CN112080571A

CN112080571A - 基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法

Info

Publication number: CN112080571A
Application number: CN202011002123.0A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 黄钰; 张云增; 顾丹; 黄金林; 郁金燕; 薛寒; 徐晓萌
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2040-09-22
Also published as: CN112080571B

Abstract

本发明提供一种基于CRISPR‑Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法，所述方法利用CRISPR‑Cas12b系统检测靶标位点，所述靶标位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑3任一所示。本发明检测方法操作简单，检测时间短，对提取好的样品DNA进行检测，仅需在1小时以内即可出检测结果；对于实际样本菌液进行检测，只需要1‑2小时便可出检测结果：特异性强，灵敏度高，适用范围广。

Description

基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法。

背景技术

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是一种重要的食源性人畜共患病原菌。空肠弯曲菌可以引起人的腹泻、发热等症状，是细菌行胃肠炎的常见致病菌之一。空肠弯曲菌广泛存在于家禽、家畜以及鸟类的肠道内，在很多动物中属于正常携带细菌，能够通过食物链传递给人类，引起人类疾病。世界卫生组织已经将空肠弯曲菌列为最常见的食源性病原菌之一。空肠弯曲菌作为致病菌检测的一项重要指标，在公共卫生、食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中均是必需检测的项目，有重要社会、经济意义。

目前检测空肠弯曲菌采用的方法主要是传统的分离培养法，但由于空肠弯曲菌的培养条件较为苛刻，使得传统的分离培养法存在操作复杂、灵敏度低、特异性不强等弊端。因此，亟需开发一种快速精准的检测空肠弯曲菌的方法来满足现有的不足。

基于Cas12b蛋白开发的CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,Crispr-associated proteins)检测系统，是一种新型检测方法。利用Cas12b蛋白在sgRNA的引导下，识别匹配的目标序列后就会启动无差别的序列切割活性，即sgRNA和目标序列有单碱基的差异就不能激发其切割荧光探针的活性。CRISPR-Cas12b检测系统与传统的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)相比，对靶标的检测达到了单碱基的水平，可用于SNP位点分型，这就赋予了CRISPR-Cas12b更高的特异性。同时CRISPR-Cas12b检测系统不需要繁琐的操作步骤，只需将反应体系于48℃孵育30-35min，65℃灭活5min，将反应体系于485nm的蓝光下观察颜色是否变成绿色即可，整个检测过程可在1-2h左右完成。

目前尚未有关于利用CRISPR-Cas12b检测系统检测空肠弯曲菌报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法，用于解决现有技术中缺乏有效的空肠弯曲菌检测的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供了基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测方法，所述方法利用CRISPR-Cas12b系统检测靶标位点，所述靶标位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3任一所示。

进一步地，所述CRISPR-Cas12b系统利用Cas12b和sgRNA进行CRISPR检测，所述sgRNA以所述靶标位点为把靶序列进行设计。

所述sgRNA的设计原则为：在选取sgRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。

进一步地，所述sgRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4-6任一或几个所示的序列。

进一步地，所述方法还包括利用报告基因通过荧光显色技术显示检测结果。

进一步地，所述方法具体包括：

(1)体外转录纯化sgRNA；

(2)提取样品基因组DNA；

(3)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有CRISPR-Cas12b反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述CRISPR-Cas12b反应体系中含有针对空肠弯曲菌的设计的sgRNA序列；

(4)CRISPR-Cas12b反应：反应管置于PCR仪上，设置参数，进行PCR反应；

(5)CRISPR-Cas12b反应结束后，分析结果。

进一步地，步骤(4)中，CRISPR-Cas12b反应的条件设置为：(a)48℃ 30-35min；(b)65℃ 5min。

本发明的另一方面提供了一种用于检测空肠弯曲菌的CRISPR-Cas12b的检测试剂盒，所述试剂盒包括：Cas12b蛋白、sgRNA以及报告基因，所述CRISPR-Cas12b检测空肠弯曲菌的靶标位点如SEQ ID NO.1-3任一所示。

