KR100671501B1 - 식중독 검출용 프라이머 및 이를 이용한 세균성 식중독 검출방법 - Google Patents
식중독 검출용 프라이머 및 이를 이용한 세균성 식중독 검출방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식중독 검출용 프라이머 및 이를 이용한 세균성 식중독 검출방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 살모넬라 속 균주, 스타필로코커스 아우레우스, 대장균 O157, 리스테리아 모노사이토게네스 및 비브리오 파라헤몰리티쿠스 각각의 특이 유전자를 신속 정확하게 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머, 상기 프라이머를 이용한 식중독 검출방법 및 검출키트를 제공한다. 본 발명의 식중독 검출방법은 100 내지 10 CFU/ml농도까지 식중독 균을 검출할 수 있으며, 5시간 이내에 신속한 역학조사를 수행할 수 있다.
식중독, Nested PCR, 프라이머, 마이크로 PCR
Description
도 1은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) KCCM12021의 nested PCR 결과이다.
도 2는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus ) KCCM1927 의 nested PCR 결과이다.
도 3은 대장균 O157(Escherichia coli O157 : H7 ) ATCC12024의 nested PCR 결과이다.
도 4는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) ATCC19112의 nested PCR 결과이다.
도 5는 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus) KCCM11965의 nested PCR 결과이다.
도 6은 SEQ ID NO:3 및 4의 살모넬라 속 균주 검출용 프라이머 쌍의 반응 특이성을 확인한 것이다.
도 7은 SEQ ID NO:7 및 8의 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 쌍의 반응 특이성을 확인한 것이다.
도 8은 SEQ ID NO:15 내지 18의 리스테리아 모노사이토게네스 검출용 프라이머 쌍의 반응 특이성을 확인한 것이다.
도 9는 살모넬라 균을 인위적으로 오염시킨 다양한 식품에 대한 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머 쌍을 이용한 PCR 결과와, SEQ ID NO:1 내지 4의 2종의 프라이머 쌍을 이용한 마이크로 PCR 결과를 비교한 것이다.
도 11은 살모넬라 엔테리티디스에 대한 SEQ ID NO:1 내지 4의 2종 프라이머쌍을 이용한 nested PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 살모넬라 엔테리티디스에 대한 SEQ ID NO:3 및 4의 1종 프라이머쌍을 이용한 마이크로 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 스타필로코커스 아우레우스에 대한 SEQ ID NO:7 및 8의 1종 프라이머쌍을 이용한 마이크로 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 대장균 O157:H7 에 대한 SEQ ID NO:11 및 12의 1종 프라이머쌍을 이용한 마이크로 PCR 결과를 나타낸 것이다.
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 식중독 검출용 프라이머 및 이를 이용한 세균성 식중독 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 마이크로 PCR 또는 nested PCR로 사용가능한 PCR 프라이머를 이용하여 식중독의 원인이 되는 병원성 미생물을 신속 정확하게 검출해 내는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
식중독은 발열, 구역질, 구토, 설사 및 복통 등의 증세를 동반하는질환으로, 세균이 원인인 세균성 식중독이 대부분이다. 세균성 식중독은 그 발병 형태에 따라 감염형, 독소형으로 분류된다. 감염형 식중독은 세균에 오염된 식품의 섭취시 세균이 장관내에서 증식하여 일으키는 식중독으로, 살모넬라(Salmonella spp), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio paraheamolyticus), 대장균 O157(Escherichia coli O157:H7) 등이 주된 원인균이다. 독소형 식중독은 식품 중에서 세균이 증식하면서 독소를 생산하여 식품 내에 존재하는 독소를 섭취함으로써 발생하는 식중독이다. 그러므로 이 경우 원인균이 식품내에서 이미 사멸되었어도 독소가 잔존할 때에는 식중독이 발생할 수 있으며, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클로스트리디움 보튤리넘(Clostridium botulinum) 등이 이 경우에 해당한다.
식중독 발생에 필요한 병원성 미생물 수는 균의 종류에 따라 다르나, 보통은 106 내지 108 CFU/g이상 필요하다고 알려져 있다. 그러나 대장균O157:H7나 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)의 경우에는 10∼1000개의 균수만으로도 사람에게서 식중독을 발병시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 식중독을 유발하는 병원성 미생물 종류 및 이의 유발 수는 하기 표 1과 같다.
| 식중독 유 형 | 병원성 미생물 | 발병 균 수 | 발병 독소량 |
| 감염형 | 살모넬라 | - 105-107 cell/g : 사람발병 - 수십 cell/g : 신생아 감염 | |
| 비브리오 파라헤몰리티커스 | - 104-107 cell/g : 사람발병 | ||
| 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) | - 102cell/g : 사람 (지원자) - 106cell/g : 사람 (실험실 감염) | ||
| 리스테리아 모노사이토게네스 | - 수개 cell | ||
| 대장균 O157:H7 | - 10~100cell | ||
| 독소형 | 스타필로코커스 아우레우스 | - 106-107cell/g : 식품중 | 원인식품중 1.0㎍/1인 |
| 기 타 | 클로스트리움 페르프린겐스 (Clostrium perfringens) | - 108-109 cell/g : 사람발병 | |
| 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) | - 설사형 : 107 -108cell/g : 사람발병 - 구토형 : 106-107 cell/g : 식품중 |
식중독은, 학교 급식 등 단체급식의 확대 및 외식기회 증가 등의 식생활 패턴의 변화와, 지구 온난화 및 실내 온도 상승 등의 환경적인 변화로 인하여 식중독 발생 비율이 증가하면서 규모 면에서도 집단화, 대형화되고 있는 실정이다. 이에, 식중독 원인균을 조기에 발견하여 예방하는 방안의 개발이 매우 절실히 요구되고 있다.
현재 사용되는 살모넬라균 검출방법은, 완충성 펩톤수(BPW; Buffered Peptone Water)에서 전 배양하고 이를 선택배지에서의 배양하여 1차 검증한 다음 생화학적, 혈청학적 분석을 통하여 확인하는 방법이며, 통상 약 5일에서 6일이 소요된다. 또한 신속한 검출을 위하여 효소중합연쇄반응(PCR)을 이용하여 적용하고 있는 실정이지만, 이 또한 분석 가능한 균체량을 얻기 위하여 배양과정을 수행하고 있는 바 분석에 하루 이상이 소요된다.
이에 식품으로부터 식중독 원인균의 배양과정이 생략된, 신속한 식중독 원인균 검출 방법의 개발이 요구되고 있다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 사람에게 식중독을 일으키는 병원성 미생물의 특이 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 식중독을 일으키는 병원성 미생물에 대한 검출감도 및 특이성을 향상시킬 수 있는 2쌍의 프라이머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 사람에게 식중독을 일으키는 병원성 미생물의 특이 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응으로 병원성 미생물을 검출할 수 있으며 식중독의 진단 시간을 종래의 4 내지 6일에서 12시간으로 단축할 수 있는 신속하고 정확한 식중독의 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 사람에게 식중독을 일으키는 병원성 미생물의 특이 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응으로 단시간내에 신속하고 정확하게 병원성 미생물을 검출할 수 있는 검출키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 SEQ ID NO:3에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:4에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 살모넬라 속 균주(Salmonella spp) 검출용 프라이머 쌍; SEQ ID NO:7에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:8에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 쌍; SEQ ID NO:11에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:12에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 대장균 O157(E. coli O157:H7) 검출용 프라이머 쌍; SEQ ID NO:13에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:14에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 대장균 O157 검출용 프라이머 쌍; SEQ ID NO:17에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:18에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 검출용 프라이머 쌍; SEQ ID NO:21에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:22에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스 검출용 프라이머 쌍; 및 SEQ ID NO:23에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:24에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 병원성 미생물 검출용 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 병원성 미생물 검출용 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 식중독 균을 탐지하는 것을 포함하는 병원성 미생물 검출방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 병원성 미생물 검출용 PCR 프라이머, 반응완충액 및 Taq DNA 중합효소를 포함하는 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 검출키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 식중독을 유발하는 병원성 미생물 검출방법에 관한 것이다. 상기 병원성 미생물은 살모넬라 속 균주(Salmonella spp), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균O157(E. coli O157 : H7), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus)로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택될 수 있다.
본 발명은 상기 병원성 미생물의 특이 유전자를 탐지할 수 있도록 병원성 미생물 특이 유전자 증폭용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명의 프라이머 쌍은, 5종의 병원성 미생물의 특이 유전자를 서로 다른 크기로 동시에 탐지할 수 있으며, 구체적으로는 SEQ ID NO:3에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:4에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 살모넬라 속 균주 검출용 프라이머 쌍, SEQ ID NO:7에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:8에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 쌍, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:14에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 대장균 O157 검출용 프라이머 쌍, SEQ ID NO:17에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:18에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스 검출용 프라이머 쌍, 및 SEQ ID NO:21 또는 SEQ ID NO:23에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:22 또는 24에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루 어진 비브리오 파라헤몰리티커스 검출용 프라이머 쌍이 있다.
