KR101749587B1 - 측면 흐름 분석 시스템을 이용한 병원성 미생물 유전자 검출용 시약 및 이를 포함하는 검출용 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 측면 흐름 분석 시스템을 이용한 병원성 미생물 유전자 검출용 시약 및 이를 포함하는 검출용 키트에 관한 것으로, 식중독을 일으키는 식중독균의 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 식중독균 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 프라이머 세트를 이용하여 식중독균의 유전자를 증폭하고, 증폭된 식중독균의 유전자를 측면 흐름 분석 시스템을 이용하여 짧은 시간 내에 유전자를 검출할 수 있었다.

Description

측면 흐름 분석 시스템을 이용한 병원성 미생물 유전자 검출용 시약 및 이를 포함하는 검출용 키트 {The reagent for detection of pathogenic microorganisms gene using lateral flow assay and detection kit containing the same}
본 발명은 측면 흐름 분석 시스템을 이용한 병원성 미생물 유전자 검출용 시약 및 이를 포함하는 검출용 키트에 관한 것이다.
최근 사회 구조의 변화로 맞벌이 부부의 증가, 핵가족화, 사회 환경의 변화에 의한 거주시설의 서구화 등 생활의 간편화 추구 및 바쁜 일정에 의한 조리시간의 절약 선호 등으로 우리의 식문화는 과거 가정 중심적인 식생활 행태에서 외식중심으로 전환되었다. 이런 추세에 맞추어 식품산업은 가공품, 반가공품과 같은 편리식을 대량 생산, 유통 시키게 되었고, 복지제도 확충에 따른 단체 급식도 확산되게 되었다. 또한, 국제 교류의 증가로 인하여 식품의 오염과 변질의 기회가 급증하게 되어 식품으로 인한 위해와 그 발생 양상 및 원인들이 점차 다양해지고 식중독의 발생이 때와 장소를 가리지 않으며 때로는 규모가 대형화되어 인류의 건강을 위협하는 가장 큰 원인이 되고 있다(정기혜, et al., 2001).
식중독(food poisoning)은 일반적으로 미생물 또는 미생물의 독소, 중금속을 포함한 각종 화학물질, 기타 생물학적 독성 등에 오염된 음식을 섭취한 후 발생하는 식품 매개 질환(foodborne diseases or foodborne illness) 중 비교적 잠복기가 짧으면서 다른 사람에게 전염력이 없는 질환을 의미한다(유창범, et al., 2011).
우리나라에서 흔히 발생하는 식중독을 원인 및 발현 기전에 따라 유형별로 분류해 보면, 식중독의 원인에 따라 세균성 식중독, 바이러스 식중독, 자연독 식중독, 화학성 식중독으로 나누며, 세균성 식중독은 발현 기전에 따라 감염형, 독소형, 기타군으로 나뉘며, 자연독 식중독은 원인 식품에 따라 식물성과 동물성 식중독으로 다시 분류된다(유창범, et al., 2011).
세균성 식중독 중 감염형 세균성 식중독은 섭취된 세균이 장내에서 증식하여 장점막 표면에 직접 침습을 하거나 장내에서 생산된 독소를 통해 장점막 손상을 유발하여 병을 유발하는 식중독으로 살모넬라(Salomnella) 식중독, 장염비브리오(Vibrio parahemolyticus) 식중독, 캠필로박터(Campylobacter) 식중독 등이 있고 대부분 긴 잠복기를 갖고 있다. 이에 반해 독소형 세균성 식중독은 오염된 식품 내에서 세균이 독소를 생산하고 독소가 함유된 식품을 섭취함으로써 야기되는 식중독으로, 주로 잠복기가 짧은 것이 특징이며 비염증성 수양성 설사나 구토를 동반하는 것이 특징이다. 이러한 식중독에는 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus) 식중독, 보툴리누스(Clostridium botulinum) 식중독 등이 있다(유창범, et al., 2011).
바이러스 식중독으로 가장 잘 알려진 것은 노로바이러스(Norovirus) 식중독이다. 노로바이러스는 전 세계에 걸쳐 발생하는 급성 장염의 가장 흔한 원인 중 하나로 겨울철에 흔하며, 구토가 주요 증상으로 보인다(Kim W.J., 1999). 노로바이러스는 주로 오염된 물이나 굴 등 어패류의 생식을 통해 발생되지만, 환자의 대변이나 구토물 등에도 존재하므로 대변-구강 전염(fecaloral transmission)이나 비말화(aerosol)된 구토물을 통한 공기 전염(airborne transmission) 등으로 인해 사람과 사람간에 전염될 수도 있다(Yu J.H., et al., 2010; Mead P.S., et al., 1999). 그러므로 학교나 회사와 같은 제한된 공간에서 노로바이러스에 감염된 식품취급자로부터 오염된 음식을 공동으로 섭취하게 된다면 집단 식중독이 발생할 가능성이 있다. 식중독을 일으키는 바이러스로 노로바이러스 외에도 로타바이러스(Rotavirus), 아스트로바이러스(Astrovirus), 아데노바이스(Adenovirus) 등이 있다(신광순, 2004).
식중독 환자를 진료할 때 단순히 임상적 특성만을 근거로 정확하게 진단을 하는 것은 현실적으로 어려운 경우가 많다. 그러나 집단 발병으로 많은 환자가 한꺼번에 내원하였을 경우에는 식중독을 의심하고 철저한 문진으로 섭취한 음식, 잠복기 등을 추정하고 구토, 설사, 발열 등의 임상적 특징들을 참고로 한다면 어느 정도 감별 진단이 가능하다(Fry A.M., et al., 2005).
최근 신속 · 간편 · 편리한 검출기법의 개발이 급속하게 증가함에 따라 식중독균에 대한 검출 기술도 발전하고 있다. 식중독균의 신속검출법(rapid method)으로는 직접형광항체법, ELISA(Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) 등이 흔히 사용되고 있으며, 최근에는 DNA 혼성화(hybridization)와 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 유전자 검출 방법이 활발히 응용되고 있다. 그 중 PCR이나 DNA 프로브(probe) 등은 식품 중 유해 미생물의 유전자를 직접 검출하는 방법으로 보통 ELISA 보다 특이적이며 신뢰성이 높은 검색법으로 알려져 있지만 식품 중에 존재하는 여러 가지 억제제(inhibitor)에 대한 문제를 해결해야 하며 숙련된 기술과 고가의 장비가 필수적이어서 작업 현장에서 직접 사용하는 데는 많은 어려움이 있다(김현주, et al., 2010).
이에 따라, 본 발명인들은 다양한 식중독균들의 검출 방법을 연구하는 중에 식중독균들에 특이적인 PCR 프라이머를 이용하여 얻은 PCR 산물을 전기영동이 아닌 측면 흐름 분석 시스템을 이용하여 분석함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
한편, 미국등록특허 제9121054호에는 형광물질 또는 바이오틴이 붙어 있는 병원균 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 산물을 측면 흐름 분석 방법을 이용하여 병원균을 검출하는 기술이 기재되어 있지만, 본 발명의 식중독 세균 및 프라이머 서열은 기재되어 있지 않다. 또한, 한국등록특허 제1211519호에는 형광물질 또는 프라이머를 이용한 PCR 산물을 측면 흐름 분석 방법을 이용하여 확인하는 방법을 기재하고 있으나, 유전자가 변형된 옥수수를 검출하는 방법으로 본 발명의 병원성 미생물 검출과는 그 목적이 상이합니다. 한국공개특허 제2006-0015668호에는 형광물질 또는 바이오틴이 붙어 있는 프라이머를 이용한 PCR 산물을 측면 흐름 분석 방법을 이용하여 확인하는 방법을 기재하고 있으나, 측면 흐름 분석 장치에 고정시키는 목적 유전자와 결합하는 물질로 프로브(probe)를 이용하고 있어, 항체를 이용하는 본 발명과 그 구성에 있어서 차이가 있습니다.
