CN102844433B - Pcr用引物对、pcr用反应液以及食物中毒菌的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种PCR用引物对，其特异性扩增蜡样芽孢杆菌、弯曲菌、大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌中的两种以上的食物中毒菌的核酸。由此，可以同时且特异性地检测出这些食物中毒菌。使用由如下引物对之中的两个以上的引物对组成的PCR用引物对，利用PCR法，对食物中毒菌的核酸进行特异性扩增，所述引物对包括：用于蜡样芽孢杆菌检测的序列编号1和2、序列编号3和4的引物对；用于弯曲菌检测的序列编号5和6的引物对；用于大肠杆菌检测的序列编号7和8的引物；用于李斯特菌检测的序列编号9和10的引物对、用于沙门氏菌检测的序列编号11和12的引物对；用于金黄色葡萄球菌检测的序列编号13和14的引物对；用于副溶血弧菌检测的序列编号15和16的引物对。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测食物中毒菌的PCR用引物对，特别是涉及能够特异性地检测多种食物中毒菌的PCR用引物对、PCR用反应液、食物中毒菌的检测方法。
背景技术
以往，在食品检查或环境检查、临床试验、家畜卫生等方面上，进行是否存在食物中毒菌的检查。在这样的检查中，近年来进行如下操作：利用PCR(聚合酶链反应)，将检查试样中所包含的DNA(脱氧核糖核酸)扩增，并基于所得到的扩增产物，判定对象菌。
当进行这样的PCR时，设计能够特异性地扩增对象菌的引物为重要。
于是，在专利文献1中，公开了能够检测出如下五种食物中毒菌的引物对：肠管出血性大肠杆菌O157、沙门氏菌、弯曲菌、李斯特菌和金黄色葡萄球菌群。
此外，在专利文献2中，公开了用于如下目的的引物对：使用LAMP法(环介导等温扩增技术，Loop-Mediated Isothermal Amplification)来扩增沙门氏菌O4群的DNA。
专利文献1：日本特开2007-274934号公报
专利文献2：日本特开2008-72951号公报
发明内容
发明要解决的课题
然而，用这些方法不能检测出其他的食物中毒菌。在细菌性食物中毒中，还多有由蜡样芽孢杆菌或副溶血弧菌引起的情况，包括大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、弯曲菌、金黄色葡萄球菌的五种与蜡样芽孢杆菌和副溶血弧菌的七种食物中毒菌占引起细菌性食物中毒疾病的原因的90％以 上。
因此，如果能够同时且分别特异性地检测出这些七种食物中毒菌是否存在于食品或环境等中，则非常有用。
此处，当存在多种食物中毒菌时，为了分别特异性地检测出这些食物中毒菌，需要设计能够同时扩增该多种食物中毒菌的DNA的一部分的引物对。此时，不得因不同的对象区域的引物对的引物的组合而扩增非对象区域。此外，当存在多个不同的对象区域引物对时，如果引物的长度或熔解温度等相似，则有时进行竞争，因此，需求设计能够进行与单一情况相比特异性更高的扩增的引物。
如此，分别特异性地检测出多种食物中毒菌是非常困难的，至今认为，特异性地检测出食物中毒菌五种为限，无法检测出五种以上的多种食物中毒菌。
于是，本发明人进行了深入研究，反复进行了多次实验，结果成功地开发出，能够以上述七个菌种中的八个区域的毒素区域基因或生物体内必须基因为对象、分别特异性地扩增这些基因的多重PCR用引物对，从而完成了本发明。
即，本发明的目的在于提供能够特异性地扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、弯曲菌(Campylobacter属)、大肠杆菌(Escherichia coli)、李斯特菌(Listeria属)、沙门氏菌(Salmonella属)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)中的两种以上的食物中毒菌的PCR用引物对、PCR用反应液、食物中毒菌的检测方法、以及引物的设计方法。
用于解决课题的手段