SEQ ID NO:3에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:4에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 살모넬라 속 균주 검출용 프라이머 쌍은, 살모넬라 속 균주의 특이 유전자를 약 200 bp로 증폭시킨다.
SEQ ID NO:3(P'1): 5'-TCGTCATTCCATTACCTACC-3'
SEQ ID NO:4(P'2) : 5'-ATCGGCTTCAATCAAGATAA-3'
상기 살모넬라 속 균주 검출용 프라이머 쌍은 PCR, nested PCR 또는 마이크로 PCR 용도로 사용가능하다. 상기 nested PCR로 사용되는 경우 1차 PCR 프라이머 쌍으로 공지의 프라이머 쌍, 예컨대 SEQ ID NO:1 및 2에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍과 동시에 PCR 반응시키거나 또는 1차 PCR 프라이머로 1차 PCR 후, PCR 산물에 상기 살모넬라 속 균주 검출용 프라이머를 반응시켜 2차 PCR을 실시할 수 있다. 상기 SEQ ID NO:1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍은 약 678bp의 증폭 산물을 형성한다.
SEQ ID NO:1(P1) : 5'-GAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTC-3'
SEQ ID NO:2(P2) : 5'-TAGCCGTAACAACCAATACAAATG-3'
SEQ ID NO:7에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:8에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 쌍은, 스타필로코커스 아우레우스의 특이 유전자를 약 136 bp로 증폭시킨다.
SEQ ID NO:7(P'3) : 5'-AATGCTTTCCGTCATTTTGC-3'
SEQ ID NO:8(P'4) : 5'-AGCTTTTGCTGATCGTGATG-3'
상기 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 쌍은 PCR, nested PCR 또는 마이크로 PCR 용도로 사용가능하다. 상기 nested PCR로 사용되는 경우 1차 PCR 프라이머 쌍으로 공지의 프라이머 쌍, 예컨대 SEQ ID NO:5 및 6에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍과 동시에 PCR 반응시키거나 또는 1차 PCR 프라이머로 1차 PCR 후, PCR 산물에 상기 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머를 반응시켜 2차 PCR을 실시할 수 있다. 상기 SEQ ID NO:5 및 6로 이루어진 프라이머 쌍은 약 264bp의 증폭 산물을 형성한다.
SEQ ID NO:5(P3) : 5'-AATTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT-3'
SEQ ID NO:6(P4) : 5'-TTCATTAAAGAAAAAGTGTACGAG-3'
대장균 O157 검출용 프라이머 쌍은, 센스 프라이머로 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머, 안티센스 프라이머로 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:14에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진다. 일예로, 대장균 O157 검출용 프라이머 쌍은 SEQ ID NO:11에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:12에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지거나 또는 SEQ ID NO:13에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:14에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진다. 상기 SEQ ID NO:11 및 SEQ ID NO:12로 이루어진 프라이머 쌍은 대장균 O157 특이 유전자를 약 108 bp로 증폭시키며, 상기 SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:14로 이루어진 프라이머 쌍은 대장균 O157 특이 유전자를 약 129 bp로 증폭시킨다.
SEQ ID NO:11(P'5) : 5'-GGTGTTCCTTTTGGCTGAAG-3'
SEQ ID NO:12(P'6) : 5'-TGACGACTGATTTGCATTCC-3'
SEQ ID NO:13(P″5) : 5'-TTCTGAGCAATCGGTCACTG-3'
SEQ ID NO:14(P″6) : 5'-TATATCAGTGCCCGGTGTGA-3'
상기 대장균 O157 검출용 프라이머 쌍은 PCR, nested PCR 또는 마이크로 PCR 용도로 사용가능하다. 상기 nested PCR로 사용되는 경우 1차 PCR 프라이머 쌍으로 공지의 프라이머 쌍, 예컨대 SEQ ID NO:9 및 10에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍과 동시에 PCR 반응시키거나 또는 1차 PCR 프라이머로 1차 PCR 후, PCR 산물에 상기 대장균 O157 검출용 프라이머를 반응시켜 2차 PCR을 실시할 수 있다. 상기 SEQ ID NO:9 및 10로 이루어진 프라이머 쌍은 약 208bp의 증폭 산물을 형성한다.
SEQ ID NO:9(P5) : 5'-GACAGCAGTTATACCACTCTGCAA-3'
SEQ ID NO:10(P6) : 5'-GACGAAATTCTCTCTGTATCTGCC-3'
SEQ ID NO:17에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:18에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스 검출용 프라이머 쌍은, 리스테리아 모노사이토게네스 특이 유전자를 약 191 bp로 증폭시킨다.
SEQ ID NO:17(P'7): 5'-TTGGTGCAACTGGAGTGCTT-3'
SEQ ID NO:18(P'8) : 5'-AGCAGGTGCAGCTTGTTGAG-3'
상기 리스테리아 모노사이토게네스 검출용 프라이머 쌍은, PCR, nested PCR 또는 마이크로 PCR 용도로 사용가능하다. 상기 nested PCR로 사용되는 경우 1차 PCR 프라이머 쌍으로 공지의 프라이머 쌍, 예컨대 SEQ ID NO:15 및 16에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍과 동시에 PCR 반응시키거나 또는 1차 PCR 프라이머로 1차 PCR 후, PCR 산물에 상기 리스테리아 모노사이토게네스 검출용 프라이머를 반응시켜 2차 PCR을 실시할 수 있다. 상기 SEQ ID NO:15 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍은 약 454bp의 증폭 산물을 형성한다.
SEQ ID NO:15(P7) : 5'-CTGGCACAAAATTACTTACAACGA-3'
SEQ ID NO:16(P8) : 5'-AACTACTGGAGCTGCTTGTTTTTC-3'
비브리오 파라헤몰리티커스 검출용 프라이머 쌍은, 센스 프라이머로 SEQ ID NO:21 또는 SEQ ID NO:23에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머와, 안티센스 프라이머로 SEQ ID NO:22 또는 SEQ ID NO:24에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진다. 일예로, 비브리오 파라헤몰리티커스 검출용 프라이머 쌍은 SEQ ID NO:21에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:22에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지거나 또는 SEQ ID NO:23에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:24에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진다. 상기 SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:22로 이루어진 프라이머 쌍은 비브리오 파라헤몰리티커스 특이 유전자를 약 219 bp로 증폭시키며, 상기 SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24로 이루어진 프라이머 쌍은 비브리오 파라헤몰리티커스 특이 유전자를 약 153 bp로 증폭시킨다.
SEQ ID NO:21(P'9) : 5'-CTTCTGACGCAATCGTTGAA-3'
SEQ ID NO:22(P'10) : 5'-CTTCTGACGCAATCGTTGAA-3'
SEQ ID NO:23(P″9) : 5'-TGATTTGCGGGTGATTTACA-3'
SEQ ID NO:24(P″10) : 5'-GAGATTCCGCTGGGTTTGTA-3'
상기 비브리오 파라헤몰리티커스 검출용 프라이머 쌍은, PCR, nested PCR 또는 마이크로 PCR 용도로 사용가능하다. 상기 nested PCR로 사용되는 경우 1차 PCR 프라이머 쌍으로 공지의 프라이머 쌍, 예컨대 SEQ ID NO:19 및 20에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍과 동시에 PCR 반응시키거나 또는 1차 PCR 프라이머로 1차 PCR 후, PCR 산물에 상기 비브리오 파라헤몰리티커스 검출용 프라이머를 반응시켜 2차 PCR을 실시할 수 있다. 상기 SEQ ID NO:19 및 20으로 이루어진 프라이머 쌍은 약 678bp의 증폭 산물을 형성한다.