미국등록특허 제9121054호, Detection of nucleic acid amplification products in the presence of an internal control sequence on an immunochromatographic strip, 2015. 09. 01. 등록. 한국등록특허 제1211519호, 유전자변형 옥수수 검출방법 및 이러한 검출방법을 위한 키트, 2012. 02. 06. 등록. 한국공개특허 제2006-0015668호, 멤브레인 측면 흐름 디엔에이 칩을 이용한 인체 유해미생물의 검출 방법과 이를 위한 검사 키트, 2006. 02. 17. 공개.
김현주, et al., 신기술 이용 식중독균 신속검출법 개발 동향 분석, J. Fd. Hyg. Safety, 25(4), 376-387, 2010. 신광순, 선진국의 식중독 관리 시스템 조사, 식품안전관리사업 연구결과보고서, 2004. 유창범, et al., 식중독, J. Korean Med. Assoc., 54(6), 617-626, 2011. 정기혜, et al., 대형식중독 예방을 위한 집단 위생수준 제고 방안, 한국보건사회연구원, 연구보고서, 2001. Fry A.M., et al., Foodborne diseases. Principles and practice of infectious diseases, 6th ed., Philadelphia: Elsevier, 1286-1301, 2005. Kim W.J., Management of food poisoning and diarrheal disease, Korean J. Med., 57, 128-130, 1999. Mead P.S., et al., Food-related illness and death in the United States, Emerg. Infect Dis., 5, 607-625, 1999. Yu J.H., et al., Epidemiology of foodborne Norovirus outbreak in Incheon, J. Korean Med. Sci., 25, 1128-1133, 2010.
본 발명의 목적은 측면 흐름 분석 시스템을 이용한 병원성 미생물 유전자 검출용 시약 및 이를 포함하는 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 식중독균 유전자를 인식하는 서열번호 1 내지 24의 염기서열을 갖는 식중독균 검출용 PCR 프라이머에 관한 것이다.
상기 식중독균은 살모넬라균(Salmonella spp.), 클로스트리디움 페르프리젠(Clostrium perfringens), 캄필로박터(Campylobacter), 비브리오(Vibrio), 로타바이러스(Rotavirus), 아스트로바이러스(Astrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus) 및 노로바이러스(Norovirus)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 캄필로박터는 캄필로박터 코리(Campylobacter coli) 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)일 수 있다.
상기 비브리오는 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)일 수 있다.
상기 노로바이러스는 노로바이러스 GI(Norovirus GI) 및 노로바이러스 GII(Norovirus GII)일 수 있다.
또한, 본 발명은 식중독균 유전자를 인식하는 서열번호 1 내지 24의 염기서열 중 2종 이상의 염기서열로 이루어진 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트에 관한 것이다.
상기 식중독균은 살모넬라균(Salmonella spp.), 클로스트리디움 페르프리젠(Clostrium perfringens), 캄필로박터(Campylobacter), 비브리오(Vibrio), 로타바이러스(Rotavirus), 아스트로바이러스(Astrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus) 및 노로바이러스(Norovirus)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 캄필로박터는 캄필로박터 코리(Campylobacter coli) 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)일 수 있다.
상기 비브리오는 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)일 수 있다.
상기 노로바이러스는 노로바이러스 GI(Norovirus GI) 및 노로바이러스 GII(Norovirus GII)일 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 24의 염기서열을 갖는 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트는, 살모넬라균의 유전자를 이식하는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 살모넬라균의 유전자를 이식하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 클로스트리디움 페르프리젠의 유전자를 인식하는 서열 번호 3의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 클로스트리디움 페르프리젠의 유전자를 인식하는 서열 번호 4의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 캄필로박터 코리의 유전자를 인식하는 서열 번호 5의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 캄필로박터 코리의 유전자를 인식하는 서열 번호 6의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 캄필로박터 제주니의 유전자를 인식하는 서열 번호 7의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 캄필로박터 제주니의 유전자를 인식하는 서열 번호 8의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 비브리오 콜레라의 유전자를 인식하는 서열 번호 9의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 비브리오 콜레라의 유전자를 인식하는 서열 번호 10의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 비브리오 파라해모리티쿠스의 유전자를 인식하는 서열 번호 11의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 비브리오 파라해모리티쿠스의 유전자를 인식하는 서열 번호 12의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 비브리오 불니피쿠스의 유전자를 인식하는 서열 번호 13의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 비브리오 불니피쿠스의 유전자를 인식하는 서열 번호 14의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 로타바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 15의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 로타바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 16의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 아스트로바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 17의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 아스트로바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 18의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 아데노바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 19의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 아데노바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 20의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 노로바이러스 GI의 유전자를 인식하는 서열 번호 21의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 노로바이러스 GI의 유전자를 인식하는 서열 번호 22의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 노로바이러스 GII의 유전자를 인식하는 서열 번호 23의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 및 노로바이러스 GII의 유전자를 인식하는 서열 번호 24의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상의 프라이머를 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 중 하나에 형광 물질로 표지하고, 또 다른 하나에는 바이오틴(biotin)을 표지할 수 있다.
상기 형광물질은 FAM(Carboxyfluorescein), DIG(digoxigenin), HEX(6-carboxy-2,4,4,5,7,7-hexachlorofluorescein succinimidyl ester), TET(2,4,1,4,-tetrachlorofluorescein), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), Cy3(cyanine3), Cy5(cyanine5), JOE(2,7-dimethoxy-4',5'-dichloro-6-carboxyrhodamine), NED(2-chloro-S-fluoro-7,8-fused phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), VIC(2'-chloro-7'-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), ROX(Rhodamine X), TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트를 이용한 식중독균 검출 방법으로, 식중독균 검출용 PCR 프라이머에 형광 물질 및 바이오틴이 표지된 프라이머 세트를 준비하는 제1단계; 상기 제1단계의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 제2단계; 상기 제2단계의 PCR 결과물을 형광 물질에 대한 항체가 고정되어 있는 측면 흐름 분석 시스템에 전개 시키는 제3단계; 및 상기 제3단계의 형광 물질에 대한 항체가 고정된 부분의 발색으로 식중독균을 검출하는 제4단계;를 포함할 수 있다.
