KR101079829B1 - 식품 미생물균 ｄｎａ 자동 분석 방법 및 장치 - Google Patents

식품 미생물균 ｄｎａ 자동 분석 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따르면, 식료품으로부터 채취한 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 DNA를 증폭시키고, 신호 프로브(probe)를 생성시키는 단계; 및, 상기 증폭된 DNA 의 신호 프로브를 래피드 스트립 키트(rapid strip kit)에 적용하여 미생물균의 존재 여부를 판독하는 단계를 구비하는, 식품 미생물균 DNA 자동 분석 방법이 제공된다. 또한 상기 방법을 수행하기 위한 식중독균의 식품 미생물균 DNA 자동 분석 장치가 제공된다.
Figure R1020080069736
미생물균, 식중독균, DNA

Description

식품 미생물균 ＤＮＡ 자동 분석 방법 및 장치{Method and Apparatus For Automatically Analyzing DAN of Microbe In Food}
본 발명은 식품 미생물균 DNA 자동 분석 방법 및 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 증폭된 DNA 산출물을 이용하여 식중독균의 유무를 신속하고 정확하게 판단할 수 있는 식중독균으로 대표되는 식품 미생물균의 DNA 자동 분석 방법 및 장치에 관한 것이다.
최근 식품 안전에 관한 관심이 높아지고 있으며, 특히 학교나 직장과 같이 대량 급식이 이루어지는 곳에서는 식중독을 예방하기 위하여 조리 과정을 개선하고 식품 관리를 강화하기 위한 다각적인 노력이 수행되고 있다. 식중독을 예방하기 위한 가장 효과적인 방법중 하나는 식품이나 식자재 자체에 식중독균이 존재하고 있는지의 여부를 직접적으로 검사하는 것이다.
통상적으로 식중독균의 검사 방법에는 배지법(균 배양법), 유전자법, 면역학적 검사법 및 ATP 검사법등이 있다. 이러한 검사 방법들중 배지법은 가장 널리 쓰이는 방법으로서, 별도의 기계 장치 없이 수행될 수 있다는 장점이 있으나 검사 시간이 3 내지 5 일이나 걸린다는 단점 때문에 식중독 사고의 사전 예방이나 사건 발 생후 신속한 사후 처리가 어렵다는 문제점이 있다. 또한 면역학적 검사 방법은 검사가 간단하고 별도의 장비가 불필요하지만 검사 대상균이 제한적이고 부정확하다는 단점이 있으며, ATP 검사 방법은 식중독균 측정을 수행하는데는 적절하지 않다는 문제점이 있다.
한편, 유전자법은 민감도가 좋기 때문에 신속하고 정확하지만 결과 판정을 위한 고가의 장비를 이용하거나 또는 전기 영동을 통해 결과를 확인할 수 있으나 숙련된 인력이 필요하다는 문제점이 있다. 예를 들면, 종래 기술에 따른 RT(real time) PCR 이라는 장비를 이용하는 경우에, 신속하고 정확하게 식중독균의 존재 여부를 판단할 수 있으나, 이것은 장비 자체의 가격이 매우 비싸고, 더욱이 장비 운용자가 분자 진단이라는 전문 지식을 필요로 한다. 따라서 이러한 유전자법을 이용한 식중독균의 검사는 주로 정부 기관이나 대기업에서 사용될 수는 있으나, 중소 식품 제조 업체나 유통업체의 비전문가들이 손쉽게 이용되기에는 부적합한 것이다. 따라서 식중독균의 검사에 있어서 신속하면서 저렴한 비용으로 누구라도 용이하게 이용할 수 있는 방법 및 장비를 제공할 필요성이 있는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 개선된 식품 미생물균 DNA 자동 분석 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유전자법을 이용하여 미생물균의 유무를 판단할 수 있는 식품 미생물균 DNA 자동 분석 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 미생물균중 식중독균의 검사 과정이 자동화되어 수행될 수 있는 식품 미생물균 DNA 자동 분석 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따르면,
식료품으로부터 채취한 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
상기 DNA를 증폭시키고, 신호 프로브(probe)를 생성시키는 단계; 및,
상기 증폭된 DNA의 신호 프로브를 래피드 스트립 키트(rapid strip kit)에 적용하여 미생물균이나 식중독균의 존재 여부를 판독하는 단계를 구비하는, 식품 미생물균 DNA 자동 분석 방법이 제공된다.