SEQ ID NO:19(P9) : 5'-CTCATTTGTACTGTTGAACGCCTA-3'
SEQ ID NO:20(P10) : 5'-AATAGAAGGCAACCAGTTGTTGAT-3'
또한, 본 발명은 5종의 병원성 미생물의 특이 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 프라이머 쌍을 이용한 중합효소연쇄반응(PCR)으로 병원성 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 프라이머 쌍은, SEQ ID NO:3에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:4에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 살모넬라 속 균주 검출용 프라이머 쌍, SEQ ID NO:7에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:8에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 쌍, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13에 기재된 염기서열을 포함하는 프라 이머 및 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:14에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 대장균 O157 검출용 프라이머 쌍, SEQ ID NO:17에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:18에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스 검출용 프라이머 쌍, 및 SEQ ID NO:21 또는 SEQ ID NO:23에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:22 또는 24에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스 검출용 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택될 수 있다. 또한, PCR 시 SEQ ID NO:1에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:2에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 살모넬라 속 균주 검출용 프라이머 쌍, SEQ ID NO:5에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:6에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 쌍, SEQ ID NO:9에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:10에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 대장균 O157 검출용 프라이머 쌍, SEQ ID NO:15에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:16에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스 검출용 프라이머 쌍, 및 SEQ ID NO:19에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO:20에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스 검출용 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되는 프라이머 쌍을 추가로 사용할 수 있다. 상기 추가적인 프라이머 쌍은, nested PCR의 1차 증폭시에 사용됨으로써, PCR 효율을 향상시켜 시료내 함유된 병원성 미생물의 검출 한 계를 현저히 증진시킨다. 상기 추가적인 프라이머 쌍을 이용한 nested PCR의 경우, PCR을 두 단계로 실시하거나, 또는 상기 PCR 두 단계에서 각각 사용되는 프라이머 쌍 2종을 동시에 사용하여 한 단계의 PCR로 실시할 수 있다.
PCR은 통상적인 열 블록 중합효소연쇄반응(Thermal Block PCR) 기기 또는 마이크로 중합효소연쇄반응(Micro PCR) 기기로 실시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 검출방법은 상기 1종의 병원성 미생물에 대한 PCR 프라이머 쌍을 이용하여 각각의 병원성 미생물을 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 2종 이상의 병원성 미생물에 대한 2종 이상의 PCR 프라이머 쌍을 이용하여 다중 PCR(Multiplex polymerase Chain Reaction)을 수행함으로써, 상기 5종의 병원성 미생물을 한번에 신속 정확하게 검출할 수 있다.
본 발명의 검출방법에서 채택되는 PCR 반응조건은, PCR의 종류 예컨대 nested PCR, 다중 PCR, 마이크로 PCR, 단일 PCR 등에 따라 통상의 PCR반응조건을 채택하거나 일부 변형하여 실시할 수 있으며, 이는 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 예측할 수 있는 범주에 해당된다.
본 발명의 검출방법은, 상기 병원성 미생물이 발견되는 모든 물질을 대상으로 실시될 수 있으며, 바람직하기로는 식품 또는 사료에 대하여 실시할 수 있다. 일례로, 병원성 미생물에 오염이 되었으리라고 의심되는 시료를 채취하고, 이를 멸균수 또는 0.85% 생리식염수에 현탁한 후 프로테나제 K(Proteinase K)를 처리한 후 펠렛을 회수한 후 열수추출하여, PCR 반응에 필요한 시료를 준비하고, PCR을 실시 한다. PCR 결과는 통상적인 PCR 검출 수단, 예컨대 전기영동 등의 방법으로 실시된다. 상기 열수추출은 통상적인 DNA 분리방법으로, 예컨대 상기 펠렛을 멸균수로 부유하고 여기에 페놀/클로로포름(1:1) 혼합액을 처리한 다음 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 에탄올을 가한 후 원심분리하여 DNA 펠렛을 수득하는 방법이다. 구체적인 반응조건 및 시간은 통상적인 바에 따른다.
본 발명에 따른 검출방법은 병원성 미생물을 특이적으로 효율적으로 검출할 수 있으며, 또한 nested PCR을 실시함으로써 병원성 미생물의 검출한계를 현저히 향상시킨다. 특히, 기존의 검출한계 약 105 CFU/㎖를 약 100 내지 10 CFU/㎖로 증진시킨다.
또한, 본 발명에서는 1종 이상의 병원성 미생물 특이 유전자 검출용 프라이머 쌍을 포함하는 병원성 미생물 검출키트를 제공한다. 검출키트는, 7쌍의 프라이머(SEQ ID NO:3-4, 7-8, 11-14, 17-18, 21-24)와 PCR을 이용한 미생물 검출키트의 통상적인 구성성분(반응완충액, Taq DNA 중합효소, 표지물질 등)을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서 검출키트는 다음과 같이 구성된다.
(1) SEQ ID NO:3-4, 7-8, 11-14, 17-18, 21-24의 상기 PCR 프라이머쌍 P'1/P'2; P'3/P'4; P'5/P'6; P''5/P''6; P'7/P'8; P'9/P'10 및 P''9/P''10중에서 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 함유하는 프라이머 세트
(2) 반응완충액(Reaction Buffer)
(3) Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase)
상기 검출키트는 또한, SEQ ID NO:1-2, 5-6, 9-10, 15-16 및 19-20의 상기 PCR 프라이머 쌍 P1/P2; P3/P4; P5/P6; P7/P8 및 P9/P10으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 프라이머 쌍을 더욱 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서 검출키트는 다음과 같이 구성된다.
(1) SEQ ID NO:3-4, 7-8, 11-14, 17-18, 21-24의 상기 PCR 프라이머쌍 P'1/P'2; P'3/P'4; P'5/P'6; P''5/P''6; P'7/P'8; P'9/P'10 및 P''9/P''10중에서 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 함유하는 프라이머 세트
(2) 4X Greenstar PCR Master Mix (Taq DNA polymerase, SYBR Green 포함)
(3) 대조군 DNA
(4) 10 mM MgCl2
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1 : 5종의 병원성 미생물 특이 유전자 증폭용
프라이머의
설계 및 합성
살모넬라균 속 균주, 스타필로코커스 아우레우스, 대장균 O157, 리스테리아 모노사이트게네스 및 비브리오 파라헤몰리티커스의 5종의 병원성 미생물을 동시에 탐지할 수 있도록, 하기 표 2의 병원성 미생물 검출용 PCR 프라이머를 설계 및 합성하였다.
| 검출 미생물 | 프라이머 | 염기서열 | 서열번호 |
| Salmonella spp . | 1차 | 5'-GAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTC-3' | 1 |
| 5'-TAGCCGTAACAACCAATACAAATG-3' | 2 | ||
| 2차 | 5'-TCGTCATTCCATTACCTACC-3' | 3 | |
| 5'-ATCGGCTTCAATCAAGATAA-3' | 4 | ||
| Staphylococcus aureus | 1차 | 5'-AATTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT-3' | 5 |
| 5'-TTCATTAAAGAAAAAGTGTACGAG-3' | 6 | ||
| 2차 | 5'-AATGCTTTCCGTCATTTTGC-3' | 7 | |
| 5'-AGCTTTTGCTGATCGTGATG-3' | 8 | ||
| E. coli O157 : H7 | 1차 | 5'-GACAGCAGTTATACCACTCTGCAA-3' | 9 |
| 5'-GACGAAATTCTCTCTGTATCTGCC-3' | 10 | ||
| 2차 | 5'-GGTGTTCCTTTTGGCTGAAG-3' | 11 | |
| 5'-TGACGACTGATTTGCATTCC-3' | 12 | ||
| 2차 | 5'-TTCTGAGCAATCGGTCACTG-3' | 13 | |
| 5'-TATATCAGTGCCCGGTGTGA-3' | 14 | ||
| Listeria monocytogenes | 1차 | 5'-CTGGCACAAAATTACTTACAACGA-3' | 15 |
| 5'-AACTACTGGAGCTGCTTGTTTTTC-3' | 16 | ||
| 2차 | 5'-TTGGTGCAACTGGAGTGCTT-3' | 17 | |
| 5'-AGCAGGTGCAGCTTGTTGAG-3' | 18 | ||
| Vibrio parahaemolyticus | 1차 | 5'-CTCATTTGTACTGTTGAACGCCTA-3' | 19 |
| 5'-AATAGAAGGCAACCAGTTGTTGAT-3' | 20 | ||
| 2차 | 5'-CTTCTGACGCAATCGTTGAA-3' | 21 | |
| 5'-GACCTGCGAAAATACGCAAT-3' | 22 | ||
| 2차 | 5'-TGATTTGCGGGTGATTTACA-3' | 23 |
실시예
2 : Nested
PCR
2-1. 살모넬라 속 균주
살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) KCCM12021를 108 내지 1 CFU/㎖ 로 준비한 후, 1 ml에 프로테나제 K(20 mg/mL) 20 ul를 가하고 60℃에서 10분간 반응시킨다. 반응 완료후, 10,000 g에서 5분간 원심분리하여 펠렛을 수득하고, 200 ul의 멸균수를 가해 부유시킨다. 이를 105℃에서 20분간 가열하고, 동일 부피의 페놀/클로로포름을 가하여 혼합한 다음 10,000g에서 5분간 원심분리하여 상등액을 수득한다. 상등액에 동일 부피의 에탄올을 가하여 혼합하고 10,000g에서 5분간 원심분리하여 펠렛을 회수한 다음 20 uL의 멸균수를 가하여 PCR 시료를 준비한다.