本发明的PCR用引物对PCR用引物对是用于通过PCR法来扩增核酸的引物对，其由如下引物对组成的组中的两个以上的引物对混合而成，所述引物对包括：第一引物对，具备用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号1所示的碱基序列组成的引物和由序列编号2所示的碱基序列组成的引物；第二引物对，具备用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号3所示的碱基序列组成的引物和由序列编号4所示的碱基序列组成的引物；第三引物对，具备用于扩增 弯曲菌(Campylobacter属)的DNA的、由序列编号5所示的碱基序列组成的引物和由序列编号6所示的碱基序列组成的引物；第四引物对，具备用于扩增大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列编号7所示的碱基序列组成的引物和由序列编号8所示的碱基序列组成的引物；第五引物对，具备用于扩增李斯特菌(Listeria属)的DNA的、由序列编号9所示的碱基序列组成的引物和由序列编号10所示的碱基序列组成的引物；第六引物对，具备用于扩增沙门氏菌(Salmonella属)的DNA的、由序列编号11所示的碱基序列组成的引物和由序列编号12所示的碱基序列组成的引物；第七引物对，具备用于扩增金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA的、由序列编号13所示的碱基序列组成的引物和由序列编号14所示的碱基序列组成的引物；以及第八引物对，具备用于扩增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA的、由序列编号15所示的碱基序列组成的引物和由序列编号16所示的碱基序列组成的引物。
另外，本发明的PCR用引物对是用于通过PCR法来扩增核酸的引物对，其由如下引物对组成的组中的两个以上的引物对混合而成，所述引物对包括：以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因组DNA中所包含的不显示溶血活性的肠毒素分泌基因(nhe)为扩增对象区域的引物对、以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因组DNA中所包含的呕吐毒素合成酶基因(cesB)为扩增对象区域的引物对、以弯曲菌(Campylobacter属)的基因组DNA中所包含的核糖体基因(16S rRNA)为扩增对象区域的引物对、以大肠杆菌(Escherichia coli)的基因组DNA中所包含的尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)为扩增对象区域的引物对、以李斯特菌(Listeria属)的基因组DNA中所包含的热休克蛋白基因(dnaJ)为扩增对象区域的引物对、以沙门氏菌(Salmonella属)的基因组DNA中所包含的侵袭性因子相关基因(invA)为扩增对象区域的引物对、以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的基因组DNA中所包含的热休克蛋白基因(dnaJ)为扩增对象区域的引物对、以及以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的基因组DNA中所包含的耐热性溶血毒素基因(tdh)为扩增对象区域的引物对。
此外，本发明的PCR用反应液含有上述PCR用引物对。
此外，本发明的食物中毒菌的检测方法是使用由如下引物对组成的组中的两个以上的引物对，在利用PCR法的扩增对象的试样中包含对应于这些引物对的一个或两个以上的食物中毒菌的核酸时，特异性地扩增该核酸，并基于所得到的扩增产物，检测食物中毒菌的方法，所述引物对包括：第一引物对，具备用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号1所示的碱基序列组成的引物和由序列编号2所示的碱基序列组成的引物；第二引物对，具备用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号3所示的碱基序列组成的引物和由序列编号4所示的碱基序列组成的引物；第三引物对，具备用于扩增弯曲菌(Campylobacter属)的DNA的、由序列编号5所示的碱基序列组成的引物和由序列编号6所示的碱基序列组成的引物；第四引物对，具备用于扩增大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列编号7所示的碱基序列组成的引物和由序列编号8所示的碱基序列组成的引物；第五引物对