BIP 5′-ACAAGCAAGATTTACACTTGATGC-GTCCTGCATTTAAATCCG-3′

flhA-F35′-GCATTTGGAGAATTTGTTGTTG-3′

flhA-B35′-TTGACGTCTTGCTCTAGC-3′。

2.应用权利要求1所述的试剂盒检测空肠弯曲菌的方法为：

(1)提取细菌基因组DNA；

(2)混合环介导等温扩增反应体系：在无菌的微量离心管中加入2.5uL 10×buffer、2uL 10umol/L flhA-FIP、2uL 10umol/L flhA-BIP、0.5uL5umol/L flhA-F3、0.5uL5umol/L flhA-B3、4uL10mmol/LdNTPs、1uLDNA模板、11.5uL的ddH2O；

(3)加热变性：将上述混合体系置95℃水浴5min，迅速插入冰中30秒；

(4)在混合体系中加入1uL8UBstDNA polymerase large fragment，完全混合。

(5)环介导等温扩增：将反应混合物置63℃水浴中60分钟，然后80℃水浴放置20分钟终止环介导等温扩增反应。

(6)电泳分析环介导等温扩增结果：取4uL扩增反应混合物，用2.0％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外光下观察电泳结果。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述环介导等温扩增反应体系为：