PCR 반응은 두 가지 군으로 나누어 실시하였다. 즉 한 군은 SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머 쌍으로만 PCR을 실시하였으며, 다른 군은 SEQ ID NO:1 / 2를 이용하여 얻어진 산물을 다시 SEQ ID NO:3 / 4 프라이머를 이용하여 PCR 반응 조성물에 혼합하여 실시하였으나, 그 외 PCR 조건은 동일하게 실시하였다.
PCR 조건: 94℃, 5분 -> (94℃, 30초 -> 60℃, 30초 -> 72℃, 30초), 35회 -> 72℃, 5분.
PCR 반응 조성물:
1차
PCR
반응 조성물
- 5X Reaction Buffer : 5 ㎕
- SEQ ID NO:1의 프라이머 : 4 ㎕
- SEQ ID NO:2의 프라이머 : 4 ㎕
- Taq 중합효소(1U/㎕) : 1 ㎕
- 주형 DNA : <50 ng
- 총 부피 : 25 ㎕
2차
PCR
반응 조성물
- 5X Reaction Buffer : 5 ㎕
- SEQ ID NO:3의 프라이머 : 4 ㎕
- SEQ ID NO:4의 프라이머 : 4 ㎕
- Taq 중합효소(1U/㎕) : 1 ㎕
- 1차 PCR 산물 : <50 ng
- 총 부피 : 25 ㎕
그 결과는, 도 1에 나타낸다.
도 1은 살모넬라 엔테리티디스의 PCR 결과를 나타낸 것으로, 레인 1 내지 10은 SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 11 내지 20은 SEQ ID NO:1 내지 4의 프라이머 2쌍으로 nested PCR한 것이다. 또한 레인 1 및 11은 살모넬라 엔테리티디스 108 CFU/㎖에 대한 것이고, 레인 2 및 12는 107 CFU/㎖에 대한 것이고, 레인 3 및 레인 13은 106 CFU/㎖, 레인 4 및 레인 14는 105 CFU/㎖, 레인 5 및 레인 15은 104 CFU/㎖, 레인 6 및 레인 16은 103 CFU/㎖, 레인 7 및 레인 17은 102 CFU/㎖, 레인 8 및 레인 18은 10 CFU/㎖, 레인 9 및 19는 1 CFU/㎖, 레인 10 및 20은 살모넬라 DNA 10 ng에 대한 결과이다.
도 1의 nested PCR에서 678 bp 및 200 bp의 증폭산물이 확인되었으며, 특히 SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머 세트에 의한 PCR결과에 비하여 검출한계가 향상됨을 알 수 있다. 즉, SEQ ID NO:1 및 2를 이용한 살모넬라 엔테리티디스 PCR 결과에서는 108 CFU/㎖ 에서만 678 bp 증폭산물을 확인할 수 있으나, SEQ ID NO:1 및 2에서 얻어진 증폭산물을 재차 SEQ ID NO:3 및 4의 프라이머 쌍을 이용한 nested PCR 결과에서는 10 CFU/㎖까지 200 bp의 증폭산물을 얻을 수가 있었다.
2-2.
스타필로코커스
아우레우스
스타필로코커스 아우레우스 KCCM1927를 107 내지 1 CFU/㎖ 로 준비한 후, 상기 2-1.과 동일한 방법으로 실시하여 DNA를 추출하였다.
PCR 반응은 두 가지 군으로 나누어 실시하였다. 즉 한 군은 SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR을 실시하였으며, 다른 군은 SEQ ID NO:5 내지 8의 프라이머를 모두 PCR 반응 조성물에 혼합하여 실시하였으나, 그 외 PCR 조건은 동일하게 실시하였다. PCR 반응 조건 및 반응 조성은 상기 2-1.과 동일하게 하였다.
도 2는 스타필로코커스 아우레우스에 대한 PCR 결과를 나타낸 것으로, 레인 1 내지 8은 SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 9 내지 16은 SEQ ID NO:5 내지 8의 프라이머 2쌍으로 nested PCR한 것이다. 또한 레인 1 및 9는 스타필로코커스 아우레우스 107 CFU/㎖에 대한 것이고, 레인 2 및 10은 106 CFU/㎖에 대한 것이고, 레인 3 및 레인 11은 105 CFU/㎖, 레인 4 및 레인 12는 104 CFU/㎖, 레인 5 및 레인 13은 103 CFU/㎖, 레인 6 및 레인 14은 102 CFU/㎖, 레인 7 및 레인 15는 10 CFU/㎖ 및 레인 8 및 레인 16은 1 CFU/㎖에 대한 결과이다.
도 2에서, SEQ ID NO:5 내지 6의 프라이머 쌍을 이용한 PCR은 검출한계가 약 106 CFU/ml에 불과하나, SEQ ID NO:7 및 8의 프라이머 쌍을 더욱 사용한 nested PCR에서는 검출한계가 102 CFU/ml로 현저히 향상됨을 알 수 있다. 레인 15와 16은 RNA 밴드만이 검출되었다.
2-3. 대장균
O157
대장균 O157:H7 ATCC12024 를 4 x 108 내지 1 CFU/㎖ 로 준비한 후, 상기 2-1.과 동일한 방법으로 실시하여 DNA를 추출하였다.
PCR 반응은 두 가지 군으로 나누어 실시하였다. 즉 한 군은 SEQ ID NO:9 및 10의 프라이머 쌍으로 PCR을 실시하였으며, 다른 군은 SEQ ID NO:9 내지 12의 프라이머 쌍 또는 SEQ ID NO:9-10 및 13-14의 프라이머 쌍을 이용한 nested PCR을 실시하였다. 그 외 PCR 조건은 동일하게 실시하였다. PCR 반응 조건 및 반응 조성은 상기 2-1.과 동일하게 하였다.
도 3은 대장균 O157:H7에 대한 PCR 결과를 나타낸 것으로, 레인 1 내지 9는 SEQ ID NO:9 및 10의 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 9 내지 18은 SEQ ID NO:9 내지 12의 프라이머 2쌍으로 nested PCR한 것이고, 레인 19 내지 27은 SEQ ID NO:9-10 및 13-14의 프라이머 2쌍으로 nested PCR한 것이다. 또한 레인 1, 10 및 19는 대장균 O157:H7 4 x 108 CFU/㎖에 대한 것이고, 레인 2, 11 및 20은 4 x 107 CFU/㎖에 대한 것이고, 레인 3, 12 및 21은 4 x 106 CFU/㎖, 레인 4, 13 및 22는 4 x 105 CFU/㎖, 레인 5, 14 및 23은 4 x 104 CFU/㎖, 레인 6, 15 및 24는 4 x 103 CFU/㎖, 레인 7, 16 및 25는 4 x 100 CFU/㎖, 레인 8, 17 및 26은 4 x 10 CFU/mL 및 레인 9, 18 및 27은 4 x 1 CFU/㎖에 대한 결과이다.
도 3에서, SEQ ID NO:9 및 10의 프라이머 쌍으로 PCR한 경우(레인 1 내지 9) 레인 1에서 208 bp의 DNA 밴드가 검출되어, 검출한계가 약 108 CFU/ml임을 확인하였다. 반면에 SEQ ID NO:11 및 12의 프라이머 쌍을 더욱 사용한 nested PCR에서는(레인 10 내지 18), 레인 10 내지 17에서 129 bp의 DNA 밴드가 검출되어, 검출한계가 10 CFU/ml로 현저히 향상되었다. 또한 SEQ ID NO:13 및 14의 프라이머 쌍을 사용한 nested PCR에서는(레인 19 내지 27), 레인 19 내지 25에서 108 bp의 DNA 밴드가 검출되어, 검출한계가 102 CFU/ml임을 알 수 있었다.
2-4.
리스테리아
모노사이토게네스
리스테리아 모노사이토게네스 ATCC19112 를 1.1 x 109 내지 1 CFU/㎖ 로 준비한 후, 상기 2-1.과 동일한 방법으로 실시하여 DNA를 추출하였다.
PCR 반응은 두 가지 군으로 나누어 실시하였다. 즉 한 군은 SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR을 실시하였으며, 다른 군은 SEQ ID NO:17 및 18의 프라이머 쌍을 이용한 nested PCR을 실시하였다. 그외 PCR 조건은 동일하게 실시하였다. PCR 반응 조건 및 반응 조성은 상기 2-1.과 동일하게 하였다.