，具备用于扩增李斯特菌(Listeria属)的DNA的、由序列编号9所示的碱基序列组成的引物和由序列编号10所示的碱基序列组成的引物；第六引物对，具备用于扩增沙门氏菌(Salmonella属)的DNA的、由序列编号11所示的碱基序列组成的引物和由序列编号12所示的碱基序列组成的引物；第七引物对，具备用于扩增金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA的、由序列编号13所示的碱基序列组成的引物和由序列编号14所示的碱基序列组成的引物；以及第八引物对，具备用于扩增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA的、由序列编号15所示的碱基序列组成的引物和由序列编号16所示的碱基序列组成的引物。
发明效果
根据本发明，能够特异性地扩增蜡样芽孢杆菌、弯曲菌、大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌中的两种以上的食物中毒菌。因此，能够分别特异性地检测出这些食物中毒菌。
附图说明
图1为示出本发明实施方式的对应于新型引物对的序列编号、正向和反向的区别、对象食物中毒菌、扩增对象区域、以及扩增产物的长度的图。
图2为示出本发明实施方式的新型引物对的扩增对象区域与对应序列的图。
图3为示出试验1的蜡样芽孢杆菌的基因组DNA中所包含的不显示溶血活性的肠毒素分泌基因(Bacillus cereus/nhe)的扩增结果的图。
图4为示出试验2的蜡样芽孢杆菌的基因组DNA中所包含的呕吐毒素合成酶基因(Bacillus cereus/cesB)的扩增结果的图。
图5为示出试验3的弯曲菌的基因组DNA中所包含的核糖体基因(Campylobacter/16S rRNA)的扩增结果的图。
图6为示出试验4的大肠杆菌的基因组DNA中所包含的尿苷单磷酸激酶基因(Escherichia coli/pyrH)的扩增结果的图。
图7为示出试验5的李斯特菌的基因组DNA中所包含的热休克蛋白基因(Listeria monocytogenes/dnaJ)的扩增结果的图。
图8为示出试验6的沙门氏菌的基因组DNA中所包含的侵袭性因子相关基因(Salmonella enterica/invA)的扩增结果的图。
图9为示出试验7的金黄色葡萄球菌的基因组DNA中所包含的热休克蛋白基因(Staphylococcus aureus/dnaJ)的扩增结果的图。
图10为示出试验8的副溶血弧菌的基因组DNA中所包含的耐热性溶血毒素基因(Vibrio parahaemolyticus/tdh)的扩增结果的图。
图11为示出利用实施例1的八组的所有的引物分别扩增各个七种食物中毒菌的基因组DNA的一部分的结果的图。
图12为示出利用实施例2的八组的所有的引物一次性扩增七种食物中毒菌的基因组DNA的一部分的结果的图。
具体实施方式
下面，对本发明的实施方式进行具体的说明。
[PCR用引物对]
首先，参照图1和图2，对本实施方式的PCR用引物对进行说明。
PCR用引物对是为了利用PCR法来扩增试样中的基因组DNA的一部分而使用，利用正向引物和反向引物的两种引物扩增特定的区域。PCR用引物对包含在PCR反应液中。在PCR反应液中还含有核酸合成底物、核 酸合成酶、试样的基因组DNA、缓冲液等。并且，使用该PCR反应液，采用热循环仪等核酸扩增装置，扩增试样中的基因组DNA的一部分。即，当在试样中存在具有基于PCR用引物对的扩增对象区域的基因组DNA时，扩增该对象区域。本实施方式的PCR用引物对能够在通常的PCR法中使用。
在图1中，序列编号显示出序列表中所示的碱基序列的序列编号。F/R显示出正向引物和反向引物的区别，F表示正向引物，R表示反向引物。扩增对象食物中毒菌(学名)显示出利用本实施方式的PCR用引物对进行扩增的对象食物中毒菌的名称。对象区域显示出在该食物中毒菌中的利用本实施方式的PCR用引物对进行扩增的对象区域中所存在的基因的名称。扩增产物显示出使用本实施方式的PCR用引物对扩增所对应的对象区域时的扩增产物的碱基序列的长度。此外，在图2中，示出对应于各食物中毒菌的扩增对象区域的PCR用引物对的碱基序列。
序列编号1和2表示用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因组DNA中所包含的不显示溶血活性的肠毒素分泌基因(nhe)的引物对的碱基序列，扩增产物为195bp(碱基对)。