상기 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트는, 살모넬라균의 유전자를 이식하는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 살모넬라균의 유전자를 이식하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 클로스트리디움 페르프리젠의 유전자를 인식하는 서열 번호 3의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 클로스트리디움 페르프리젠의 유전자를 인식하는 서열 번호 4의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 캄필로박터 코리의 유전자를 인식하는 서열 번호 5의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 캄필로박터 코리의 유전자를 인식하는 서열 번호 6의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 캄필로박터 제주니의 유전자를 인식하는 서열 번호 7의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 캄필로박터 제주니의 유전자를 인식하는 서열 번호 8의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 비브리오 콜레라의 유전자를 인식하는 서열 번호 9의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 비브리오 콜레라의 유전자를 인식하는 서열 번호 10의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 비브리오 파라해모리티쿠스의 유전자를 인식하는 서열 번호 11의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 비브리오 파라해모리티쿠스의 유전자를 인식하는 서열 번호 12의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 비브리오 불니피쿠스의 유전자를 인식하는 서열 번호 13의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 비브리오 불니피쿠스의 유전자를 인식하는 서열 번호 14의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 로타바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 15의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 로타바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 16의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 아스트로바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 17의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 아스트로바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 18의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 아데노바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 19의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 아데노바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 20의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 노로바이러스 GI의 유전자를 인식하는 서열 번호 21의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 노로바이러스 GI의 유전자를 인식하는 서열 번호 22의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 노로바이러스 GII의 유전자를 인식하는 서열 번호 23의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머; 및 노로바이러스 GII의 유전자를 인식하는 서열 번호 24의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 로 이루어진 군 중에서 선택되는 2종 이상의 프라이머를 포함할 수 있다.
상기 형광물질은 FAM(Carboxyfluorescein), DIG(digoxigenin), HEX(6-carboxy-2,4,4,5,7,7-hexachlorofluorescein succinimidyl ester), TET(2,4,1,4,-tetrachlorofluorescein), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), Cy3(cyanine3), Cy5(cyanine5), JOE(2,7-dimethoxy-4',5'-dichloro-6-carboxyrhodamine), NED(2-chloro-S-fluoro-7,8-fused phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), VIC(2'-chloro-7'-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), ROX(Rhodamine X), TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 i) 형광 물질 및 바이오틴이 표지된 식중독균 유전자를 인식하는 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 2종 이상을 포함하는 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트; 및 ii) 형광 물질에 대한 항체가 부착되어 있는 측면 흐름 분석 시스템; 을 포함하는 식중독균 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 식중독균은 살모넬라균, 클로스트리디움 페르프리젠, 캄필로박터 코리, 캄필로박터 제주니, 비브리오 콜레라, 비브리오 파라해모리티쿠스, 비브리오 불니피쿠스, 로타바이러스, 아스트로바이러스, 아데노바이러스, 노로바이러스 GI 및 노로바이러스 GII로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 형광물질은 FAM(Carboxyfluorescein), DIG(digoxigenin), HEX(6-carboxy-2,4,4,5,7,7-hexachlorofluorescein succinimidyl ester), TET(2,4,1,4,-tetrachlorofluorescein), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), Cy3(cyanine3), Cy5(cyanine5), JOE(2,7-dimethoxy-4',5'-dichloro-6-carboxyrhodamine), NED(2-chloro-S-fluoro-7,8-fused phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), VIC(2'-chloro-7'-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), ROX(Rhodamine X), TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 식중독균은 식중독을 일으킬 수 있는 미생물을 의미하며, 바이러스성 식중독균과 박테리아성 식중독균을 포함한다.
상기 바이러스성 식중독균은 로타바이러스(Rotavirus), 아스트로바이러스(Astrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus) 및 노로바이러스(Norovirus)일 수 있다.
상기 노로바이러스는 노로바이러스 GI(Norovirus GI) 및 노로바이러스 GII(Norovirus GII)일 수 있다.
상기 박테리아성 식중독균은 살모넬라균(Salmonella spp.), 클로스트리디움 페르프리젠(Clostrium perfringens), 캄필로박터(Campylobacter) 및 비브리오(Vibrio)일 수 있다.
상기 캄필로박터는 캄필로박터 코리(Campylobacter coli) 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)일 수 있다.
상기 비브리오는 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)일 수 있다.
본 발명에서 PCR 이란 표적 핵산(DNA 또는 RNA)를 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머(primer)를 사용하여 변성(denaturation), 어닐링(annealing) 및 연장(extenstion) 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다.
상기 표적 핵산이란 식중독균의 유전자일 수 있다.
상기 식중독균의 유전자는 DNA(deoxyribonucleic acid) 및 RNA(ribonucleic acid)일 수 있다.
본 발명의 프라이머는 살모넬라균(Salmonella spp.), 클로스트리디움 페르프리젠(Clostrium perfringens), 캄필로박터 코리(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 로타바이러스(Rotavirus), 아스트로바이러스(Astrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 노로바이러스 GI(Norovirus GI) 및 노로바이러스 GII(Norovirus GII)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 식중독균의 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 특이적으로 증폭할 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 24의 염기서열을 갖는 PCR 프라이머는 살모넬라균(Salmonella spp.), 클로스트리디움 페르프리젠(Clostrium perfringens), 캄필로박터 코리(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 로타바이러스(Rotavirus), 아스트로바이러스(Astrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 노로바이러스 GI(Norovirus GI) 및 노로바이러스 GII(Norovirus GII)로 이루어진 식중독균의 유전자를 인식하는 프라이머일 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머는 살모넬라균 유전자를 인식하는 정방향 프라이머이며, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머는 살모넬라균 유전자를 인식하는 역방항 프라이머이다.
상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머는 클로스트리디움 페르프리젠 유전자를 인식하는 정방향 프라이머이며, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머는 클로스트리디움 페르프리젠 유전자를 인식하는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머는 캄필로박터 코리 유전자를 인식하는 정방향 프라이머이며, 서열번호 6의 염기서열을 갖는 캄필로박터 코리 유전자를 인식하는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 7의 염기서열을 갖는 프라이머는 캄필로박터 제주니 유전자를 인식하는 정방향 프라이머이며, 서열번호 8의 염기서열을 갖는 프라이머는 캄필로박터 제주니 유전자를 인식하는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 9의 염기서열을 갖는 프라이머는 비브리오 콜레라 유전자를 인식하는 정방향 프라이머이며, 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프라이머는 비브리오 콜레라 유전자를 인식하는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 11의 염기서열을 갖는 프라이머는 비브리오 파라해모리티쿠스 유전자를 인식하는 정방향 프라이머이며, 서열번호 12의 염기서열을 갖는 프라이머는 비브리오 파라해모리티쿠스 유전자를 인식하는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 13의 염기서열을 갖는 프라이머는 비브리오 불니피쿠스 유전자를 인식하는 정방향 프라이머이며, 서열번호 14의 염기서열을 갖는 프라이머는 비브리오 불니피쿠스 유전자를 인식하는 역방향 프라이머이다.
상기 15의 염기서열을 갖는 프라이머는 로타바이러스 유전자를 인식하는 정방향 프라이머이며, 서열번호 16의 염기서열을 갖는 프라이머는 로타바이러스 유전자를 인식하는 역방향 프라이머이다.
상기 17의 염기서열을 갖는 프라이머는 아스트로바이러스 유전자를 인식하는 정방향 프라이머이며, 서열번호 18의 염기서열을 갖는 프라이머는 아스트로바이러스 유전자를 인식하는 역방향 프라이머이다.
상기 19의 염기서열을 갖는 프라이머는 아데노바이러스 유전자를 인식하는 정방향 프라이머이며, 서열번호 20의 염기서열을 갖는 프라이머는 아데노바이러스 유전자를 인식하는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 21의 염기서열을 갖는 프라이머는 노로바이러스 GI 유전자를 인식하는 정방향 프라이머이며, 서열번호 22의 염기서열을 갖는 프라이머는 노로바이러스 GI 유전자를 인식하는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 23의 염기서열을 갖는 프라이머는 노로바이러스 GII 유전자를 인식하는 정방향 프라이머이며, 서열번호 24의 염기서열을 갖는 프라이머는 노로바이러스 GII 유전자를 인식하는 역방향 프라이머이다.