进一步地，所述CRISPR-Cas12b检测试剂盒利用Cas12b和sgRNA进行CRISPR检测，所述sgRNA以所述靶标位点为把靶序列进行设计。

进一步地，所述报告基因包含如SEQ ID NO.7-9任一或几个所示核苷酸序列，每个所述报告基因的两端分别含有荧光基团和猝灭基团。本发明利用顺式切割和反式切割原理进行检测：Cas12b蛋白在sgRNA的引导下识别到5’端含TTN的靶标序列，会促使双链DNA解链，解链后的靶标序列中的靶标链会与sgRNA行成R-loop，从而释放Cas12b中的RuvC的活性位点。此时解链后的非靶标链会被RuvC的活性位点切割，这一切割会导致靶标DNA的解旋，从而致使靶标DNA的靶标链也会被RuvC位点切割。当靶标DNA的靶标链被切割，则表明已发生顺式切割。此时一旦有单链DNA的进入，空间里被留出来的RuvC的活性位点，会对任意单链DNA(探针)进行切割，这一切割称为反式切割。根据这一切割特性，设计了两端分别含荧光基团和猝灭基团的探针序列。反应时检测整个体系的荧光，如果体系变成绿色，则探针序列被切割，证明是空肠弯曲菌。如反应液无颜色变化，可证明无空肠弯曲菌。

本发明所述检测试剂盒是采用CRISPR-Cas12b技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些CRISPR-Cas12b技术所需要的常规试剂，如：fluorescence quenchingprobe(FAM-N12-BHQ1)、RNase-free water、样品基因组DNA提取试剂等常用的CRISPR-Cas12b技术反应试剂中的一种或多种。由于此类CRISPR-Cas12b检测常用试剂可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装入试剂盒，可根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装入试剂盒。

本发明的检测试剂盒，可以是含有单独包装的sgRNA，也可以是含有配置好含sgRNA的CRISPR-Cas12b检测液。

所述CRISPR-Cas12b检测液可自行配置，也可直接以市售的不含sgRNA的通用CRISPR-Cas12b检测液加入sgRNA获得。例如，所述试剂盒中还可以含有Cas12b蛋白、fluorescence quenching probe(FAM-N12-BHQ1)、10x NEB Buffer 3/Buffer 3.1、Recombinant RNase Inhibitor、RNase-free water。加入本发明的sgRNA、待测样本DNA提取物或者样本菌液即可获得CRISPR-Cas12b反应体系。

优选地，所述检测试剂盒中还可以含有阳性对照。所述阳性对照为含有空肠弯曲菌的DNA样本。

优选地，所述试剂盒中还可以含有阴性对照。阴性对照为不含空肠弯曲菌的DNA样本。

本发明的另一方面提供了上述检测试剂盒在制备空肠弯曲菌检测产品中的用途。

如上所述，本发明的基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测方法，具有以下有益效果：

本发明的试剂盒操作简单，检测时间短，对提取好的样品DNA进行检测，仅需在1小时以内即可出检测结果；对于实际样本菌液进行检测，只需要1-2小时便可出检测结果：特异性强，灵敏度高，适用范围广，可用于食品样品如鸡肉、猪肉等中空肠弯曲菌的检测，其最低检测限为每微升11个拷贝数或204ag/μl；本方法可替代传统的食品中空肠弯曲菌的检测方法。

附图说明

图1：为CRISPR-Cas12b反应顺式切割活性的琼脂糖(2.0％w/v)；其中，泳道M为：DL1000Marker(宝生物)；泳道1为Cas12b蛋白顺式切割；泳道N为只有靶标DNA的阴性对照。

图2：为CRISPR-Cas12b反应反式切割活性示意图；其中PCR管1为：Cas12b蛋白反式切割；PCR管2为未加探针序列的阴性对照；PCR管3为缺少反应体系中sgRNA的阴性对照；PCR管4为缺少反应体系中Cas12b蛋白和sgRNA的阴性对照；PCR管5为任意缺少反应体系中Cas12b蛋白、sgRNA和靶标DNA的阴性对照。

图3：为CRISPR-Cas12b反应的非特异性保守序列的识别验证的对比分析及反应产物肉眼与蓝色光下的颜色变化；其中PCR管1-20为任意挑选的空肠弯曲菌的基因组，PCR管21为阴性对照。

图4：为CRISPR-Cas12b反应的特异性保守序列的识别验证的对比分析及反应产物肉眼与蓝色光下的颜色变化；其中PCR管1-20为任意挑选的空肠弯曲菌的基因组，PCR管21为阴性对照。

图5：为CRISPR-Cas12b反应的特异性对比分析及反应产物肉眼与蓝色光下的颜色变化；其中PCR管1和3为空肠弯曲菌NCTC81-176基因组；PCR管2为未加探针序列的空肠弯曲菌NCTC81-176基因组；PCR管4-5为空肠弯曲菌NCTC11168基因组；PCR管6为结肠弯曲菌分离株基因组；PCR管7-14为非空肠弯曲菌基因组；PCR管15为阴性对照。