序列编号3和4表示用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因组DNA中所包含的呕吐毒素合成酶基因(cesB)的引物对的碱基序列，扩增产物为238bp。
序列编号5和6表示用于扩增弯曲菌(Campylobacter属)的基因组DNA中所包含的核糖体基因(16S rRNA)的引物对的碱基序列，扩增产物为263bp。
序列编号7和8表示用于扩增大肠杆菌(Escherichia coli)的基因组DNA中所包含的尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)的引物对的碱基序列，扩增产物为157bp。
序列编号9和10表示用于扩增李斯特菌(Listeria属)的基因组DNA中所包含的热休克蛋白基因(dnaJ)的引物对的碱基序列，扩增产物为176bp。
序列编号11和12表示用于扩增沙门氏菌(Salmonella属)的基因组DNA中所包含的侵袭性因子相关基因(invA)的引物对的碱基序列，扩 增产物为180bp。
序列编号13和14表示用于扩增金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的基因组DNA中所包含的热休克蛋白基因(dnaJ)的引物对的碱基序列，扩增产物为236bp。
序列编号15和16表示用于扩增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的基因组DNA中所包含的耐热性溶血毒素基因(tdh)的引物对的碱基序列，扩增产物为380bp。
这些序列编号所示的碱基序列示出从5’末端到3’末端方向的序列。
此外，本实施方式的PCR用引物对中的各引物并不限于上述的碱基序列，可以使用在各碱基序列中1个或几个碱基被缺失、置换或增加后的碱基序列。另外，也可以使用由能够在严格条件下与如下核酸片段杂交的核酸片段组成的引物，所述核酸片段由与各上述碱基序列互补的碱基序列组成。
另外，严格条件是指形成特异性杂交、不形成非特异性杂交的条件。例如，可以举出如下条件：相对于由序列编号1～16所示的序列组成的DNA具有高同源性(同源性为90％以上，优选为95％以上)的DNA和由与序列编号1～16所示的序列所组成的DNA互补的碱基序列组成的DNA杂交的条件。通常是指在低于完全杂交的熔解温度(Tm)约5℃～约30℃、优选为约10℃～约25℃的温度下形成杂交的情况。关于严格条件，可以使用J.Sambrook等在Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，特别是11.45节“Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes”中所记载的条件等。
进而，也可以使用由具有与本实施方式的PCR用引物对互补的碱基序列的引物组成的PCR用引物对。
即，也可以使用如下引物：具有分别与本实施方式的PCR用引物对中的引物互补的序列、且将从5’末端到3’末端的序列的方向颠倒的引物对。
在使上述八种PCR用引物对包含在PCR反应液中并进行利用PCR法的扩增反应的情况下，只要在PCR反应液中所含有的试样中包含任意上述扩增对象食物中毒菌的基因组DNA，则能够特异性地扩增该扩增对象 区域。
此外，在试样中含有两种以上的上述扩增对象食物中毒菌的基因组DNA的情况下，能够同时且特异性地扩增各个基因组DNA的扩增对象区域。即使在试样中含有七种扩增对象食物中毒菌的基因组DNA的八个区域所有的基因的情况下，也能够同时且特异性地扩增各基因组DNA的扩增对象区域。
即，如果利用本实施方式的PCR用引物对，则不会进行除了各对象食物中毒菌以外的基因组DNA所引起的竞争。此外，即使同时使用多个PCR用引物对，也不进行因不同的引物对中的引物的组合而引起的非特异性扩增。
因此，通过将本实施方式的PCR用引物对加入到PCR反应液中，在试样中包含具有扩增对象区域的食物中毒菌的基因组DNA的情况下，能够特异性地扩增该区域。
此外，即使在试样中包含多种扩增对象的食物中毒菌的情况下，也能够同时且特异性地扩增各扩增对象区域。
理所当然，即使在PCR反应液中不包含所有的上述八种PCR用引物对，而包含其中的一种至七种PCR用引物对的情况下，当在PCR反应液中包含具有该PCR用引物对的扩增对象区域的食物中毒菌的基因组DNA的情况下，也能够特异性地扩增该对象区域。