하기 표 1에 상기 서열번호 1 내지 24의 염기서열, 상기 염기서열을 갖는 프라이머의 타겟 식중독균, 각 프라이머 이용시의 PCR 산물의 크기를 나타내었다. 이때, 하기 표 1의 서열번호 3의 염기서열 중 Y는 C와 T가 혼합되어 있는 것을 의미하며, 이 프라이머는 CTGGCGAAAGATGCGTTTTAACAGTTCC, CTGGCGAAAGATGTGTTTTAACAGTTCC가 혼합된 상태로 합성되어, C와 T에 상보적인 위치 모두 결합하면서 PCR 반응이 진행된다. 마찬가지로, 하기 표 1의 서열번호 19의 염기서열 중 Y는 C와 T가 혼합되어 있는 것을 의미하며, H는 A, T, C가 혼합되어 있는 것을 의미하며, 이 프라이머는 ATGGCCACCCCATCGATGATGCC, ATGGCCACCCCTTCGATGATGCC, ATGGCCACCCCCTCGATGATGCC, ATGGCTACCCCATCGATGATGCC, ATGGCTACCCCTTCGATGATGCC, ATGGCTACCCCCTCGATGATGCC가 혼합된 상태로 합성되어, Y 부위에 C에 상보적인 염기서열이 있고 H 부위에 A, T 또는 C에 상보적인 염기서열이 있는 위치와, Y 부위에 T에 상보적인 염기서열이 있고, H 부위에 A, T 또는 C에 상보적인 염기서열이 있는 위치 모두 결합하면서 PCR 반응이 진행된다. 또한, 하기 표 1의 서열번호 24의 염기서열 중 Y는 C와 T가 혼합되어 있는 것을 의미하며, 이 프라이머는 GTTGGCTGCGGACCCATCAG, GTTGGCTGTGGACCCATCAG가 혼합된 상태로 합성되어, C와 T에 상보적인 위치 모두 결합하면서 PCR 반응이 진행된다.
서열번호 프라이머 서열 식중독균 PCR 산물 크기(bp)
서열번호 1 TAGCCGTGACAACCAATACAAATGGG Salmonella spp. 116
서열번호 2 GATTGCGATTAGTGCTGGTTTTATCGTGAC
서열번호 3 CTGGCGAAAGATG Y GTTTTAACAGTTCC Clostrium
perfringens 		160
서열번호 4 GTCCAAGGGTATGAGTTAGAAGAACGCC
서열번호 5 GCTAATCAAGGCGTTTATGCTGCACTTT Campylobacter
coli 		127
서열번호 6 AAGCTCTCATACATTTTTCCCGATGAGC
서열번호 7 CTGGAGCACTTCCATGACCAC Campylobacter
jejuni 		124
서열번호 8 GGATGGCACAATATGCCTTTTGGTA
서열번호 9 CAACCGCTGTATTCAAGTCGATGC Vibrio cholera 114
서열번호 10 CTCGCACTCACATAACGACCAAGCTG
서열번호 11 CAGCGTCTGAAGTGATCAGCACG Vibrio
parahaemolyticus 		144
서열번호 12 CGTCAATGGTGAAGTAGCTACCATCTTCG
서열번호 13 GTACGAAGCGCCTGTGTCT Vibrio vulnificus 141
서열번호 14 CTGCTGTTGGTTGACGAGC
서열번호 15 CTGATTCTGCTTCAAACGATCCACTCACC Rotavirus 95
서열번호 16 CGATGAATCCATAGACACGCCAGC
서열번호 17 ACTCCATGGGAAGCTCCTATGCT Astrovirus 99
서열번호 18 GCAGTCCGTGACAGGCAGTG
서열번호 19 ATGGC Y ACCCC H TCGATGATGCC Adenovirus 101
서열번호 20 GCSCGGGCAAACTGCACCA
서열번호 21 TGGCAGGCCATGTTCCGCTG Norovirus GI 92
서열번호 22 CCATCATCATTTACGAATTCGGGCAGGAG
서열번호 23 CAGATCTGAGCACGTGGGAGG Norovirus GII 102
서열번호 24 GTTGGCTG Y GGACCCATCAG
본 발명의 프라이머 세트는 정방향 프라이머(Forword primer) 및 역방향 프라이머(Reverse primer)의 조합일 수 있다.
본 발명의 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 24의 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 것으로, 살모넬라균의 유전자를 이식하는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 살모넬라균의 유전자를 이식하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 클로스트리디움 페르프리젠의 유전자를 인식하는 서열 번호 3의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 클로스트리디움 페르프리젠의 유전자를 인식하는 서열 번호 4의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 캄필로박터 코리의 유전자를 인식하는 서열 번호 5의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 캄필로박터 코리의 유전자를 인식하는 서열 번호 6의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 캄필로박터 제주니의 유전자를 인식하는 서열 번호 7의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 캄필로박터 제주니의 유전자를 인식하는 서열 번호 8의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 비브리오 콜레라의 유전자를 인식하는 서열 번호 9의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 비브리오 콜레라의 유전자를 인식하는 서열 번호 10의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 비브리오 파라해모리티쿠스의 유전자를 인식하는 서열 번호 11의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 비브리오 파라해모리티쿠스의 유전자를 인식하는 서열 번호 12의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 비브리오 불니피쿠스의 유전자를 인식하는 서열 번호 13의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 비브리오 불니피쿠스의 유전자를 인식하는 서열 번호 14의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 로타바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 15의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 로타바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 16의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 아스트로바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 17의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 아스트로바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 18의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 아데노바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 19의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 아데노바이러스의 유전자를 인식하는 서열 번호 20의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 노로바이러스 GI의 유전자를 인식하는 서열 번호 21의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 노로바이러스 GI의 유전자를 인식하는 서열 번호 22의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머; 노로바이러스 GII의 유전자를 인식하는 서열 번호 23의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 노로바이러스 GII의 유전자를 인식하는 서열 번호 24의 염기서열;로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상을 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 형광물질 또는 바이오틴으로 표지시킬 수 있다. 바람직하게는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 중 하나를 형광 물질로 표지하고, 또 다른 하나에는 바이오틴(biotin)을 표지할 수 있다.
또한, 본 발명은 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트를 이용한 식중독균 검출 방법에 관한 것으로, 식중독균 검출용 PCR 프라이머에 형광물질 및 바이오틴이 표지된 프라이머 세트를 준비하는 제1단계; 상기 제1단계의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 제2단계; 상기 제2단계의 PCR 결과물을 형광 물질에 대한 항체가 고정되어 있는 측면 흐름 분석 시스템에 전개 시키는 제3단계; 및 상기 제3단계의 형광 물질에 대한 항체가 고정된 부분의 발색으로 식중독균을 검출하는 제4단계;를 포함할 수 있다.
상기 제1단계의 형광물질 및 바이오틴의 표지는 PCR 증폭 후 얻은 PCR 산물을 분석하기 위한 것이다.
상기 형광물질은 FAM(Carboxyfluorescein), DIG(digoxigenin), HEX(6-carboxy-2,4,4,5,7,7-hexachlorofluorescein succinimidyl ester), TET(2,4,1,4,-tetrachlorofluorescein), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), Cy3(cyanine3), Cy5(cyanine5), JOE(2,7-dimethoxy-4',5'-dichloro-6-carboxyrhodamine), NED(2-chloro-S-fluoro-7,8-fused phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), VIC(2'-chloro-7'-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), ROX(Rhodamine X), TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 흐름 분석(lateral flower assay) 시스템은 PCR 산물을 검출하기 위한 것이다.