본 발명의 일 특징에 따르면,
상기 DNA를 추출하는 단계는:
식료품이나 가검물로부터 시료를 채취하여 배양시키는 시료 채취 및 배양 단계;
배양액을 채취한 후 세포를 분리하기 위한 원심 분리 단계;
분리된 세포에서 세포를 파괴하기 위하여 세포를 가열 및 냉각시키는 단계;
파괴된 세포에서 DNA를 추출하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 다른 특징에 따르면,
상기 추출된 DNA 의 증폭 및 신호 프로브 생성 단계는:
DNA 에 증폭 혼합액 및 프라이머(primer) 혼합액을 혼합시키는 단계;
DNA 와 상기 혼합액들을 가열, 냉각하는 단계;
효소(enzyme) 혼합액과 프로브(probe) 혼합액을 혼합시키는 단계;
상기 효소 혼합액과 프로브 혼합액을 혼합시킨 것을 DNA 에 첨가시키는 단계;
상기 DNA 을 가열 및 다시 냉각시키는 단계;
상기 DNA 에 러닝 버퍼(running buffer) 용액을 혼합시키는 단계;를 포함한다.
본 발명의 다른 특징에 따르면,
상기 래피드 스트립 키트는:
베이스 멤브레인;
상기 베이스 멤브레인상에 배치되며 상기 DNA 의 신호 프로브가 적용되는 샘플 적용 패드;
항체 염료 결합물을 포함하는 염료 패드; 및,
상기 DNA 의 신호 프로브에 대한 항체를 가진 테스트 라인 및 상기 항체 염료 결합물에 대한 인디케이터 항체를 가진 콘트롤 라인을 구비하는 심지 멤브레인;을 포함하고,
상기 DNA 로부터 생성된 신호 프로브를 샘플 적용 패드에 적용하여, 상기 테스트 라인 및 상기 콘트롤 라인에서 발색이 발생됨으로써 식중독균의 존재가 판독된다.
또한 본 발명에 따르면,
상호 직교하고 상호간의 평면 직교 좌표 운동이 가능한 X 축 및 Y 축;
상기 X 축을 따라서 왕복 운동하는 Z 축;
상기 Z 축을 따라서 승강 운동하는 튜브 파지용 그리퍼;
상기 Z 축을 따라서 승강 운동하며 액체를 흡입 및 배출시키는 니들 펌프;
상기 평면 직교 좌표 운동 영역내에 위치하고 튜브가 삽입될 수 있는 튜브 랙을 구비하는 원심 분리기;
다수의 튜브가 거치될 수 있는 튜브 거치대 및 튜브 거치대;
상기 튜브 거치대에 거치된 튜브를 가열 및 냉각시킬 수 있는 가열 냉각부;를 포함하는, 식품 미생물균 DNA 자동 분석 장치가 제공된다.
본 발명의 다른 특징에 따르면,
상기 튜브 랙은 일정 간격으로 배치된 복수의 지지부의 단부에 설치되고,
상기 튜브는 일 직선상에서 등간격으로 배치되고,
상기 니들 펌프의 단부에 구비된 피펫에 제거 가능하게 팁을 제거하기 위한 팁 제거부를 더 구비한다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 상기 평면 직교 좌표 운동 영역내에 위치하는 복수의 혼합액 용기 및 복수의 버퍼 용기를 구비한다.
본 발명에 따른 식품 미생물균 DNA 자동 분석 방법 및 장치는 식중독균을 포함하는 식품 미생물균을 신속하고 정확하게 검사할 수 있다는 장점을 가진다. 또한 식품 제조 현장, 식품 유통 현장 및 급식 현장에서 전문적인 지식 없이도 용이하게 식중독균을 검사할 수 있으므로 사용상의 편의성이 향상될 수 있으며 저렴한 비용 으로 검사가 수행될 수 있다는 장점을 가진다.
이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
도 1 에 도시된 것은 본 발명에 따른 식품 미생물균 DNA 자동 분석 장치의 개략적인 구성을 나타내는 사시도이다.