[PCR用反应液]
本实施方式的PCR反应液至少含有上述八种PCR用引物对中的任一种，优选含有其中两种以上，更优选含有所有的八种PCR用引物对。PCR反应液中的除PCR用引物对以外的成分可以使用通常物质。
具体地说，例如可以使用由以下的组成形成的材料，但并不限于此。特别是，引物、试样的DNA和灭菌水的容量根据作为扩增对象的食物中毒菌的种类数的不同而不同。
■缓冲液(10体积％)
■核酸合成底物(8体积％)
■正向引物(10ng/μl、2体积％～16体积％)
■反向引物(10ng/μl、2体积％～16体积％)
·核酸合成酶(0.5体积％)
·试样的DNA(5体积％～35体积％)
·水(72.5体积％～14.5体积％)
[食物中毒菌的检测方法]
下面，对本实施方式的食物中毒菌的检测方法进行说明。
首先，使用本实施方式的PCR反应液，利用PCR法，扩增试样中所包含的基因组。
另外，实际上，当进行食物中毒菌的检测时，从食品或环境等中采集样品，进行该样品中所包含的菌的培养。然后，从培养的菌提取基因组DNA，使用该提取的基因组DNA作为上述PCR反应液中的试样。因此，实际上，在试样中是否存在扩增对象食物中毒菌是不明确的，当存在时，能够检测出该菌。另外，此时，如果使PCR反应液中含有所有的上述八种PCR用引物对，在试样中存在上述七个菌种八个区域的基因中的任意一种，则能够分别特异性地扩增出扩增对象区域。
在利用PCR法扩增基因时，使用核酸扩增装置。作为该核酸扩增装置，可以使用通常的热循环仪等。例如，PCR的反应条件如下，但并不限此。
(1)95℃2分钟
(2)95℃10秒钟(DNA链的解离工序)
(3)68℃30秒钟(退火工序)
(4)72℃30秒钟(DNA合成工序)
(5)72℃2分钟
将(2)～(4)进行40个循环
接着，使用扩增产物进行电泳，确认是否得到了基于本实施方式的PCR用引物对的扩增产物。
电泳可以利用琼脂糖凝胶电泳、丙烯酰胺电泳或微芯片电泳等通常的方法来进行。
[引物的设计方法]
接着，对本实施方式引物的设计方法进行说明。
如在背景技术中进行的说明，为了分别特异性地且同时检测多种食物 中毒菌，需要设计能够同时扩增该多种食物中毒菌的DNA的引物。但是，当存在多个不同种类的引物对时，如果引物的长度或熔解温度等相似则有时进行竞争，因此，需求设计与单独的情况相比能够进行特异性更高的扩增的引物。
于是，本发明人对能够提高这样的引物的特异性的引物的设计方法进行研究，从而发现若按照以下的基准，能够提高引物的特异性。
(1)熔解温度
将引物的熔解温度设为70℃以上。
以往的引物通常使用熔解温度为55℃～60℃的引物。可推定为，与此相对，对于本实施方式的PCR用引物对而言，通过设计成熔解温度高的引物，能够使PCR中扩增反应时的自由能量增大，减少非特异性扩增反应。
(2)GC含量
将引物的碱基序列中的GC含量设为60％以上。
以往的引物通常使用GC含量为40％～60％的引物。可推定为，与此相对，对于本实施方式的PCR用引物对而言，通过设计与AT相比具有更高的结合力的GC的含量多的引物，能够提高退火工序中的特异性结合。
(3)引物的长度
将引物的碱基序列的长度设为23mer～41mer左右。更优选为26mer～34mer左右，进一步优选为28mer～32mer左右。
以往的引物通常使用碱基序列的长度为18mer～25mer左右的引物。可推定为，与此相对，对于本实施方式的PCR用引物对而言，通过使用更长的引物，能够排除非特异性扩增。
如此，通过采用(1)～(3)中的至少任一项基准，进行引物设计，从而与以往的引物相比能够进一步提高其特异性、即对扩增对象的基因区域进行特异性地扩增的性质。
本实施方式的PCR用引物对通过设计符合这些所有的基准的PCR用引物对，成为能够特异性地扩增七种菌八个区域的优异的材料。
(4)检测对象区域
此外，如在上文中用图1进行的说明，本实施方式的PCR用引物对 以各食物中毒菌的特定区域为对象设计引物。
即，以这些食物中毒菌的毒素区域的基因和/或生物体内必需区域的基因为对象。
具体地说，作为扩增对象区域，对于蜡样芽孢杆菌选择不显示溶血活性的肠毒素分泌基因(nhe)和呕吐毒素合成酶基因(cesB)，对于弯曲菌选择核糖体基因(16S rRNA)，对于大肠杆菌选择尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)，对于李斯特菌选择热休克蛋白基因(dnaJ)，对于沙门氏菌选择侵袭性因子相关基因(invA)，对于金黄色葡萄球菌选择热休克蛋白基因(dnaJ)，对于副溶血弧菌选择耐热性溶血毒素基因(tdh)。