상기 측면 흐름 분석 시스템은 샘플 패드(sample pad), 금 결합 패드(gold conjugated pad), 테스트 라인(test line), 대조군 라인(control line) 및 흡수 패드(absorbing pad)로 이루어질 수 있다.
상기 금 결합 패드(gold conjugated pad)에는 금 입자(gold particle)가 결합되어 있는 스트렙트아비딘(gold-streptavidin)과 금 입자가 결합된 면역글로불린 G(immunoglobulin G, IgG)가 포함될 수 있다.
상기 면역글로불린 G는 마우스(mouse), 토끼(rabbit), 염소(goat), 쥐(rat) 및 당나귀(donkey)에서 분리한 것일 수 있다. 바람직하게는 마우스(mouse), 토끼(rabbit) 및 염소(goat) 일 수 있고, 가장 바람직하게는 마우스(mouse)일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 금 입자는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold)는 입자 크기에 따라 색깔이 바뀐다. 입자 크기가 100㎚ 이하일 경우에는 붉은 색을 띠며, 100㎚ 초과일 경우에는 푸른색을 띤다. 본 발명에서는 붉은 색을 띠는 금 입자를 사용할 수 있고, 바람직하게는 40㎚ 입자 크기를 갖는 금 입자를 이용할 수 있다.
상기 스트렙트아비딘은 바이오틴과 결합하는 물질로, 본 발명의 바이오틴으로 표지된 PCR 산물의 바이오틴과 결합하고 스트렙트아비딘과 결합되어 있는 금 입자에 의해 테스트 라인에서 발색이 되도록 한다.
상기 테스트 라인은 PCR 산물을 분석할 수 있는 부위로, 1개 이상일 수 있다.
상기 테스트 라인은 형광물질에 대한 항체를 고정할 수 있으며, 각각 다른 종류의 형광물질에 대한 항체를 고정할 수 있다.
상기 형광물질에 대한 항체는 본 발명의 식중독균 검출용 PCR 프라이머에 표지되어 있는 형광물질에 대한 항체로 FAM(Carboxyfluorescein), DIG(digoxigenin), HEX(6-carboxy-2,4,4,5,7,7-hexachlorofluorescein succinimidyl ester), TET(2,4,1,4,-tetrachlorofluorescein), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), Cy3(cyanine3), Cy5(cyanine5), JOE(2,7-dimethoxy-4',5'-dichloro-6-carboxyrhodamine), NED(2-chloro-S-fluoro-7,8-fused phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), VIC(2'-chloro-7'-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), ROX(Rhodamine X), TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 형광물질에 대한 항체일 수 있다.
상기 대조군 라인(control line)에는 대조군으로 사용할 금 입자가 결합된 면역글로불린 G에 대한 항체를 고정할 수 있다.
상기 흡수 패드(absorbing pad)는 PCR 산물을 샘플 패드에 넣고 스트립에 전개 시 전개가 빠르게 이루어지도록 도와줄 수 있다.
상기 측면 흐름 분석 시스템을 이용한 PCR 산물 검출은 PCR시 사용한 프라이머에 표지된 형광물질 또는 바이오틴에 의해 발색이 일어나는 원리를 이용한 것일 수 있다. 보다 자세하게는 PCR 프라이머에 의해 PCR 산물이 증폭되면, PCR 프라이머에 표지된 형광물질 및 바이오틴이 이중 가닥 형태로 생성이 되고, PCR 산물의 바이오틴이 금 결합 패드에 있는 금 입자가 결합되어 있는 스트렙트아비딘과 결합하여 전개되고, 테스트 라인을 통과하면서 PCR 산물의 형광물질이 테스트 라인의 형광물질에 대한 항체와 결합한다. 이때, PCR 산물과 결합되어 있는 금 입자에 의해 테스트 라인에 의해 색이 나타나게 되어 PCR 산물을 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 i) 형광물질 및 바이오틴이 표지된 식중독균 유전자를 인식하는 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 2종 이상을 포함하는 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트; 및 ii) 형광물질에 대한 항체가 부착되어 있는 측면 흐름 분석 시스템; 을 포함하는 식중독균 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 식중독균 검출용 키트는 PCR 프리믹스(premix)(PCR 반응버퍼, dNTP, Taq DNA 중합효소, MMLV 역전사효소), 식중독균 검출용 프라이머 세트, 증폭된 PCR 산물 검출을 위한 측면 흐름 분석 시스템 등이 포함될 수 있다.
상기 식중독균 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 2종 이상을 포함하는 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트일 수 있다.
상기 식중독균 검출용 키트는 살모넬라균, 클로스트리디움 페르프리젠, 캄필로박터 코리, 캄필로박터 제주니, 비브리오 콜레라, 비브리오 파라해모리티쿠스, 비브리오 불니피쿠스, 로타바이러스, 아스트로바이러스, 아데노바이러스, 노로바이러스 GI 및 노로바이러스 GII로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 식중독균을 검출 할 수 있다.
본 발명은 측면 흐름 분석 시스템을 이용한 병원성 미생물 유전자 검출용 시약 및 이를 포함하는 검출용 키트에 관한 것으로, 보다 자세하게는 식중독을 일으키는 식중독균의 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트를 포함한다.
상기 프라이머 세트를 이용하여 식중독균의 유전자를 증폭하고, 증폭된 식중독균의 유전자를 측면 흐름 분석 시스템을 이용하여 짧은 시간 내에 유전자를 검출할 수 있었고, 또한, 2종 이상의 식중독균의 유전자가 혼합된 경우에도 측면 흐름 분석 시스템을 이용함으로써 각각의 식중독균에 해당되는 유전자를 하나의 시스템 상에서 분리하여 검출할 수 있다.
이를 통해, 본 발명의 측면 흐름 분석 시스템을 이용한 병원성 미생물 유전자 검출용 시약을 이용함으로써, 다양한 식중독균을 빠른 시간 내에 검출 할 수 있다.
도 1은 본 발명에 이용된 측면 흐름 분석 시스템의 구조를 보여주고 있다.
도 2는 본 발명에 이용된 측면 흐름 분석 시스템의 유전자 검출 원리를 보여주고 있다.
도 3은 본 발명의 각각의 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 식중독균 유전자를 전기영동과 측면 흐름 분석 시스템을 통해 분석한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 본 발명의 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트 2종을 혼합하여 멀티-PCR을 수행한 후, 증폭된 식중독균 유전자를 전기영동과 측면 흐름 분석 시스템을 통해 분석한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 식중독균의 핵산 추출>
검출에 이용할 식중독균으로 살모넬라균(Salmonella spp.), 클로스트리디움 페르프리젠(Clostrium perfringens), 캄필로박터(Campylobacter coli, Campylobacter jejuni), 비브리오(Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus), 로타바이러스(Rotavirus), 아스트로바이러스(Astrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 노로바이러스(Norovirus GI, Norovirus GII)를 이용하였다.
실시예 1-1. 바이러스 RNA 추출
노로바이러스 GI, GII, 로타바이러스의 RNA는 바이러스에 감염된 인간의 대변으로부터 추출하였다. 바이러스에 감염된 인간의 대변 20㎎에 PBS(phosphate buffered saline)(pH 7.4) 1㎖를 넣고 볼텍싱(vortexing)한 후 원심 분리하여 상층액을 확보하였다. 아데노바이러스, 아스트로바이러스의 RNA는 바이러스가 감염되어 있는 세포 배양액으로부터 추출하였다.