도 4는 리스테리아 모노사이토게네스에 대한 PCR 결과를 나타낸 것으로, 레인 1 내지 10은 SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 11 내지 20은 SEQ ID NO:17 및 18의 프라이머 쌍으로 nested PCR한 것이다. 또한 레인 1 및 11은 리스테리아 모노사이토게네스 1.1 x 109 CFU/㎖에 대한 것이고, 레인 2 및 12는 1.1 x 108 CFU/㎖에 대한 것이고, 레인 3 및 13은 1.1 x 107 CFU/㎖에 대한 것이고, 레인 4 및 14는 1.1 x 106 CFU/㎖, 레인 5 및 15는 1.1 x 105 CFU/㎖, 레인 6 및 16은 1.1 x 104 CFU/㎖, 레인 7 및 17은 1.1 x 103 CFU/㎖, 레인 8 및 18은 1.1 x 100 CFU/㎖, 레인 9 및 19는 1.1 x 10 CFU/mL, 및 레인 10 및 20은 1.1 x 1 CFU/㎖에 대한 결과이다.
도 4에서, SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR한 경우(레인 1 내지 10) 454 bp의 증폭산물이 검출되었고, SEQ ID NO:17 및 18의 프라이머 쌍을 더욱 사용한 nested PCR에서는(레인 11 내지 20) 454 bp 및 191 bp의 증폭산물이 검출되었다. 그러나, nested PCR이 저농도의 리스테리아 모노사이토게네스 검출에 보다 용이하였다.
2-5. 비브리오
파라헤몰리티커스
비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM11965를 2.1 x 1010 내지 1 CFU/㎖ 로 준비한 후, 상기 2-1.과 동일한 방법으로 실시하여 DNA를 추출하였다.
PCR 반응은 두 가지 군으로 나누어 실시하였다. 즉 한 군은 SEQ ID NO:19 및 20의 프라이머 쌍으로 PCR을 실시하였으며, 다른 군은 SEQ ID NO:19 내지 22의 프라이머 쌍 또는 SEQ ID NO:19-20 및 23-24의 프라이머 쌍을 이용한 nested PCR을 실시하였다. 그외 PCR 조건은 동일하게 실시하였다. PCR 반응 조건 및 반응 조성은 상기 2-1.과 동일하게 하였다.
도 5는 비브리오 파라헤몰리티커스에 대한 PCR 결과를 나타낸 것으로, 레인 1 내지 11은 SEQ ID NO:19 및 20의 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 12 내지 22는 SEQ ID NO:19 내지 22의 프라이머 2쌍으로 nested PCR한 것이고, 레인 23 내지 33은 SEQ ID NO:19-20 및 23-24의 프라이머 2쌍으로 nested PCR한 것이다. 또한 레인 1, 12 및 23은 비브리오 파라헤몰리티커스 2.1 x 1010 CFU/㎖에 대한 것이고, 레인 2, 13 및 24는 2.1 x 109 CFU/㎖에 대한 것이고, 레인 3, 14 및 25는 2.1 x 108 CFU/㎖에 대한 것이고, 레인 4, 15 및 26은 2.1 x 107 CFU/㎖에 대한 것이고, 레인 5, 16 및 27은 2.1 x 106 CFU/㎖, 레인 6, 17 및 28는 2.1 x 105 CFU/㎖, 레인 7, 18 및 29는 2.1 x 104 CFU/㎖, 레인 8, 19 및 30은 2.1 x 103 CFU/㎖, 레인 9, 20 및 31은 2.1 x 100 CFU/㎖, 레인 10, 21 및 32는 2.1 x 10 CFU/mL 및 레인 11, 22 및 33은 2.1 x 1 CFU/㎖에 대한 결과이다.
도 5에서, SEQ ID NO:19 및 20을 이용한 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM11965 PCR 결과에서는 레인 1 내지 3에서만 375 bp 증폭산물을 확인할 수 있어, SEQ ID NO:19 및 20의 프라이머 쌍으로 PCR 하였을때 검출한계가 약 108 CFU/ml임을 알 수 있다. 또한 SEQ ID NO:19 및 20에서 얻어진 증폭산물을 재차 SEQ ID NO:21 및 22의 프라이머 쌍을 이용한 nested PCR 결과에서는 레인 12 내지 22에서 219 bp의 증폭산물을 확인할 수 있다. 또한 SEQ ID NO:23 및 24의 프라이머 쌍을 이용한 nested PCR 결과에서는 레인 23 내지 33에서 153 bp의 증폭산물을 검출할 수가 있었다.
따라서, 본 발명의 프라이머 쌍을 이용한 nested PCR은 병원성 미생물 10 내지 1 CFU/㎖의 농도도 검출할 수 있어, 검출한계가 월등히 우수하였다.
실시예
3
실시예 1의 프라이머 쌍의 각 병원성 미생물 특이성을 검정하기 위하여, 유사 근권의 미생물 DNA를 대상으로 PCR을 실시하였다.
3-1. SEQ ID NO:3 및 4의 프라이머 쌍
도 6은 살모넬라 속 균주 검출용 프라이머(SEQ ID NO:3 및 4)로 nested PCR한 결과로, 각 레인의 정보는 하기와 같다.
레인 M : 사이즈마커(Size marker)
1: 살모넬라 엔테리티디스 KCCM12021, 102 CFU/㎖
2: 살모넬라 엔테리티디스 KCCM12021, 10 CFU/㎖
3: 살모넬라 콜레라에슈이스(Salmonella choleraesuis subsp cholerae) KCCM41035, 102 CFU/㎖
4: 살모넬라 콜레라에슈이스 KCCM41035, 10 CFU/㎖
5: 살모넬라 콜레라에슈이스 KCCM41575, 102 CFU/㎖
6: 살모넬라 콜레라에슈이스 KCCM41575, 10 CFU/㎖
7: 살모넬라 본고리(Salmonella bongori) KCCM41758, 102 CFU/㎖
8: 살모넬라 본고리 KCCM41758, 10 CFU/㎖
9: 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) KCCM41675, SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머로 PCR함
10: 예르시니아 엔테로콜리티카 KCCM41675, 108 CFU/㎖
11: 예르시니아 엔테로콜리티카 KCCM41675, 107 CFU/㎖
12: 시겔라 보이디(Shigella boydii) KCCM41646, SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머로 PCR함
13: 살모넬라 티피뮤리움 ATCC14023, 108 CFU/㎖
14: 살모넬라 티피뮤리움 ATCC14023, 107 CFU/㎖
15: 시트로박터 프레운드(Citrobacter freund) KCCM11931, SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머로 PCR함
16: 시트로박터 프레운드 KCCM11931, 108 CFU/㎖
17: 시트로박터 프레운드 KCCM11931, 107 CFU/㎖
18: 대장균(Escherichia coli) KCTC1467, SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머로 PCR함
19: 대장균 KCTC1467, 108 CFU/㎖
20: 대장균 KCTC1467, 107 CFU/㎖
21: 시트로박터 프레우디(Cytrobacter freudii) KCTC2006, SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머로 PCR함
22: 시트로박터 프레우디 KCTC2006, 108 CFU/㎖
23: 시트로박터 프레우디 KCTC2006, 107 CFU/㎖
24: 시겔라 소네이(Shigella sonnei) KCTC2518, SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머로 PCR함
25: 시겔라 소네이 KCTC2518, 108 CFU/㎖
26: 시겔라 소네이 KCTC2518, 107 CFU/㎖
27: 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) KCTC2517, SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머로 PCR함
28 시겔라 플렉스네리 KCTC2517, 108 CFU/㎖
29: 시겔라 플렉스네리 KCTC2517, 107 CFU/㎖
30: 살모넬라 콜레라(Salmonella cholerae) KCTC2931, 102 CFU/㎖
31: 시겔라 소네이 KCTC2009, SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머로 PCR함
32: 시겔라 소네이 KCTC2009, 108 CFU/㎖
33: 시겔라 소네이 KCTC2009, 107 CFU/㎖
34: 살모넬라 콜레라에슈이스 KCTC2929, 102 CFU/㎖
도 6에서, 레인 1-8, 13-14, 30 및 34에서 약 200 bp의 PCR 산물이 확인되었다. 따라서 SEQ ID NO:3 및 4의 프라이머 쌍은 살모넬라 속 균주만을 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
3-2. SEQ ID NO:7 및 8의 프라이머 쌍
도 7은 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머(SEQ ID NO:7 및 8)로 nested PCR한 결과로, 각 레인의 정보는 하기와 같다.