本实施方式的PCR用引物对通过分别选择这些区域作为扩增对象，而能够进一步提高引物的特异性。
如以上说明，如果利用本实施方式的PCR用引物对、PCR用反应液、食物中毒菌的检测方法，则能够同时且特异性地对蜡样芽孢杆菌、弯曲菌、大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌的七种食物中毒菌中的八个区域进行扩增。因此，根据本实施方式，能够同时且分别特异性地检测出这些食物中毒菌。
此外，如果利用本实施方式引物的设计方法，则能够设计如本实施方式的PCR用引物对那样的特异性高的引物。
实施例
首先，进行了用于确认本实施方式的PCR用引物对是否能够正确地扩增出扩增对象区域的检验试验。
试验方法利用上述实施方式的方法，使用含有本实施方式的PCR用引物对的PCR反应液，利用PCR法进行扩增反应，对扩增产物进行电泳，由此确认了能够得到正确的扩增产物。具体地说，在以下的试验1～8中分别对八种PCR用引物对进行说明。
(试验1)
首先，作为PCR用引物对，使用了具备由序列编号1和2所示的碱基序列组成的引物的引物对。扩增对象区域为蜡样芽孢杆菌基因组DNA的毒素区域中的不显示溶血活性的肠毒素分泌基因(nhe)，扩增产物为195bp。
作为PCR反应液，使用了组成为如下的物质。引物由Life Technologies日本株式会社合成。除此以外是Takara Bio株式会社制的。
·缓冲液10×Ex Taq buffer(20mM Mg2+plus)2.0μl
·核酸合成底物dNTP Mixture(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)1.6μl
·引物F(10ng/μl、最终浓度(final conc.)4ng)0.4μl
·引物R(10ng/μl、最终浓度4ng)0.4μl
·核酸合成酶EX Taq(5U/μl)0.1μl
·试样的DNA 1.0μl
·灭菌水14.5μl
(总量20μl)
此外，使各试样的DNA分别含有下面1～11所示的食物中毒菌的供试菌株基因组DNA，并分别进行PCR。
1.蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NBRC 15305
2.蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)TIFT 114011
3.结肠弯曲菌(Campylobacter coli)ATCC 43478
4.空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)ATCC 33560
5.大肠杆菌(Escherichia coli)NBRC 102203
6.单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 15313
7.肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)ATCC 9270
8.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)NBRC 100910
9.副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)GTC 2055
10.副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC 17802
11.耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)ATCC 9610
12.阴性对照
这些食物中毒菌的菌株为由下面的机构分售而得。
·NBRC独立行政法人制品评价基盘机构
·TIFT东洋食品研究所
·ATCC美国标准生物品收藏中心(American type culture collection)
·GTC岐阜大学大学院医学系研究科病原体制御分野
另外，使用了含有供试菌株11的耶尔森菌(Yersinia enterocolitica ATCC 9610)的PCR反应液的试验是为了确认关于本实施方式的各PCR用引物对的假阳性反应而进行的。另外，12的试验是代替试样的DNA将同量的灭菌水加入到PCR反应液中而进行的。