RNA 추출은 PrimePrep RNA/DNA Extraction kit(제넷바이오사, 한국)을 이용하였다. 바이러스가 존재하는 세포 배양액 또는 대변 상층액 200㎕에 VRL 버퍼 350㎕와 β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 3.5㎕를 넣고 10~15초간 볼텍싱하고, 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응물을 3,000rpm으로 5초간 스핀다운(spin down) 한 다음 이소프로판올(isopropanol) 150㎕를 넣고 5초간 볼텍싱하고 3,000rpm으로 5초간 스핀다운 한 뒤, 상층액을 스핀 컬럼(spin column)에 넣었다. 스핀 컬럼을 상온에서 13,000rpm으로 30초 동안 원심 분리하고, 스핀 컬럼에 VRW1 버퍼 700㎕를 넣고 상온에서 13,000rpm으로 30초 동안 원심 분리하였다. 스핀 컬럼에 VRW2 버퍼 700㎕를 넣고 상온에서 13,000rpm으로 30초 동안 원심 분리하고, 스핀 컬럼에 남아 있는 버퍼를 완전히 제거하기 위해 빈 컬럼 상태로 상온에서 13,000rpm으로 1분간 원심 분리하였다. 버퍼가 완전히 제거된 스핀 컬럼을 새로운 튜브로 옮긴 후 VRE 버퍼 50㎕를 스핀 컬럼에 넣고 상온에서 1분간 방치 한 후 13,000rpm으로 1분간 원심 분리하여 바이러스 RNA를 확보하였다.
실시예 1-1. 박테리아의 DNA 추출
박테리아는 LB(Luria-Bertani) 액체 배지에 박테리아를 접종 후 하룻밤(overnight) 동안 배양한 배양액으로부터 DNA를 추출하였다.
DNA 추출은 PrimePrep Genomic DNA Extraction kit(제넷바이오사, 한국)를 이용하였다. 박테리아 배양액 200㎕를 13,000rmp으로 30초간 원심 분리 한 후 상층액을 제거하고 TL 버퍼 200㎕를 튜브에 넣고 10~15초간 볼텍싱하여 박테리아를 현탁하였다. 박테리아 현탁액에 Proteinase K 용액을 20㎕를 넣고 볼텍싱하여 혼합한 후 56℃ 항온수조에서 10분간 반응시켰다. 반응물을 스핀다운 시킨 다음 GB 버퍼 200㎕를 넣고 15초간 간헐적으로 볼텍싱하여 혼합하였다. 혼합액을 56℃ 항온수조에서 10분간 반응시키고 100% 에탄올을 200㎕ 첨가한 후 15초간 간헐적으로 볼텍싱하여 혼합하였다. 반응액을 스핀 컬럼에 넣고 10,000rpm으로 1분 간 원심 분리하였다. 통과액을 버리고 새로운 튜브에 스핀 컬럼을 장착하고 GW1 버퍼 500㎕를 스핀 컬럼에 넣고 10,000rpm으로 1분 간 원심 분리하였다. 통과액을 버리고 새로운 튜브에 스핀 컬럼을 장착하고 GW2 버퍼 500㎕를 컬럼에 넣고 10,000rpm으로 1분간 원심 분리하였다. 스핀 컬럼에 남아 있는 버퍼를 완전히 제거하기 위해 빈 컬럼 상태로 12,000rpm으로 1분간 원심 분리하였다. 버퍼가 완전히 제거된 스핀 컬럼을 새로운 튜브로 옮긴 후 GE 버퍼 50㎕를 넣고 상온에서 1분간 방치한 후 10,000rpm 으로 1분간 원심 분리하여 박테리아 DNA를 확보하였다.
<실시예 2. 프라이머 디자인 및 제작>
식중독균 검출을 위한 PCR 프라이머 제작을 위해 각각의 식중독균의 국내 분리주 및 외국의 분리주의 염기서열을 NCBI, EMBL 및 DDBJ 등에서 확보하였고, BioEdit의 ClustalW 프로그램을 이용하여 확보한 식중독균들의 염기서열들을 정렬(alignment)하였다. 확보된 염기서열을 바탕으로 FastPCR 프로그램을 이용하여 프라이머를 디자인 한 후 검출에 이용할 프라이머를 선정하였고, 이를 표 2에 나타내었다.
디자인한 프라이머 염기서열을 이용하여 PCR에 이용할 프라이머 세트(정방향 프라이머(F), 역방향 프라이머(R))를 제작하였다. 프라이머 제작 시 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 중 하나에는 형광물질(FAM, DIG, HEX, Cy5, ROX, Texas Red 등)로, 또 다른 하나에는 바이오틴(biotin)으로 표지하였다.
프라이머 이름 서열번호 프라이머 서열 식중독균 Tm
(℃)		 PCR 산물 크기(bp)
Sal-F 서열번호 1 TAGCCGTGACAACCAATACAAATGGG Salmonella spp. 59.6 116
Sal-R 서열번호 2 GATTGCGATTAGTGCTGGTTTTATCGTGAC 59.9
CP-F 서열번호 3 CTGGCGAAAGATGYGTTTTAACAGTTCC Clostrium
perfringens 		57.1 160
CP-R 서열번호 4 GTCCAAGGGTATGAGTTAGAAGAACGCC 60.8
CC-F 서열번호 5 GCTAATCAAGGCGTTTATGCTGCACTTT Campylobacter
coli 		60.2 127
CC-R 서열번호 6 AAGCTCTCATACATTTTTCCCGATGAGC 59.2
CJ-F 서열번호 7 CTGGAGCACTTCCATGACCAC Campylobacter
jejuni 		58.8 124
CJ-R 서열번호 8 GGATGGCACAATATGCCTTTTGGTA 58.2
VC-F 서열번호 9 CAACCGCTGTATTCAAGTCGATGC Vibrio cholera 59.0 114
VC-R 서열번호 10 CTCGCACTCACATAACGACCAAGCTG 61.8
VP-F 서열번호 11 CAGCGTCTGAAGTGATCAGCACG Vibrio
parahaemolyticus 		60.6 144
VP-R 서열번호 12 CGTCAATGGTGAAGTAGCTACCATCTTCG 60.6
VV-F 서열번호 13 GTACGAAGCGCCTGTGTCT Vibrio vulnificus 57.9 141
VV-R 서열번호 14 CTGCTGTTGGTTGACGAGC 57.6
Rot-F 서열번호 15 CTGATTCTGCTTCAAACGATCCACTCACC Rotavirus 61.3 95
Rot-R 서열번호 16 CGATGAATCCATAGACACGCCAGC 60.3
Ast-F 서열번호 17 ACTCCATGGGAAGCTCCTATGCT Astrovirus 60.1 99
Ast-R 서열번호 18 GCAGTCCGTGACAGGCAGTG 61.6
Ade-F 서열번호 19 ATGGCYACCCCHTCGATGATGCC Adenovirus 60.2 101
Ade-R 서열번호 20 GCSCGGGCAAACTGCACCA 59.9
NorI-F 서열번호 21 TGGCAGGCCATGTTCCGCTG Norovirus GI 63.7 92
NorI-R 서열번호 22 CCATCATCATTTACGAATTCGGGCAGGAG 61.3
NorII-F 서열번호 23 CAGATCTGAGCACGTGGGAGG Norovirus GII 60.3 102
NorII-R 서열번호 24 GTTGGCTGYGGACCCATCAG 56.9
<실시예 3. PCR 수행>
식중독균의 유전자 증폭을 위해 실시예 2에서 제작한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 하기 표 3에 표기한 대로 PCR 세트를 구성하여 식중독균의 유전자를 증폭하였다.