도면을 참조하면, 식품 미생물균 DNA 자동 분석 장치는 직교 좌표상에서의 상대 운동이 가능한 X 축(11) 및 Y 축(12)과, 상기 X 축(11)을 따라서 이동할 수 있는 Z 축(15)을 구비한다. X 축(11) 및 Y 축(12)은 예를 들면 제 1 슬라이드(13)에 의해서 상대 운동이 가능하고, Z 축(15)은 제 2 슬라이드(14)에 의해서 이동이 가능하다. 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, X 축(11), Y 축(12) 및 Z 축(15)의 구동을 위해서 다양한 수단이 이용될 수 있으며, 예를 들면 볼 스크류 또는 리니어 모터등과 같은 통상적인 구동 수단이 이용될 수 있다.
Z 축(15)에는 그리퍼(35) 및 니들 펌프(36)가 승강 가능하게 설치된다. 그리퍼(35) 및 니들 펌프(36)는 Z 축(15)을 따라서 공지된 수단에 의하여, 예를 들면 리니어 모터, 볼 스크류, 공압 실린더 또는 유압 실린더등에 의해서 승강될 수 있다. 그리퍼(35)는 튜브(T)를 파지하여 집어 올리거나 또는 내려놓기 위한 것이다. 니들 펌프(36)는 매우 작은 양의 액체를 흡인하거나 배출시킬 수 있는 흡입력을 제공하는 펌프이다. 니들 펌프(36)는 피펫(37)을 구비하며, 피펫(37)의 단부는 피펫 팁(610)에 삽입된다. 니들 펌프(36)의 작용에 의해 피펫(37)은 튜브(T) 안에 담긴 액체를 흡인하거나 배출할 수 있다. 그리퍼(35) 및 니들 펌프(36)가 설치되어 있는 Z 축(15)은 X 축(11) 및 Y 축(12)의 직교 좌표 운동을 통해서 미리 정해진 위치로 이동할 수 있으며, 결과적으로 그리퍼(35) 및 니들 펌프(36)는 직교 좌표 평면상의 정해진 위치로 이동할 수 있다. 또한 그리퍼(35) 및 니들 펌프(36)는 Z 축(15)을 따라 승강하거나 하강함으로써, 그리퍼(35)가 튜브(T)를 파지하거나 해제할 수 있는 높이에 도달할 수 있고, 니들 펌프(36)가 피펫(37)을 통하여 튜브(T)에 담긴 액체를 흡인하거나 또는 배출할 수 있는 높이에 도달할 수 있다. 피펫(37)의 단부에는 팁(tip)이 제거 가능하게 설치됨으로써, 튜브(T)에 담긴 액체는 팁 안의 공간에 담길 수 있다. 액체에 의한 오염이 방지될 수 있도록 팁은 교환될 수 있다.
도면에 도시된 예에서 그리퍼(35) 및 니들 펌프(36)는 하나씩 구비되어 있으나, 다른 예에서는 그리퍼(35) 및 니들 펌프(36) 각각이 복수의 개수로 구비될 수 있다. 예를 들면 그리퍼(35)는 6 개가 구비될 수 있으며, 6 개의 그리퍼가 동시에 6 개의 튜브(T)를 파지하거나 해제할 수 있다. 마찬가지로 니들 펌프(36)도 6 개가 구비될 수 있으며, 동시에 흡인 및 배출 작용을 수행할 수 있다.
장치의 일측에는 원심 분리기(30)가 구비된다. 원심 분리기(30)에는 회전 모터(38)가 구비되며, 회전 모터(38)의 구동에 의해서 로터(38a)가 회전할 수 있다. 로터(38a)에는 복수개의 지지부(38b)가 고정되고, 상기 지지부(38b)의 단부에 튜브 랙(tube rack, 38c)이 설치된다. 튜브 랙(38c)에는 복수개의 튜브(T)들이 삽입될 수 있다.
도면에 도시된 예에서는 반경 방향으로 연장된 지지부(38b)가 90 도 각도로 4 개 설치되고, 각각의 지지부(38b)의 단부에 설치된 튜브 랙(38c)에 6 개의 튜브(T)들이 삽입될 수 있도록 되어 있는 것이 도시되어 있다. 튜브 랙(38c)에는 튜브(T)들을 일정한 간격으로 수용할 수 있는 삽입 구멍이 형성될 수 있다. 이와 같이 지지부(38b)의 단부에 튜브 랙(38c)이 설치됨으로써 튜브(T)에 담긴 액체에 가해지는 원심력은 최대화될 수 있다. 도시되지 않은 다른 예에서는 지지부(38b)가 2 개, 3 개, 5 개 또는 그 이상의 수로 등간격으로 배치될 수 있으며, 튜브 랙(38c)에 삽입되는 튜브의 수도 변화될 수 있다. 위에서 설명된 바와 같이, 튜브(T)는 튜브 랙(38c)에서 일정한 간격으로 배치되어 수용된다. 튜브 랙(38c)은 도면에 도시된 예에서와 같이 직선형으로 형성되고, 그 위에 튜브(T)들이 직선을 이루어 배치되는 것이 바람직스럽다. 그러나 도면에 도시되지 않은 다른 예에서는 튜브 랙(38c)이 원호형이거나 또는 직사각형의 형상을 가질 수 있다.