레인 M: 사이즈마커(Size marker)
1: 스타필로코커스 자일로스(Staphylococcus, ylous) KCCM41465, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
2: 스타필로코커스 자일로스 KCCM41465, 108 CFU/㎖
3: 스타필로코커스 자일로스 KCCM11764, 102 CFU/㎖
4: 스타필로코커스 아르레태(Staphylococcus arlettae) KCTC3588, 108 CFU/㎖
5: 스타필로코커스 아르레태 KCTC3588, 108 CFU/㎖
6: 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) KCTC1831, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
7: 바실러스 리체니포르미스 KCTC1831, 108 CFU/㎖
8: 바실러스 리체니포르미스 KCTC3006, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
9: 바실러스 리체니포르미스 KCTC3006, 108 CFU/㎖
10: 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCTC1526, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
11: 바실러스 세레우스 KCTC1526, 108 CFU/㎖
12: 스타필로코커스 아우레우스 KCTC1916, 102 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
13: 스타필로코커스 아우레우스 KCTC1928, 105 CFU/㎖
14: 스타필로코커스 아우레우스 KCTC1928, 105 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
15: 스타필로코커스 아우레우스 KCTC1927, 105 CFU/㎖
16: 스타필로코커스 아우레우스 KCTC1927, 105 CFU/㎖
17: 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) KCTC3013, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
18: 바실러스 섭틸리스 KCTC3013, 108 CFU/㎖
19: 바실러스 섭틸리스 KCTC1661, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
20: 바실러스 세레우스 KCTC1661, 108 CFU/㎖
21: 스타필로코커스 렌투스(Staphylococcus lentus) KCTC3577, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
22: 스타필로코커스 렌투스 KCTC3577, 108 CFU/㎖
23: 스타필로코커스 에피더미디스 KCTC1917, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
24: 스타필로코커스 에피더미디스 KCTC1917, 108 CFU/㎖
25: 스타필로코커스 코니(Staphylococcus cohnii) KCTC3574, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
26: 스타필로코커스 코니 KCTC3574, 108 CFU/㎖
27: 바실러스 세레우스 KCTC3674, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
28: 바실러스 세레우스 KCTC3674, 108 CFU/㎖
29: 바실러스 섭틸리스 KCTC2213, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
30: 바실러스 섭틸리스 KCTC2213, 108 CFU/㎖
31: 스타필로코커스 카프래(Staphylococcus caprae) KCTC3583, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
32: 스타필로코커스 카프래 KCTC3583, 108 CFU/㎖
33: 스타필로코커스 워네리(Staphylococcus warneri) KCTC3340, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:5 및 6의 프라이머 쌍으로 PCR 함
34: 스타필로코커스 워네리 KCTC3340, 108 CFU/㎖
도 7에서, 레인 12 내지 15의 스타필로코커스 아우레우스 만이 검출됨을 알 수 있어, SEQ ID NO:7 및 8의 프라이머 쌍은 스타필로코커스 아우레우스에 특이적임을 확인하였다.
3-3. SEQ ID NO:17 및 18의 프라이머 쌍
도 8은 리스테리아 모노시아토게네스 검출용 프라이머(SEQ ID NO:17 및 88)로 nested PCR한 결과로, 각 레인의 정보는 하기와 같다.
레인 M : 사이즈마커(Size marker)
1: 리스테리아 그레이(Listeria grayi) ATCC25400, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR 함
2: 리스테리아 무레이(Listeria murray) ATCC25402, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR 함
3: 리스테리아 무레이 ATCC25403, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR 함
4: 리스테리아 그레이 ATCC700545, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR 함
5: 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii) ATCC49953, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR 함
6: 리스테리아 이바노비 섭스. 온도니엔시스(Listeria ivanovii subsp . Londoniensis) ATCC49954, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR 함
7: 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) ATCC33090, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR 함
8: 리스테리아 이노쿠아 ATCC33091, 108 CFU/㎖, SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR 함
9: 리스테리아 그레이 ATCC25400, 108 CFU/㎖
10: 리스테리아 무레이 ATCC25402, 108 CFU/㎖
11: 리스테리아 무레이 ATCC25403, 108 CFU/㎖
12: 리스테리아 그레이 ATCC700545, 108 CFU/㎖
13: 리스테리아 이바노비 ATCC49953, 108 CFU/㎖
14: 리스테리아 이바노비 섭스.온도니엔시스 ATCC49954, 108 CFU/㎖
15: 리스테리아 이노쿠아 ATCC33090, 108 CFU/㎖
16: 리스테리아 이노쿠아 ATCC33091, 108 CFU/㎖
17: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC3152, 105 CFU/㎖, SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR 함
18: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC3152, 105 CFU/㎖
19: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC15313, 105 CFU/㎖, SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR 함
20: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC15313, 105 CFU/㎖
21: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC19112, 105 CFU/㎖, SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR 함
22: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC19112, 105 CFU/㎖
23: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC19113, 105 CFU/㎖, SEQ ID NO:15 및 16의 프라이머 쌍으로 PCR 함
24: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC19113, 105 CFU/㎖
25: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC BAA-676, 105 CFU/㎖
26: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC BAA-676, 105 CFU/㎖
도 8에서, 레인 17 내지 26에서 SEQ ID NO:17 및 18의 프라이머 쌍에 의하여 증폭된 454 bp 및/또는 191bp가 검출되었다.
실시예
4:
PCR
검출키트
4-1. 살모넬라 속 균주 검출용 키트
5X Reaction Buffer
프라이머 혼합액 (SEQ ID NO:1 내지 4)
Taq DNA 중합효소(1 U/㎕)
대조군 DNA(살모넬라 속 균주의 정제된 DNA, 10 ng/㎕)
4-2. 스타필로코커스 아우레우스 검출용 키트
5X Reaction Buffer
프라이머 혼합액 (SEQ ID NO:5 내지 8)
Taq DNA 중합효소(1 U/㎕)
대조군 DNA(스타필로코커스 아우레우스의 정제된 DNA, 10 ng/㎕)
4-3. 대장균 O157:H7 검출용 키트
5X Reaction Buffer
프라이머 혼합액 (SEQ ID NO:9 내지 12 또는 SEQ ID NO:9-10, 13-14)
Taq DNA 중합효소(1 U/㎕)
대조군 DNA(대장균 O157:H7의 정제된 DNA, 10 ng/㎕)
4-4. 리스테리아 모노사이토게네스 검출용 키트
5X Reaction Buffer
프라이머 혼합액 (SEQ ID NO:15 내지 18)
Taq DNA 중합효소(1 U/㎕)
대조군 DNA(리스테리아 모노사이토게네스의 정제된 DNA, 10 ng/㎕)
4-5. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 검출용 키트
5X Reaction Buffer
프라이머 혼합액(SEQ ID NO:19 내지 22 또는 SEQ ID NO:19-20, 23-24)
Taq DNA 중합효소(1 U/㎕)
대조군 DNA(비브리오 파라헤몰리티쿠스의 정제된 DNA, 10 ng/㎕)
4-6. 다중 검출키트
5X Reaction Buffer
프라이머 혼합액(SEQ ID NO:1-12 및 15-22, 또는 SEQ ID NO:1-10, 13-20 및 23-24)
Taq DNA 중합효소(1 U/㎕)
대조군 DNA(10 ng/㎕)
상기 대조군 DNA는 살모넬라 속 균주의 DNA, 스타필로코커스 아우레우스의 DNA, 대장균 O157:H7의 DNA, 리스테리아 모노사이토게네스의 DNA, 비브리오 파라헤몰리티쿠스의 DNA로 이루어진다.
실시예
5 : 식품에서의 식중독균 검출
인위 제조된 오염 식품의 배양액을 대상으로, 상기 실시예 4-1의 검출키트를 사용하여 PCR을 실시하였다.
4개의 식품(샌드위치, 햄버거, 탕수육, 날치알)에 대해 각 25 g의 검체를 LB(Luria Burtani) 배지 225 ㎖에 접종하여 37 ℃, 80 rpm으로 16시간 배양하였다. 배양액 1 ㎖을 SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR하여 살모넬라균이 존재하지 않음을 확인한 후, 잔여 배양액을 멸균하였다. 멸균된 배양액 9 ㎖에 약 108 CFU/㎖의 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) ATCC14023을 접종한 후, 연속 희석하여 1 내지 107 CFU/㎖의 검체를 제조하였다.
검체 1 ㎖에 프로테나제 K(20 ㎎/㎖) 20 ㎕를 가하고 60℃에서 10분간 반응시켰다. 10,000g에서 5분간 원심분리하고, 펠렛을 회수하여 200 ㎕의 멸균수로 부유시킨 다음 105 ℃에서 20분간 가열하고 동일 부피의 페놀/클로로포름 혼합액을 가하여 혼합하였다. 이후 10,000g에서 5분간 원심분리하여 상등액을 회수하고 동일 부피의 에탄올을 가하여 혼합한 후 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 상기 펠렛은 20 ㎕의 멸균수에 현탁하여 PCR용 시료 DNA를 제조하였다.