PCR은 SuPrimeScript RT-PCR Premix(제넷바이오사, 한국)를 이용하였고, 주형(template)으로는 실시예 1에서 분리한 바이러스 RNA 또는 박테리아 DNA를 이용하였고, 음성대조군(negative control, NC)으로 주형 대신 증류수를 넣었다. 프라이머는 실시예 2에서 제작한 프라이머 세트를 이용하였다. PCR 반응액은 하기 표 4의 조성대로 혼합하였고, 하기 표 5의 조건으로 PCR을 수행하였다.
세트 식중독균 프라이머 세트 형광물질
Set-1 Salmonella spp. Sal-F, Sal-R FAM
Set-2 Clostrium perfringens CP-F, CP-R FAM
Set-3 Campylobacter coli CC-F, CC-R DIG
Set-4 Campylobacter jejuni CJ-F, CJ-R DIG
Set-5 Vibrio cholera VC-F, VC-R DIG
Set-6 Vibrio parahaemolyticus VP-F, VP-R DIG
Set-7 Vibrio vulnificus VV-F, VV-R DIG
Set-8 Rotavirus Rot-F, Rot-R DIG
Set-9 Astrovirus Ast-F, Ast-R FAM
Set-10 Adenovirus Ade-F, Ade-R FAM
Set-11 Norovirus GI NorI-F, NorI-R DIG
Set-12 Norovirus GII NorII-F, NorII-R DIG
Set-13 Clostrium perfringens/
Vibrio parahaemolyticus		 CP-F, CP-R/
VP-F, VP-R		 FAM/DIG
Set-14 Salmonella spp./
Campylobacter jejuni		 Sal-F, Sal-R/
CJ-F, CJ-R		 FAM/DIG
Set-15 Astrovirus/Norovirus GII Ast-F, Ast-R/
NorII-F, NorII-R		 FAM/DIG
Set-16 Adenovirus/Rotavirus Ade-F, Ade-R/
Rot-F, Rot-R		 FAM/DIG
구성성분 구성성분 농도 첨가량(㎕)
2ㅧRT-PCR Premix 2× 10
50pmol/㎕ 정방향 프라이머 0.75~2.5uM 0.3~1
50pmol/㎕ 역방향 프라이머 0.75~2.5uM 0.3~1
주형(식중독균의 RNA 또는 DNA) - 1
증류수 - 최종 부피가 20㎕가 되도록
최종 부피 20
단계 온도 시간 사이클(cycle)
1 50℃ 5분 1
2 95℃ 5분 1
3 95℃ 5초 35
4 68℃ 5초
<실시예 4. 측면 흐름 분석 시스템 제조>
PCR로 증폭한 식중독균의 유전자를 분석하기 위한 방법으로 측면 흐름 분석 시스템을 이용하고자 하였고, 본 발명에 이용된 측면 흐름 분석 시스템의 구조 및 원리를 도 1 및 도 2에 나타냈었다.
도 1에서 보여주듯이, 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 멤브레인 스트립(strip)에 대조군 라인(control line)으로 항-마우스 IgG(anti-mouse immunoglobulin G)를 고정시키고, 테스트 라인으로 형광 물질에 대한 항체를 고정시켰다. 이때, 형광 물질에 대한 항체는 FAM(Carboxyfluorescein) 및 DIG(digoxigenin)에 대한 항체를 이용하였다. 금 결합 패드(Gold conjugated pad)에는 금 입자가 결합되어 있는 스트렙트아비딘(Gold-streptavidin)과 금 입자가 결합된 마우스 IgG(Gold-mouse IgG)를 포함시켰다.
도 2에서는, 본 발명에 이용된 측면 흐름 분석 시스템의 발색 원리를 보여주고 있다. 형광 물질 또는 바이오틴으로 표지된 프라이머를 이용해 PCR을 수행하여 식중독균의 유전자를 증폭시키고, 증폭한 PCR 산물을 본 발명의 측면 흐름 분석 시스템의 샘플 패드에 넣고, 멤브레인 스트립을 통해 전개되도록 하였다. 이때, 증폭된 PCR 산물이 전개되면서, 금 결합 패드에 있는 금 입자가 결합되어 있는 스트렙트아비딘과 증폭된 PCR 산물에 표지되어 있는 바이오틴이 결합하고, 테스트 라인을 통과하면서 증폭된 PCR 산물에 표지되어 있는 형광 물질이 항체와 결합한다. 이때, PCR 산물과 결합되어 있는 금 입자에 의해 테스트 라인에 색이 나타나게 된다. 반면에 식중독균이 없는 경우에는 PCR에 의해 유전자가 증폭되지 않아 테스트 라인의 항체와 결합하는 것이 없으므로 발색이 되지 않는다.
대조군 라인의 경우에는 금 결합 패드에 포함된 금 입자가 결합된 마우스 IgG가 전개되면서 대조군 라인에 고정되어 있는 항-마우스 IgG와 결합하여 대조군 밴드가 나타나도록 하였다. 이는 측면 흐름 분석 시스템이 제대로 작동하면 대조군 밴드가 항상 나타나야 하는 것으로 시스템이 제대로 작동하는지 여부를 확인할 수 있다.
<실시예 5. 식중독균 검출 확인>
실시예 3에서 수행한 PCR 결과를 확인하기 위해 증폭된 PCR 산물을 전기영동과 측면 흐름 분석(lateral flow assay) 방법, 두 가지를 이용하여 유전자 증폭 확인 및 식중독균 검출 가능 여부를 확인하였다.
PCR 결과를 확인하기 전에, PCR 산물에 들어있는 DNA 카피(copy) 수를 계산하고, DNA 카피 수가 105/㎕, 104/㎕, 103/㎕, 102/㎕, 101/㎕가 되도록 멸균된 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) 용액을 이용하여 희석하였다. 또한, 측면 흐름 분석 시스템의 경우에는 각각의 PCR 산물 10㎕에 전개완충용액(0.1% Casein, 1% Tween 30, 0.1% NaN3이 포함된 1×PBS) 100㎕를 혼합하여 적용하였다.