장치의 일측에는 가열 냉각부(45)가 설치되어 있다. 가열 냉각부(45)는 튜브에 담긴 액체를 가열하거나 냉각시켜서 세포를 파괴시키거나 또는 열처리하기 위한 것이다. 가열 냉각부(45)는 예를 들면 공지된 펠티어(peltier) 소자를 이용하여 구현할 수 있다. 다른 예에서는 전기 히터를 이용하여 가열을 수행하고, 펠티어 소자를 이용하여 냉각을 수행하거나, 또는 다른 냉각 소자를 이용할 수 있다. 가열 냉각부(45)의 상부에는 다수의 튜브(T)들을 거치할 수 있는 제 1 튜브 거치대(61)가 배치된다. 제 1 튜브 거치대(61)에는 튜브(T)들이 삽입될 수 있는 다수의 구멍들이 형성되어 있으며, 튜브(T)들은 그리퍼(35)에 의해서 제 1 튜브 거치대(61)의 구멍에 삽입된 상태로 거치되어 가열되거나 냉각될 수 있다.
제 1 튜브 거치대(61)의 일측에는 제 2 튜브 거치대(62)가 구비된다. 제 2 튜브 거치대(62)의 형상은 실질적으로 제 1 튜브 거치대(61)와 유사하다. 튜브(T)들이 제 2 튜브 거치대(62)의 구멍에 삽입된 상태로 배치된다. 이후에 상세하게 설명되는 바와 같이, 제 2 튜브 거치대(62)에 거치된 튜브(T)에서는 시료의 DNA를 증폭하기 위하여 시료의 배양액과 DNA 증폭 혼합액 및 프라이머 혼합액의 혼합이 이루어지거나, 또는 다른 혼합액들과의 혼합이 이루어질 수 있다.
한편, 장치의 일측에는 배양액의 처리에 필요한 혼합액들이 담긴 제 1 내지 제 4 혼합액 용기(41, 42, 43, 44)들이 배치된다. 예를 들면, 제 1 혼합액 용기(41)에는 증폭 혼합액이 담기고, 제 2 혼합액 용기(42)에는 프라이머(primer) 혼합액이 담기고, 제 3 혼합액 용기(43)에는 엔자임(enzyme) 혼합액이 담기며, 제 4 혼합액 용기(44)에는 프로브(probe) 혼합액이 담긴다. 제 1 내지 제 4 혼합액 용기(41 내지 44)들에 담긴 혼합액들은 니들 펌프(36)에 의해 흡입되어 튜브(T)로 배출될 수 있다.
다른 한편으로, 장치의 다른 측에는 제 1 내지 제 3 버퍼 용기(51, 52, 53)들이 배치되어 있다. 예를 들면, 제 1 버퍼 용기(51)에는 멸균수가 담기고, 제 2 버퍼 용기(52)는 폐기된 배양액등이 담길 수 있다. 제 3 버퍼 용기(53)는 러닝 버퍼 용액(running buffer solution)이 담길 수 있다. 도면 번호 55 로 표시된 것은 팁 거치대로서, 팁 거치대(55)에 거치된 다수의 팁은 니들 펌프(36)의 피펫(37)의 단부에 고정될 수 있다. Z 축(15)이 팁 거치대(55)의 상부로 이동하고, 니들 펌프(36)가 하강함으로써 피펫(37)이 팁(610)에 꽂힐 수 있다.