PCR은 Biometra T-personal Thermal PCR Machine에서 실시하였다.
PCR 조건:
94℃, 5분 -> 1차(94℃, 30초 -> 60℃, 150초 -> 72 ℃, 30초), 5회 반복 -> 2차(88℃, 30초 -> 60℃, 30초 -> 72℃, 30초), 15회 반복) -> 3차(88℃, 30초 -> 54℃, 30초 -> 72℃, 30초), 10회 반복) -> 4차(86℃, 30초 -> 54℃, 30초 -> 72 ℃, 30초), 25회 -> 72℃, 10분
도 9는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) ATCC14023에 오염된 식품에 대한 SEQ ID NO:1 내지 4의 2종의 프라이머 쌍을 이용한 nested PCR 결과를 나타낸 것으로, 각 레인은 다음과 같다.
레인 M : 사이즈마커(Size marker)
1: 살모넬라 속 균주의 DNA 10 ng, SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머 쌍으로 PCR 함
2: 음성 대조군(DNA 포함하지 않음)
3: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 105 CFU/㎖ - 날치알
4: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 104 CFU/㎖ - 날치알
5: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 103 CFU/㎖ - 날치알
6: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 102 CFU/㎖ - 날치알
7: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 101 CFU/㎖ - 날치알
8: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 105 CFU/㎖ - 탕수육
9: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 104 CFU/㎖ - 탕수육
10: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 103 CFU/㎖ - 탕수육
11: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 102 CFU/㎖ - 탕수육
12: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 101 CFU/㎖ - 탕수육
13: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 104 CFU/㎖ - 햄버거
14: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 103 CFU/㎖ - 햄버거
15: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 102 CFU/㎖ - 햄버거
16: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 101 CFU/㎖ - 햄버거
17: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 105 CFU/㎖ - 샌드위치
18: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 104 CFU/㎖ - 샌드위치
19: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 103 CFU/㎖ - 샌드위치
20: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 102 CFU/㎖ - 샌드위치
21: 살모넬라 티피무리움 ATCC14023, 101 CFU/㎖ - 샌드위치
도 9에서, SEQ ID NO:3 및 4의 프라이머 쌍에 의하여 증폭된 200 bp의 유전자가 10 CFU/㎖까지 확인되었다.
실시예
6: 마이크로
PCR
6-1. SEQ ID NO:3 및 4의 프라이머 쌍을 이용한 마이크로 PCR
살모넬라 엔테리티디스 KCCM12021 108 CFU/mL을 대상으로 마이크로PCR을 실시하였다. 실험은 2군으로 나누어 실시하였고, 한 군은 SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머 쌍을 이용하였고, 다른 한군은 SEQ ID NO:1 내지 4의 2종이 프라이머 쌍을 이용하였다.
마이크로 PCR 조건은 하기와 같이 실시하였다.
94℃, 10분 -> (94℃, 5초 -> 60℃, 5초 -> 72℃, 5초), 100회 반복 -> 72℃, 5분
도 10은 살모넬라 엔테리티디스 KCCM12021에 대한 마이크로 PCR 결과를 나타낸 것으로, 1은 SEQ ID NO:1 내지 4의 2종의 프라이머 쌍을 이용한 것이고, 2는 SEQ ID NO:1 및 2의 프라이머 쌍을 이용한 것이다. 우측의 그래프는 멜팅 커브(Melting curve)로서 Tm 값을 산출할 수 있다. Tm 값은 이중가닥 DNA와 단일가닥 DNA가 각각 50% 존재하는 온도로, 이 시점에서의 신호를 평균하여 정량적 곡선의 표준곡선을 완성할 수 있다.
도 10에서, 1이 2에 비하여 빠른 CT (Cycle Time)값을 가져, SEQ ID NO:3 및 4의 프라이머를 이용하는 것이 효율적임을 알 수 있다.
실시예
7: 마이크로
PCR
용
검출키트
7-1. 2종의 프라이머 쌍을 포함하는 검출키트
4X 그린스타(Greenstar) ------------- 5 ㎕
10mM MgCl2 ------------------------ 1 ㎕
프라이머 혼합액 (각 0.2uM/㎕) ------- 8 ㎕
시료 DNA (<500 ng) -------------- 6 ㎕
--------------------------------------------
총 부피 ------------ 20 ㎕
7-2. 1종의 프라이머 쌍을 포함하는 검출키트
4X 그린스타 -------------------- 5 ㎕
10 mM MgCl2 -------------------- 1 ㎕
프라이머 혼합액(0.2 uM/㎕) ---------- 4 ㎕
시료 DNA(<500ng)
뉴클레이즈 무함유 물(Nuclease-free water) upto 20 ㎕
상기 프라이머 혼합액은, 경우에 따라 표 3으로 구성된다.
| 검출 대상 | 프라이머 | |
| 2종의 프라이머 쌍을 이용한 키트 | 살모넬라 속 균주 | SEQ ID NO:1, 2, 3 및 4 |
| 스타필로코커스 아우레우스 | SEQ ID NO:5, 6, 7 및 8 | |
| 대장균O157 | SEQ ID NO:9, 10, 11, 및 12 또는 SEQ ID NO:9, 10, 13 및 14 | |
| 리스테리아 모노사이토게네스 | SEQ ID NO:15, 16, 17 및 18 | |
| 비브리오 파라헤몰리티쿠스 | SEQ ID NO:19, 20, 21 및 22 또는 SEQ ID NO:19, 20, 23 및 24 | |
| 이상 5종의 병원성 미생물 | SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22 또는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22 또는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 23 및 24 또는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 23 및 24 | |
| 1종의 프라이머 쌍을 이용한 키트 | 살모넬라 속 균주 | SEQ ID NO:3 및 4 |
| 스타필로코커스 아우레우스 | SEQ ID NO:7 및 8 | |
| 대장균O157 | SEQ ID NO:11 및 12 또는 SEQ ID NO:13 및 14 | |
| 리스테리아 모노사이토게네스 | SEQ ID NO:17 및 18 | |
| 비브리오 파라헤몰리티쿠스 | SEQ ID NO:21 및 22 또는 SEQ ID NO:23 및 24 | |
| 이상 5종의 병원성 미생물 | SEQ ID NO:3, 4, 7, 8, 11, 12, 17, 18, 21 및 22 또는 SEQ ID NO:3, 4, 7, 8, 13, 14, 17, 18, 21 및 22 또는 SEQ ID NO:3, 4, 7, 8, 11, 12, 17, 18, 23 및 24 또는 SEQ ID NO:3, 4, 7, 8, 13, 14, 17, 18, 23 및 24 |
실시예
8: 마이크로
PCR
용
검출키트를
이용한 식중독균 검출
8-1. 시료 준비
살모넬라균에 오염이 되었으리라 의심되는 식품 25 g을 정량한 후 100 ㎖의 멸균수를 첨가하여 분쇄기로 파쇄하였다. 파쇄물을 여과지로 여과하여 여액을 회수하고, 1 ㎖에 프로테나제 K(20 ㎎/㎖) 20 ㎕를 가하여 60 ℃에서 10분간 반응시켰다. 10,000g에서 5분간 원심분리하여 펠렛을 수득한 후 200 ㎕의 멸균수에 현탁하였다. 이를 105 ℃에서 20분간 열처리한 후 여기에 동일 부피의 페놀/클로로포름을 혼합하고 원심분리하여 상등액만을 회수하였다. 상등액에 동일 부피의 에탄올을 혼합하고 원심분리하여 펠렛을 분리한 후 20 ㎕의 멸균수를 가하여 현탁시킨다.
8-2. 마이크로 PCR 조건
실시예 7에 기재된 검출키트 조성물을 이용하여 PCR 반응 혼합물을제조한 후, 1㎕를 취하여 삼성종합기술원에서 제조한 진스펙터 마이크로 칩(Genespector Micro chip)에 기포가 형성되지 않게 주입하고 밀봉하였다.
상기 칩은 진스펙터 마이크로 PCR 기기를 활용하여 다음과 같이 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
(1) 1종의 병원성 미생물에 대하여 2종의 프라이머 세트를 사용하여 nested PCR하는 경우
- 1차 반응조건 : 초기 변성(Initial Denaturation)을 94℃에서 10분간 수행한 후, 변성(Denaturation, 94℃에서 5초), 결합(Annealing, 60℃에서 5초), 연장(Extension, 72℃에서 5초)를 총 20회 실시한다.