图6：为CRISPR-Cas12b反应的特异性(混合细菌基因组DNA)对比分析及反应产物肉眼与蓝色光下的颜色变化；其中PCR管1为含空肠弯曲菌NCTC81-176基因组的混合DNA；PCR管2为未加探针序列的含空肠弯曲菌NCTC81-176基因组的DNA；PCR管3为不含空肠弯曲菌NCTC81-176基因组的混合DNA；PCR管4为含结肠弯曲菌分离株基因组的混合DNA。

图7：为CRISPR-Cas12b反应的灵敏度(DNA拷贝数)对比分析及反应产物肉眼与蓝色光下的颜色变化；所用DNA模板均为空肠弯曲菌NCTC81-176基因组上某一特异片段，PCR管1-12中一微升的DNA拷贝数分别为1.1×10¹⁰、1.1×10⁹、1.1×10⁸、1.1×10⁷、1.1×10⁶、1.1×10⁵、1.1×10⁴、1.1×10³、1.1×10²、11、1.1个，PCR管13为未加探针的阳性对照，PCR管14为阴性对照。

图8：为CRISPR-Cas12b反应的灵敏度(DNA浓度)对比分析及反应产物肉眼与蓝色光下的颜色变化；所用DNA模板为空肠弯曲菌NCTC81-176基因组，其中PCR管1-11中空肠弯曲菌NCTC81-176基因组浓度依此为204ng/μl、20.4ng/μl、2.04ng/μl、204pg/μl、20.4pg/μl、2.04pg/μl、204fg/μl、20.4fg/μl、2.04fg/μl、204ag/μl、20.4ag/μl，PCR管12为未加探针的阳性对照，PCR管13为阴性对照。

图9：为CRISPR-Cas12b反应的空肠弯曲菌的模拟检测及反应产物肉眼与蓝色灯光下的颜色变化；所用DNA模板为空肠弯曲菌NCTC81-176污染鸡肉表面PBS洗涤液的粗DNA模板，其中PCR管中1-11中菌液OD₆₀₀分别为1、1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8、1×10^-9、1×10^-10；PCR管12为阳性对照，PCR管13和14为阴性对照。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1试剂盒的制备

在NCBI中使用Blastn在线比对软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在全基因组数据库中搜索特异性保守性序列，搜索结果表明该保守序列只存在于空肠弯曲菌中，并且该序列在所有的空肠弯曲菌分离株中都是保守的，而在除空肠弯曲菌外的所有其他物种的基因组中都未检测到该序列，所以根据该特异性保守序列可将空肠弯曲菌与其他菌种区分开。

特异性序列比对分析：在NCBI中使用Blastn在线比对软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在全基因组数据库中搜索特异性保守性序列，搜索结果表明该保守序列只存在于空肠弯曲菌中，而在除空肠弯曲菌外的所有其他物种的基因组中都未检测到该序列，所以根据该特异性保守序列可将空肠弯曲菌与其他菌种区分开。

引物设计与合成：根据空肠弯曲菌特异性保守序列设计了sgRNA上靶向识别序列，并结合sgRNA特定的spacer，设计成两条空肠弯曲菌特定的sgRNA序列，并通过NCBI网站中的Primer-BLAST在线比对引物的特异性。所有引物由南京金斯瑞生物科技有限公司按照PAGE纯度级别合成。所述引物的核苷酸序列如下表1所示。

表1实验中使用的引物序列

上述引物可单独包装，也可以配成CRISPR-Cas12b检测液。所述CRISPR-Cas12b检测液中，上述引物的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。

也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的sgRNA，也可以是含有配置好的含有sgRNA的CRISPR-Cas12b检测液。

进一步地，所述试剂盒还可以含有Cas12b蛋白、fluorescence quenching probe(FAM-N12-BHQ1)、10x NEB Buffer 3/Buffer 3.1、Recombinant RNase Inhibitor、RNase-free water、样品基因组DNA提取试剂等等。

实施例2实施例1中的试剂盒性能验证

一、采用实施例1所述试剂盒中的sgRNA时，CRISPR-Cas12b顺式切割反应体系和反应程序的建立。

CRISPR-Cas12b反应体系：Cas12b 250nM,sgRNA 250nM,靶标DNA 50nM,10x NEBBuffer 3/3.1 2μl,RNase-free water补足至20μl。

CRISPR-Cas12b反应程序：PCR仪反应，即48℃ 30-35min后，65℃ 5min终止反应。

结果显示：Cas12b蛋白在sgRNA的引导下，识别到目标序列后，发生了顺式切割反应。经琼脂糖(2.0％w/v)电泳分析，可以观察到目标片段被切割成600bp和400bp的两条条带(如图1所示)