한편, 피펫(37)의 단부에 고정된 팁(610)을 제거하기 위해서 일측에 팁 제거부(60)가 구비된다. 팁 제거부(60)는 도 7 에 개략적으로 도시되어 있다. 도면에 도시된 바와 같이, 팁 제거부(60)는 대직경 원통형 통공과 소직경 원통형 통공이 서로 겹쳐져서 형성된 것으로서, 소직경 원통형 통공의 상단부에는 내측으로 돌출된 턱이 형성되어 있다. 피펫(37)과 피펫(37)의 단부에 고정된 팁(610)은 팁 제거부(60)의 대직경 원통형 통공 안으로 삽입될 수 있으나, 피펫(37)이 소직경 원통형 통공의 밖으로 빠져나올 수 있는 반면에, 팁(610)은 소직경 원통형 통공의 밖으로 빠져나올 수 없다. 이는 팁(610)의 상단부가 소직경 원통형 통공의 상단부 내측으로 돌출된 턱에 걸리기 때문이다.
피펫(37)으로부터 팁(610)을 제거하기 위해서는 Z 축(15)이 팁 제거부(60)의 상부로 이동하고, 니들 펌프(36)의 하강에 의해 피펫(37)과 팁(610)이 팁 제거부(60)의 대직경 원통형 통공 안으로 삽입된다. 다음에 Z 축(15)의 이동에 의해 피펫(37)과 팁(610)이 팁 제거부(60)의 소직경 원통형 통공쪽으로 이동한다. 이후에 니들 펌프(36)가 상승하게 되면 팁(610)은 소직경 원통형 통공의 상단부 내측으로 돌출된 턱에 걸려서 빠지게 되고, 피펫(37) 만이 상승하게 된다. 이러한 작용에 의해 오염되지 않은 팁(610)을 교환시켜가면서 이용할 수 있다.
도 2 에 도시된 것은 본 발명에 따른 식품 미생물균 DNA 자동 분석 방법을 개략적으로 도시한 순서도이다. 도 2 에 도시된 식품 미생물균 DNA 자동 분석 방법은 도 1 에 도시된 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
도면을 참조하면, 본원 발명에 따른 식품 미생물균 DNA 자동 분석 방법은 식료품으로부터 채취한 시료에서 DNA를 추출하는 단계(101), 상기 DNA 를 증폭시키고 신호 프로브(probe)를 생성시키는 단계(102) 및, 상기 증폭된 DNA 의 신호 프로브를 래피드 스트립 키트(rapid strip kit)에 적용하여 미생물균이나 식중독균의 존재 여부를 판독하는 단계(103)를 구비한다. 이후에 설명되는 바와 같이, 식료품으로부터 채취한 시료에서 DNA를 추출하기 위해서는 시료를 배양하고 세포를 원심 분리 및 가열 냉각 과정을 통해 파괴하여야 한다. 또한 DNA 를 증폭시켜 신호 프로브를 생성하기 위해서 증폭 혼합액, 프라이머 혼합액, 효소 혼합액 및 프로브 혼합액과 같은 혼합액을 혼합시키고 가열 냉각 및 원심 분리 과정을 거쳐야 한다. 이러한 과정을 통해서 생성된 DNA 의 신호 프로브는 래피드 스트립 키트에 적용됨으로써 식중독균의 유무를 판독할 수 있게 된다.
도 3 에 도시된 것은 도 2 에 도시된 DNA 의 추출 단계에 포함되는 하위 단계들을 나타낸 순서도이다. 도면을 참조하면, 우선 식중독균 검사의 대상이 되는 식료품으로부터 시료를 채취하여 배양시키는 시료 채취 및 배양 단계(111)를 수행하게 된다. 이러한 단계에서는 식료품으로부터 약 25g 의 시료를 채취하여, LB 배지를 225 ml 첨가하여 공지된 배양기(미도시)에서 36 도에서 4 시간 이상 세포를 배양하게 된다.
다음에 배양액을 채취하여 원심 분리하는 단계(12)를 수행하게 된다. 배양기에서 배양된 세포를 포함하고 있는 배양액을 피펫을 이용하여 수작업으로 1 ml 정도 채취하고, 그 배양액을 1.5 ml 용량의 제 1 튜브에 주입한다. 배양액이 주입된 제 1 튜브는 도 1 에 도시된 원심 분리기(38)에 배치되어 원심 분리기(38)의 작용에 의해서 원심 분리된다. 원심 분리 작용은 12,000 rpm 에서 5 분간에 걸쳐 이루 어진다. 원심 분리가 이루어진 후에는 제 1 튜브내에서 배양액이 성분에 따라 층을 이루게 된다. 즉, 제 1 튜브내의 배양액은 상층액과 하층액을 포함하게 되며, 이들중 상층액은 폐기시키게 된다. 니들 펌프(36)를 이용하여 상층액을 흡인하여, 제 2 버퍼 용기(52)에 폐기시킨다.