- 2차 반응조건: 변성(88℃, 5초) -> 결합(72℃, 5초) -> 연장(73℃, 5초), 총 30회
- 3차 반응조건: 변성(88℃, 5초) -> 결합(54℃, 5초) -> 연장(72℃, 5초), 총 20회
- 4차 반응조건: 변성(72℃, 5초) -> 결합(55℃, 5초) -> 연장(73℃, 5초), 총 50회
(2) 1종의 병원성 미생물에 대하여 1종의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 하는 경우
- 초기 변성을 94℃에서 10분간 수행한 후, 변성(94℃에서 5초), 결합(60℃에서 5초), 연장(Extension, 72℃에서 5초)를 총 100회 실시한다.
상기 PCR 반응 후 용융곡선 분석(Melting curve analysis)을 하기 조건에서 수행한다.
- 초기 온도: 60℃
- 종결 온도: 90℃
- 램프 속도(Ramp rate): ℃/sec
- 출구온도(Exit Temperature) : 40℃
실시예
9: 마이크로
PCR
의 검출한계 검증
9-1. 살모넬라 속 균주
실시예 7-1의 2종의 프라이머 쌍을 이용한 마이크로 PCR 조성물을 준비하고, 실시예 8(1)의 조건으로 마이크로 PCR을 실시하였다. 사용한 프라이머는 SEQ ID NO:1 내지 4이며, 검체는 살모넬라 엔테리티디스 KCCM12021이다.
도 11은 살모넬라 엔테리티디스에 대한 SEQ ID NO:1 내지 4의 2종 프라이머쌍을 이용한 nested PCR에서, 살모넬라의 농도에 따른 검출한계를 분석한 것이다. 도 11에서, 1은 살모넬라 엔테리티디스 107 CFU/㎖에 대한 결과이고, 2는 10 CFU/㎖ 에 대한 결과이고, 3은 음성 대조군이다.
9-2. 살모넬라 속 균주
실시예 7-2의 1종의 프라이머 쌍을 이용한 마이크로 PCR 조성물을 준비하고, 실시예 8(2)의 조건으로 마이크로 PCR을 실시하였다. 사용한 프라이머는 SEQ ID NO:3 내지 4이며, 검체는 살모넬라 엔테리티디스 KCCM12021이다.
도 12는 살모넬라 엔테리티디스에 대한 SEQ ID NO:3 및 4의 1종 프라이머쌍을 이용한 마이크로 PCR에서, 살모넬라의 농도에 따른 검출한계를 분석한 것이다. 도 12에서, 4는 살모넬라 엔테리티디스 103 CFU/㎖에 대한 결과이고, 3은 102 CFU/㎖에 대한 결과이고, 2는 101 CFU/㎖에 대한 결과이고, 1은 SEQ ID NO:1 내지 4의 2종 프라이머 쌍을 사용한 것이다. 도 12에서 2, 3 및 4는 동일한 시작점(start point)을 갖으며, 2종의 프라이머 쌍은 서로 간에 다이머(dimer)가 형성되었음을 알 수 있었다. 동일한 시작점은 카피 수(starting copy number)가 같음을 의미하는 것으로, 동일한 검출한계를 보임을 알 수가 있다. 상기 마이크로 PCR에 의한 검출한계는 10 CFU/㎖이다.
9-3. 스타필로코커스 아우레우스
실시예 7-2의 1종의 프라이머 쌍을 이용한 마이크로 PCR 조성물을 준비하고, 실시예 8(2)의 조건으로 마이크로 PCR을 실시하였다. 사용한 프라이머는 SEQ ID NO:7 및 8이며, 검체는 스타필로코커스 아우레우스 KCCM1927이다.
도 13은 스타필로코커스 아우레우스에 대한 SEQ ID NO:7 및 8의 1종 프라이머쌍을 이용한 마이크로 PCR에서, 살모넬라의 농도에 따른 검출한계를 분석한 것이다. 도 13에서, 1은 양성 대조군이고, 2는 SEQ ID NO:5 및 6의 1종 프라이머 쌍을 이용한 것고, 3은 스타필로코커스 아우레우스 104 CFU/㎖에 대한 결과이고, 4는 103 CFU/㎖에 대한 결과이고, 5는 102 CFU/㎖에 대한 결과이고, 6은 101 CFU/㎖에 대한 결과이다. 이의 검출한계는 10 CFU/㎖이다.
9-4. 대장균 O157
실시예 7-2의 1종의 프라이머 쌍을 이용한 마이크로 PCR 조성물을 준비하고, 실시예 8(2)의 조건으로 마이크로 PCR을 실시하였다. 사용한 프라이머는 SEQ ID NO: 11 및 12이며, 검체는 대장균 O157:H7 ATCC12024이다.
도 14는 대장균 O157:H7 에 대한 SEQ ID NO:_ 및 _의 1종 프라이머쌍을 이용한 마이크로 PCR에서, 살모넬라의 농도에 따른 검출한계를 분석한 것이다. 도 14에서, 1은 양성 대조군이고, 2는 음성 대조군이고, 3은 대장균 O157:H7 104 CFU/㎖에 대한 결과이고, 4는 103 CFU/㎖에 대한 결과이고, 5는 102 CFU/㎖에 대한 결과이고, 6은 101 CFU/㎖에 대한 결과이다. 이의 검출한계는 10 CFU/㎖이다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 병원성 미생물 검출용 프라이머 쌍은 살모넬라 속 균주, 스타필로코커스 아우레우스, 대장균 O157, 리스테리아 모노사이토게네스 및 비브리오 파라헤몰리티쿠스 각각의 특이 유전자를 신속 정확하게 증폭시키며, 100 내지 10 CFU/ml의 검출한계를 갖는다. 따라서, 상기 프라이머 쌍을 이용하여 병원성 미생물의 감염 여부를 5시간 이내에 진단할 수 있는 신속한 역학조사를 수행할 수 있다.
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Claims (8)
- SEQ ID NO:3에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 SEQ ID NO:4에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어진 살모넬라 속 균주(Salmonella spp) 검출용 프라이머 쌍;SEQ ID NO:7에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 SEQ ID NO:8에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 쌍;SEQ ID NO:11에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 SEQ ID NO:12에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어진 대장균 O157(E. coli O157:H7) 검출용 프라이머 쌍;SEQ ID NO:13에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 SEQ ID NO:14에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어진 대장균 O157 검출용 프라이머 쌍;SEQ ID NO:17에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 SEQ ID NO:18에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 검출용 프라이머 쌍;SEQ ID NO:21에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 SEQ ID NO:22에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스 검출용 프라이머 쌍; 및SEQ ID NO:23에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 SEQ ID NO:24에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 프라이머 쌍;으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 프라이머 쌍을 포함하는병원성 미생물 검출용 프라이머.
- 제 1항에 있어서, 상기 병원성 미생물 검출용 프라이머는제 1항의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 실시하기 전에 사용되거나 제 1항의 프라이머와 동시에 사용하여 중합효소연쇄반응을 실시하기 위한,SEQ ID NO:1에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 SEQ ID NO:2에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어진 살모넬라 속 균주 검출용 프라이머 쌍;SEQ ID NO:5에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 SEQ ID NO:6에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 쌍;SEQ ID NO:9에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 SEQ ID NO:10에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어진 대장균 O157 검출용 프라이머 쌍;SEQ ID NO:15에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 SEQ ID NO:16에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스 검출용 프라이머 쌍;SEQ ID NO:19에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 SEQ ID NO:20에 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스 검출용 프라이머 쌍;으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되는 프라이머 쌍을 더욱 포함하는 것인 병원성 미생물 검출용 프라이머.
- 제1항 또는 제2항에 따른 병원성 미생물 검출용 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 병원성 미생물을 탐지하는 것을 포함하는 병원성 미생물 검출방법.
- 제3항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 열 블록 중합효소연쇄반응(Thermal Block PCR) 기기 또는 마이크로 중합효소연쇄반응(Micro PCR) 기기로 실시하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 제2항의 프라이머로 실시한 후 제1항의 프라이머로 2차 실시되는 것인 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 제1항의 프라이머 및 제2항의 프라이머를 동시에 사용하여 실시되는 것인 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 검출방법은 2종 이상의 다른 병원성 미생물 검출용 프라이머 쌍을 이용한 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex polymerase Chain Reaction)로 실시되며, 식중독의 원인이 되는 2종 이상의 병원성 미생물을 동시에 탐지하는 것을 포함하는 검출방법.
- 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 PCR 프라이머, 반응완충액 및 Taq DNA 중합효소을 포함하는 병원성 미생물의 검출키트에 있어서,상기 PCR 프라이머는 제 1항 또는 2항에 따른 프라이머 세트인 병원성 미생물 검출키트.
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