二、采用实施例1所述试剂盒中的sgRNA时，CRISPR-Cas12b反式切割反应体系和反应程序的建立。

CRISPR-Cas12b反应体系：Cas12b 250nM,sgRNA 250nM,样本基因组DNA 50nM,fluorescence quenching probe(FAM-N12-BHQ1)500nM,10x NEB Buffer 3/3.1 2μl,Recombinant RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl,RNase-free water补足至20μl。

结果显示：Cas12b蛋白在sgRNA的引导下，识别到目标序列后，发生了顺式切割反应的同时激发了反式切割活性。反应液经485nm的蓝光照射下，可清晰的看到切割了探针序列的反应管内颜色变成绿色(如图2所示)，且与对照组存在色差，则表明CRISPR-Cas12b蛋白发生了反式切割活性，检测系统是可工作的。

实施例3试剂盒检测空肠弯曲菌的特异性鉴定

一、采用实施例1所述试剂盒中的sgRNA时，以任意20个空肠弯曲菌的基因组(表2)为模板，CRISPR-Cas12b方法检测空肠弯曲菌的特异性。

表2实验中使用的空肠弯曲菌

表3实验中使用的非空肠弯曲菌

NCTC^a，国家标准菌库

CMCC^b，中国医药微生物菌种保藏管理中心

ATCC^c，美国标准菌株保藏中心

结果显示：反应液在485nm的蓝光照射下，可以发现随机选择的20个空肠弯曲菌的中，只有4个PCR管中的反应液变成了绿色，则表明检测到了空肠弯曲菌；而其他的PCR管中只会有探针自带的颜色，由于Taqman探针会因猝灭基团的不稳定而使得探针在485nm蓝光下，发出较浅的颜色。由此可见，非特异性保守序列区域的任意sgRNA靶向识别序列不能检测所有的空肠弯曲菌(如图3所示)，只有针对空肠弯曲菌特异性保守序列设计的sgRNA靶向识别序列，才能检测所有的空肠弯曲菌(如图4所示)。

二、采用实施例1所述试剂盒中的sgRNA时，以空肠弯曲菌和非空肠弯曲菌的基因组(表3)分别为模板，CRISPR-Cas12b方法检测空肠弯曲菌的特异性。

结果显示：样本基因组DNA为空肠弯曲菌的，反应液在485nm的蓝光照射下颜色变成了绿光；而样本基因组DNA为非空肠弯曲菌的，反应液内只会有探针自带的颜色(如图5所示)。

三、采用实施例1所述试剂盒中的sgRNA时，以含空肠弯曲菌和不含空肠弯曲菌的混合细菌基因组DNA为模板，CRISPR-Cas12b方法检测空肠弯曲菌的特异性。

结果显示：只有以含空肠弯曲菌的混合细菌基因组DNA为模板的，反应液才会在485nm的蓝光照射下变成绿色，其余的反应体系只会有探针自带的颜色(如图6所示)。

实施例4试剂盒检测空肠弯曲菌的灵敏度鉴定

一、采用实施例1所述试剂盒中的sgRNA时，以空肠弯曲菌NCTC 81-176上一段片段为模板，依此稀释(DNA拷贝数依次为每微升1.1×10¹⁰、1.1×10⁹、1.1×10⁸、1.1×10⁷、1.1×10⁶、1.1×10⁵、1.1×10⁴、1.1×10³、1.1×10²、11、1.1个)，分别以稀释的片段为模板，鉴定试剂盒检测空肠弯曲菌的灵敏性。

结果显示：该检测试剂盒的检测限可低至每微升11个拷贝数(如图7所示)。

二、采用实施例1所述试剂盒中的sgRNA时，以空肠弯曲菌NCTC 81-176基因组为模板，将基因组依此稀释(浓度为204ng/μl、20.4ng/μl、2.04ng/μl、204pg/μl、20.4pg/μl、2.04pg/μl、204fg/μl、20.4fg/μl、2.04fg/μl、204ag/μl、20.4ag/μl)，分别以稀释的基因组为模板，鉴定试剂盒检测空肠弯曲菌的灵敏性。

结果显示：该检测试剂盒可检测到204ag/μl的空肠弯曲菌基因组(如图8所示)