다음에 제 1 튜브의 배양액에 멸균수를 첨가하는 단계(113)가 수행된다. 그리퍼(35)는 원심 분리기(38)의 튜브랙(38c)에 거치되어 있던 제 1 튜브를 제 1 튜브 거치대(61)로 옮기고, 다음에 니들 펌프(36)는 제 1 버퍼 용기(51)에 담긴 멸균수를 제 1 튜브에 주입하게 된다. 멸균수는 150 마이크로리터를 첨가하는 것이 바람직스럽다.
다음에 제 1 튜브에 담겨있는 배양액은 가열 냉각부(45)의 가열/냉각 단계(114)를 거치게 된다. 가열 냉각부(45)는 제 1 튜브에 담긴 배양액을 섭씨 95 도에서 20 분간 가열하고, 이후에 섭씨 0 도에서 1 분이상 냉각시킨다. 이와 같은 가열 및 냉각은 세포를 파괴하는 작용을 한다.
가열 냉각에 의한 세포 파괴 대신에 시약을 이용하여 세포를 파괴할 수 있다. 세포를 파괴하는 시약 및 구체적인 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 시약을 이용하여 세포를 파괴하더라도 가열 냉각에 의한 것과 마찬가지의 결과를 가져올 수 있다.
다음에 DNA 분리를 위한 원심 분리 단계(114)가 수행된다. 이러한 원심 분리 단계(114)는 파괴된 세포로부터 DNA 만을 분리하기 위한 것이다. 제 1 튜브 거치대(61)에서 가열 및 냉각 작용을 받은 제 1 튜브는 그리퍼(35)에 의해서 다시 원심 분리기(38)의 튜브 랙(38c)으로 옮겨지고, 원심 분리 작용을 받는다. 원심 분리는 12,000 rpm 으로 10 분간 이루어진다.
원심 분리 작용이 이루어진 이후에는 제 1 튜브내의 상층액을 취함으로써 DNA 가 추출되는 단계(116)가 수행된다. 니들 펌프(36)를 이용하여 제 1 튜브의 상층액을 10 마이크로리터 흡입함으로써 DNA 를 취하고, 비어있는 제 2 튜브에 상기의 DNA 를 주입한다. 이때 비어 있는 제 2 튜브는 제 2 튜브 거치대(62)에 거치되어 있다.
도 4 에 도시된 것은 도 2 에 도시된 DNA 의 신호 프로브 생성 단계에 포함되는 하위 단계를 나타내는 순서도이다. 도 4 에 도시된 단계들은 도 3 에 도시된 단계들에 뒤이어서 수행되는 것이다.
도 3 에 도시된 DNA 추출 단계(116)의 다음에 수행되는 것으로서, DNA 에 증폭 혼합액 및 프라이머(primer) 혼합액을 혼합시키는 단계(117)를 수행한다. 니들 펌프(36)를 이용하여 제 1 혼합액 용기(41)에 담긴 증폭 혼합액(41)을 4 마이크로리터로써 제 2 튜브로 주입하고, 또한 니들 펌프(36)를 이용하여 제 2 혼합액 용기(42)에 담긴 프라이머 혼합액을 3 마이크로리터로써 제 2 튜브에 주입한다.
상기와 같은 DNA 에 증폭 혼합액 및 프라이머 혼합액을 혼합시키는 단계(17)는 니들 펌프를 이용하지 않고 다른 방법으로 수행될 수도 있다. 예를 들면, 별도의 과정을 통해 미리 혼합되어 대기 상태로 준비될 수도 있다.
다음에 제 2 튜브에 담긴 DNA 를 열처리하는 단계(118)가 수행된다. 제 2 튜브는 그리퍼(35)에 의해서 가열 냉각부(45)상에 배치된 제 1 튜브 거치대(61)로 옮 겨지며, 가열 냉각부(45)의 가열 작용을 받게 된다. 이때 섭씨 60 도에서 5 분간의 가열 작용이 이루어진다.