전기영동의 경우 증폭한 PCR 산물을 아가로스 겔(agarose gel)을 이용하여 크기별로 분리한 후 밴드를 확인하였고, 측면 흐름 분석 방법은 상기 실시예 4의 측면 흐름 분석 시스템을 이용하였다. 이때, PCR 산물은 각각 최종 카피수가 105 내지 101 카피수가 되도록 각각의 분석 시스템에 적용하여 검출 여부를 확인하였고, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3의 경우, 식중독균 유전자를 각각 하나씩 증폭한 결과로, 아가로스 겔 상에서 전기 영동한 결과를 살펴보면, 각각의 식중독균 유전자가 실시예 2에서 디자인한 프라이머에 의해 증폭되는 것을 확인할 수 있었고, 측면 흐름 분석 시스템을 이용한 경우에도 아가로스 겔에서 확인한 결과와 동일하게 식중독균 유전자를 검출할 수 있었다. 또한, PCR 산물의 희석 배수에 의존적으로 밴드의 색깔이 차이가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 4경우에는 하나의 PCR 반응액에 2종류의 식중독균 주형과 프라이머 세트를 넣어 멀티-PCR을 수행한 결과를 보여주고 있다. 아가로스 상에서 전기 영동한 결과를 살펴보면, 모든 PCR 산물에서 2종류의 식중독균의 유전자가 증폭되었음에도 하나의 밴드로 나타나는 것을 알 수 있었다. 이는 증폭된 PCR 산물의 크기가 비슷하여 전기영동 상에서 분리가 되지 않은 것으로 보여진다. 반면에, 측면 흐름 분석 시스템의 경우 전기 영동한 결과와 달리 2종류의 테스트 라인에서 모두 발색이 일어난 것을 알 수 있다. 이는, PCR 산물의 크기와 상관없이 PCR 수행시에 사용한 프라이머에 결합되어 있는 형광물질의 종류에 따라 증폭된 PCR 산물을 확인할 수 있음을 보여주는 것이다.
이를 통해, 본 발명의 측면 흐름 분석 시스템을 이용한 식중독균 검출용 시약을 이용하여 한 번에 다양한 식중독균의 유전자를 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한, 전기영동의 경우 결과를 확인하기 위해 30~60분 정도의 시간이 소요되는 반면에, 본 발명의 측면 흐름 분석 시스템을 이용하는 경우에는 3~5분이면 결과를 확인할 수 있어, 식중독 균의 검출 시간을 단축할 수 있다.
<110> genetbio <120> The reagent for detection of pathogenic microorganisms gene using lateral flow assay and detection kit containing the same <130> 0049 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-F <400> 1 tagccgtgac aaccaataca aatggg 26 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal-R <400> 2 gattgcgatt agtgctggtt ttatcgtgac 30 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP-F <400> 3 ctggcgaaag atgygtttta acagttcc 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP-R <400> 4 gtccaagggt atgagttaga agaacgcc 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC-F <400> 5 gctaatcaag gcgtttatgc tgcacttt 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC-R <400> 6 aagctctcat acatttttcc cgatgagc 28 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ-F <400> 7 ctggagcact tccatgacca c 21 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ-R <400> 8 ggatggcaca atatgccttt tggta 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VC-F <400> 9 caaccgctgt attcaagtcg atgc 24 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VC-R <400> 10 ctcgcactca cataacgacc aagctg 26 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP-F <400> 11 cagcgtctga agtgatcagc acg 23 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP-R <400> 12 cgtcaatggt gaagtagcta ccatcttcg 29 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VV-F <400> 13 gtacgaagcg cctgtgtct 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VV-R <400> 14 ctgctgttgg ttgacgagc 19 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rot-F <400> 15 ctgattctgc ttcaaacgat ccactcacc 29 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rot-R <400> 16 cgatgaatcc atagacacgc cagc 24 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ast-F <400> 17 actccatggg aagctcctat gct 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ast-R <400> 18 gcagtccgtg acaggcagtg 20 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ade-F <400> 19 atggcyaccc chtcgatgat gcc 23 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ade-R <400> 20 gcscgggcaa actgcacca 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NorI-F <400> 21 tggcaggcca tgttccgctg 20 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NorI-R <400> 22 ccatcatcat ttacgaattc gggcaggag 29 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NorII-F <400> 23 cagatctgag cacgtgggag g 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NorII-R <400> 24 gttggctgyg gacccatcag 20

Claims (19)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 식중독균 유전자를 인식하는 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트로,
    살모넬라균(Salmonella spp.) 유전자를 인식하는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    클로스트리디움 페르프리젠(Clostrium perfringens) 유전자를 인식하는 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    캄필로박터 코리(Campylobacter coli) 유전자를 인식하는 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유전자를 인식하는 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    비브리오 콜레라(Vibrio cholera) 유전자를 인식하는 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 유전자를 인식하는 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 유전자를 인식하는 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    로타바이러스(Rotavirus) 유전자를 인식하는 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    아스트로바이러스(Astrovirus) 유전자를 인식하는 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    아데노바이러스(Adenovirus) 유전자를 인식하는 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    노로바이러스 GI(Norovirus GI) 유전자를 인식하는 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및
    노로바이러스 GII(Norovirus GII) 유전자를 인식하는 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    을 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제6항에 있어서,
    상기 프라이머 쌍은 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 중 하나에 형광물질로 표지하고, 또 다른 하나에는 바이오틴(biotin)을 표지한 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 형광물질은 FAM(Carboxyfluorescein), DIG(digoxigenin), HEX(6-carboxy-2,4,4,5,7,7-hexachlorofluorescein succinimidyl ester), TET(2,4,1,4,-tetrachlorofluorescein), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), Cy3(cyanine3), Cy5(cyanine5), JOE(2,7-dimethoxy-4',5'-dichloro-6-carboxyrhodamine), NED(2-chloro-S-fluoro-7,8-fused phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), VIC(2'-chloro-7'-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), ROX(Rhodamine X), TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트.
  14. 제6항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항의 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트를 이용한 식중독균 검출 방법으로,
    프라이머 쌍은 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 중 하나에 형광물질로 표지하고, 또 다른 하나에는 바이오틴을 표지한 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트를 준비하는 제1단계;
    상기 제1단계의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 제2단계;
    상기 제2단계의 PCR 결과물을 형광 물질에 대한 항체가 고정되어 있는 측면 흐름 분석 시스템에 전개 시키는 제3단계; 및
    상기 제3단계의 형광 물질에 대한 항체가 고정된 부분의 발색으로 식중독균을 검출하는 제4단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. i) 식중독균 유전자를 인식하는 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트로,
    살모넬라균(Salmonella spp.) 유전자를 인식하는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    클로스트리디움 페르프리젠(Clostrium perfringens) 유전자를 인식하는 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    캄필로박터 코리(Campylobacter coli) 유전자를 인식하는 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유전자를 인식하는 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    비브리오 콜레라(Vibrio cholera) 유전자를 인식하는 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 유전자를 인식하는 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 유전자를 인식하는 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    로타바이러스(Rotavirus) 유전자를 인식하는 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    아스트로바이러스(Astrovirus) 유전자를 인식하는 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    아데노바이러스(Adenovirus) 유전자를 인식하는 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    노로바이러스 GI(Norovirus GI) 유전자를 인식하는 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍; 및
    노로바이러스 GII(Norovirus GII) 유전자를 인식하는 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍;
    을 모두 포함하는 프라이머 세트로,
    상기 프라이머 쌍은 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 중 하나에 형광물질로 표지하고, 또 다른 하나에는 바이오틴을 표지한 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 PCR 프라이머 세트; 및
    ii) 형광 물질에 대한 항체가 부착되어 있는 측면 흐름 분석 시스템;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 키트.
  18. 삭제
  19. 제17항에 있어서,
    상기 형광물질은 FAM(Carboxyfluorescein), DIG(digoxigenin), HEX(6-carboxy-2,4,4,5,7,7-hexachlorofluorescein succinimidyl ester), TET(2,4,1,4,-tetrachlorofluorescein), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), Cy3(cyanine3), Cy5(cyanine5), JOE(2,7-dimethoxy-4',5'-dichloro-6-carboxyrhodamine), NED(2-chloro-S-fluoro-7,8-fused phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), VIC(2'-chloro-7'-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), ROX(Rhodamine X), TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 키트.
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