实施例5实施例1中的试剂盒检测食品中空肠弯曲菌

一、样品采集与DNA的提取

采集25份菜场的鸡肉表面擦拭样品(PBS润湿)，8000×g离心5min，沉淀使用PBS悬浮并洗涤。接着再用8000×g离心获取沉淀并使用70μl超纯水重复细菌。使用煮沸法裂解细菌，及细菌悬浮液100℃煮沸10min，12000×g离心3min,吸取上清作为模板(样品基因组DNA)。

二、食品样品中空肠弯曲菌检测

参照实施例2应用本发明实施例1中的试剂盒对25份样品进行空肠弯曲菌检测，具体地：

CRISPR-Cas12b反应程序：PCR仪反应，即48℃ 30-35min后，65℃ 5min终止反应。将反应液放置485nm的蓝光下，通过观察反应液的颜色变化来确定是否含有空肠弯曲菌。当含有空肠弯曲菌时，容易会变成绿色；当无空肠弯曲菌时，只会存在探针原有的颜色。

三、食品样品中空肠弯曲菌模拟检测

参照实施例2应用本发明实施例1中的试剂盒对11份不同浓度下空肠弯曲菌污染的样品进行检测，具体地：

结果显示，本发明的CRISPR-Cas12b技术检测出10份样品空肠弯曲菌阳性，经过国标法检测为阳性的样品，CRISPR-Cas12b法也均为阳性。同时模拟污染检测中，CRISPR-Cas12b检测限达到了10CFU/mL，(如图9所示)表明CRISPR-Cas12b方法更加灵敏与实用。

本领域技术人员都知晓，国标法检测食品中的空肠弯曲菌一般需要1～2周才能完成检测，而采用本发明的试剂盒及检测方法，仅需1天以内的时间即能完成检测。对提取好的样品DNA进行检测，可在1小时内即可出检测结果。本发明的试剂盒使用范围广，可用于食品样品如鸡肉、猪肉等中空肠弯曲菌的检测，最低检测限为每微升11个拷贝数或204ag/μl；本方法可很好的替代传统的食品中空肠弯曲菌的检测方法。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtttgcctca gcaataactt cttgacgtct tgctctagcg gtttgt 46

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tattttaaat agtatgctgt ataagccgct ttta 34

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagtcatagc tgatcatata 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgacgtctt gctctagcgg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatagtatgc tgtataagcc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagtcatagc tgatcatata 20

<210> 7

<211> 136

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaattaata cgactcacta taggggtcta gaggacagaa tttttcaacg ggtgtgccaa 60

tggccacttt ccaggtggca aagcccgttg agcttctcaa atctgagaag tggcacttga 120

cgtcttgctc tagcgg 136

<210> 8

<211> 136

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaattaata cgactcacta taggggtcta gaggacagaa tttttcaacg ggtgtgccaa 60

tggccacttt ccaggtggca aagcccgttg agcttctcaa atctgagaag tggcacaata 120

gtatgctgta taagcc 136

Claims

1.一种基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测方法，所述方法利用CRISPR-Cas12b系统检测靶标位点，所述靶标位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3任一所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CRISPR-Cas12b系统利用Cas12b和sgRNA进行CRISPR检测，所述sgRNA以所述靶标位点为靶标序列进行设计。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述sgRNA包括核苷酸序列如SEQ IDNO.4-6任一或几个所示的序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括利用报告基因通过荧光显色技术显示检测结果。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法具体包括

(1)体外转录纯化sgRNA；

(2)提取样品基因组DNA；

(3)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有CRISPR-Cas12b反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述CRISPR-Cas12b反应体系中含有针对空肠弯曲菌设计的sgRNA序列；

(5)CRISPR-Cas12b反应结束后，分析结果。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，CRISPR-Cas12b反应的条件设置为：(a)48℃ 30-35min；(b)65℃ 5min。

7.一种用于检测空肠弯曲菌的CRISPR-Cas12b的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：Cas12b蛋白、sgRNA以及报告基因，所述CRISPR-Cas12b检测空肠弯曲菌的靶标位点如SEQ ID NO.1-3任一所示。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：所述CRISPR-Cas12b检测试剂盒利用Cas12b和sgRNA进行CRISPR检测，所述sgRNA以所述靶标位点为把靶序列进行设计。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于：所述sgRNA包括核苷酸序列如SEQID NO.4-6任一或几个所示的序列。

10.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：所述报告基因包含如SEQ IDNO.7-9任一或几个所示核苷酸序列，所述每个报告基因的两端分别含有荧光基团和猝灭基团。

11.如权利要求7-10任一项所述检测试剂盒在制备空肠弯曲菌检测产品中的用途。