다음에 제 3 튜브에서 효소(enzyme) 혼합액과 프로브(probe) 혼합액의 혼합 단계(119)가 이루어진다. 비어 있는 제 3 튜브는 제 2 튜브 거치대(62)에 거치되어 있으며, 효소 혼합액은 제 3 혼합액 용기(43)에 담겨있고, 프로브(probe) 혼합액은 제 4 혼합액 용기(44)에 담겨있다. 니들 펌프(36)는 제 3 혼합액 용기(43)로부터 효소 혼합액을 2 마이크로리터로써 제 3 튜브로 주입하고, 또한 제 4 혼합액 용기(44)로부터 프로브 혼합액을 1 마이크로리터로써 제 3 튜브로 주입함으로써 상기 효소 혼합액과 프로브 혼합액이 제 3 튜브내에서 혼합된다.
상기와 같은 효소 혼합액과 프로브 혼합액의 혼합 과정은 니들 펌프를 이용하지 않고 별도의 과정으로서 수행될 수도 있다. 예를 들면, 별도의 과정으로서 미리 혼합된 상태에서 대기 상태로 있을 수 있다.
다음에 제 3 튜브에서 혼합된 혼합액을 제 2 튜브의 DNA 에 첨가시키는 단계(120)가 수행된다. 니들 펌프(36)를 이용하여 제 2 튜브 거치대(62)에 거치된 제 3 튜브로부터 혼합액을 3 마이크로리터로 취하여, 제 1 튜브 거치대(61)에 거치되어 있는 제 2 튜브에 주입한다.
다음에 제 2 튜브의 DNA 를 원심 분리시키는 단계(121)가 수행된다. 그리퍼(35)를 이용하여 제 2 튜브를 원심 분리기(30)의 튜브 랙(38c)으로 옮기고 원심 분리 작용을 수행한다. 원심 분리 작용은 6,000 rpm 으로 2 초간 수행된다.
원심 분리 작용이 수행된 이후에는 다시 제 2 튜브에 담긴 DNA 에 대한 가열 냉각 단계(122)가 수행된다. 원심 분리기(30)의 튜브 랙(38c)에 배치되어 있던 제 2 튜브는 그리퍼(35)에 의해서 제 1 튜브 거치대(61)로 옮겨지며, 가열 냉각부(45)의 작용에 의해 가열 작용 및 냉각 작용이 이루어진다. 가열은 섭씨 60 도에서 90 분간 이루어지고, 냉각은 섭씨 0 도에서 5 분간 이루어진다.
다음에 DNA 에 대한 러닝 버퍼 용액의 혼합 단계(123)가 이루어진다. 니들 펌프(36)는 제 3 버퍼 용기(53)에 담겨있는 러닝 버퍼(running buffer) 용액을 제 2 튜브에 60 마이크로리터로써 첨가한다. 러닝 버퍼 용액은 이후에 래피드 스트립 키트에서의 발현성을 개선하기 위해서 혼합되는 것이다.
도 3 및 도 4 에 도시된 단계(111) 내지 단계(122)를 수행함으로써 DNA 의 신호 프로브(probe)가 얻어진다. 이렇게 얻어진 DNA 의 신호 프로브는 래피드 스트립 키트(rapid strip kit)에 적용됨으로써 식중독균의 존재 여부를 판단할 수 있다.
도 5 및 도 6 에 도시된 것은 래피드 스트립 키트의 개략적인 설명도이다.
도면을 참조하면, 래피드 스트립 키트는 베이스 멤브레인(151), 상기 베이스 멤브레인(151)상에 배치되는 샘플 적용 패드(152), 염료 패드(153), 심지 멤브레인(154)을 포함하고, 상기 심지 멤브레인(154)에는 테스트 라인(155)과 콘트롤 라인(156)이 구비된다. 샘플 적용 패드(152)에는 식중독균의 DNA 의 신호 프로브가 타겟 항원(target body, 157)으로서 적용될 수 있다. 염료 패드(153)에는 항체에 대한 염료 결합물(158)이 배치되어 있으며, 이러한 염료 결합물(158)은 타겟 항원(157)과 결합될 수 있다.
한편, 테스트 라인(155)에는 타겟 항원(157)에 대한 항체(159)가 배치되어 있고, 콘트롤 라인(156)에는 인디케이터 항체(indicator antibody, 160)가 배치되어 있다. 타겟 항원(157)이 존재하는 경우에는 타겟 항원(157)이 항체 염료 결합물(158)과 결합하고, 다음에 항체(159)와 결합하여 발색하게 된다. 이에 반해 타겟 항원(157)이 존재하지 않는 경우에는 항체 염료 결합물(158)이 항체(159)와 결합하지 않으므로 테스트 라인(155)에서는 발색이 발생하지 않지만, 항체 염료 결합물(158)은 인디케이터 항체(160)와는 항상 결합하게 되므로 콘트롤 라인(156)에서는 발색이 발생된다. 만일 콘트롤 라인(156)에서 발색이 발생하지 않는다면 검사에 오류가 있는 것으로서 신뢰성이 없는 것이다. 따라서 콘트롤 라인(156)은 래피드 스트립 키트의 이상 유무를 판단하는 근거가 된다.
위와 같은 래피드 스트립 키트에서 식중독균의 DNA 로부터 생성된 신호 프로브를 타겟 항원으로서 샘플 적용 패드(152)에 적용하면, 도 5 및 도 6 에 도시된 바와 같이 신호 프로브는 항체 염료 결합물(158)과 결합되고, 신호 프로브에 대한 항체(159)와 결합됨으로써 도면 번호 165 로 표시된 발색이 발생될 것이다. 또한 항체 염료 결합물(158)은 인디케이터 항체(160)와 결합됨으로써 도면 번호 167 로 표시된 바와 같이 발색이 발생될 것이다. 즉, 식중독균이 존재하는 경우에는 테스트 스트립 키트에서 2 개의 발색이 발생되는 것이다.
이에 반하여 식중독균이 존재하지 않는다면 신호 프로브에 대한 항체(159)와의 결합이 이루어지지 않으므로, 도 6에서 도면 번호 165 로 표시된 바와 같은 발색은 이루어지지 않을 것이다. 그러나 도면 번호 167 로 표시된 바와 같은 발색이 이루어짐으로써 검사가 정상적으로 이루어지고 식중독균이 존재하지 않는다는 점을 알 수 있다.
본 발명은 첨부된 도면에 도시된 일 실시예를 참조로 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 청구 범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.
도 1 은 본 발명에 따른 식중독균의 검사 장치를 개략적으로 도시한 사시도이다.
도 2 는 본 발명에 따른 식중독균의 검사 방법에 대한 개략적인 순서도이다.
도 3 은 도 2 에 도시된 식중독균의 DNA 의 추출 단계에 포함되는 하위 단계들을 나타내는 순서도이다.
도 4 는 도 2 에 도시된 식중독균의 DNA 의 신호 프로브 생성 단계에 포함되는 하위 단계들을 나타내는 순서도이다.
도 5 및 도 6 은 본 발명에서 이용되는 래피드 스트립 키트에 대한 설명도이다.
도 7 은 팁 제거부를 확대하여 도시한 사시도이다.
< 도면의 주요 부호에 대한 간단한 설명 >
11. X 축 12. Y 축
15. Z 축 30. 원심 분리기
35. 그리퍼 36. 니들 펌프
60. 팁 제거부 61.62. 거치대

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 상호 직교하고 상호간의 평면 직교 좌표 운동이 가능한 X 축 및 Y 축;
    상기 X 축을 따라서 왕복 운동하는 Z 축;
    상기 Z 축을 따라서 승강 운동하는 튜브 파지용 그리퍼;
    상기 Z 축을 따라서 승강 운동하며 액체를 흡입 및 배출시키는 니들 펌프;
    상기 평면 직교 좌표 운동이 이루어지는 영역내에 위치하고 튜브가 삽입될 수 있는 튜브 랙을 구비하는 원심 분리기로서, 상기 튜브 랙은, 미리 결정된 각도 간격을 가지고 반경 방향으로 연장된 복수의 지지부의 단부에 설치되고, 상기 튜브는 상기 튜브 랙에 형성된 삽입 구멍내에 삽입됨으로써 일 직선상에서 등간격으로 배치되는, 원심 분리기;
    다수의 튜브가 거치될 수 있는 제 1 튜브 거치대 및 제 2 튜브 거치대;
    상기 제 1 튜브 거치대에 거치된 튜브를 가열 및 냉각시킬 수 있는 가열 냉각부; 및,
    상기 니들 펌프의 단부에 고정된 팁의 상단부가 걸려서 팁을 제거시킬 수 있도록, 턱이 형성된 원통형 통공을 구비하는 팁 제거부;를 포함하는, 식품 미생물균 DNA 자동 분석 장치.
  6. 삭제
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 평면 직교 좌표 운동 영역내에 위치하는 복수의 혼합액 용기 및 복수의 버퍼 용기를 더 구비하는 것을 특징으로 하는, 식품 미생물균 DNA 자동 분석 장치.
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