在利用PCR法扩增基因时，使用了ep梯度(Eppendorf株式会社制)。另外，PCR的反应条件是在实施方式中说明的条件相同的下面的条件下进行。
(1)95℃2分钟
(2)95℃10秒钟(DNA链的解离工序)
(3)68℃30秒钟(退火工序)
(4)72℃30秒钟(DNA合成工序)
(5)72℃2分钟
将(2)～(4)进行40个循环
接着，利用琼脂糖凝胶电泳，对通过PCR法得到的产物按各扩增对象区域进行电泳，从而确认是否得到了正确的扩增产物。电泳是使用MultiNA(株式会社岛津制作所制)而进行的。将该结果示于图3。
在图3中，1～12的条带表示对使用含有各自对应的编号的试样的DNA等的PCR反应液而进行的PCR产物分别进行电泳的结果。另外，曲线图表示扩增产物的长度。在曲线图中，关于所得到作为该PCR用引物对的扩增对象的目标扩增产物的条带，示出其扩增产物的峰。这在以下的试验2～8中也同样。
此处，在对通过PCR而得到的扩增产物进行电泳的情况下，由于受到MultiNA(株式会社岛津制作所制)中所用的试剂等影响，与理论上的扩增产物的碱基序列并不完全一致，而得到相似值的结果。
试验1的PCR用引物对具备由序列编号1和2所示的碱基序列组成的引物，扩增对象区域为蜡样芽孢杆菌的不显示溶血活性的肠毒素分泌基因(nhe)，扩增产物为195bp。
在图3中，对于使用了蜡样芽孢杆菌的基因组作为试样的DNA的供试菌株1、2而言，在200bp附近可见条带，对于其他的供试菌株3～12而言，在200bp附近未见条带。另外，下栏的曲线图是针对供试菌株1的 图，其示出195bp的峰。
此外，推定为，电泳结果中的25bp或75bp附近等的其他的条带表示引物或由引物形成的二聚物。这在以下的试验2～8中也同样。
由以上结果可以判断，对于使用了蜡样芽孢杆菌的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株1、2而言，利用试验1的PCR用引物对正确地扩增出蜡样芽孢杆菌的不显示溶血活性的肠毒素分泌基因(nhe)。
另一方面，在参照使用了其他的基因组作为试样的DNA的供试菌株3-11的条带时，虽然可见被认为表示由引物形成的二聚物的条带，但未见可误认为是不显示溶血活性的肠毒素分泌基因(nhe)得到扩增而形成的条带那样的非对象区域的扩增。
由此可确认，通过使用具备了由序列编号1和2所示的碱基序列组成的引物的PCR用引物对，能够特异性地扩增蜡样芽孢杆菌的不显示溶血活性的肠毒素分泌基因(nhe)。
(试验2)
使用了具备由序列编号3和4所示的碱基序列组成的引物的引物对作为PCR用引物对，除此之外，与试验1同样地进行实验。将其结果示于图4。
试验2的PCR用引物对的扩增对象区域为蜡样芽孢杆菌基因组DNA的毒素区域中的呕吐毒素合成酶基因(cesB)，扩增产物为238bp。
在图4中，当使用了具有呕吐毒素合成酶基因(cesB)的供试菌株2的基因组(Bacillus cereus TIFT 114011)的DNA作为试样的DNA时，在250bp附近可见条带，对于其他的供试菌株1、3-12而言，在250bp附近未见条带。此外，下栏的曲线图是针对供试菌株2的图，其示出251bp的峰。
因此可以判断，当使用了具有呕吐毒素合成酶基因(cesB)的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株2时，利用试验2的PCR用引物对，正确地扩增出扩增对象区域。
另一方面，在参照使用了其他的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株1、3～11的条带时，未见可误认为是呕吐毒素合成酶基因(cesB)得到扩增而形成的条带那样的非对象区域的扩增。
由此可确认，通过使用具备了由序列编号3和4所示的碱基序列组成的引物的PCR用引物对，能够特异性地扩增蜡样芽孢杆菌的呕吐毒素合成酶基因(cesB)。
(试验3)
使用了具备由序列编号5和6所示的碱基序列组成的引物的引物对作为PCR用引物对，除此之外，与试验1同样地进行实验。将其结果示于图5。
试验3的PCR用引物对的扩增对象区域为弯曲菌基因组DNA的生物体内必需区域中的核糖体基因(16S rRNA)，扩增产物为263bp。
在图5中，当使用了具有弯曲菌的核糖体基因(16S rRNA)的供试菌株3、4的基因组的DNA作为试样的DNA时，在275bp附近可见条带，对于其他的供试菌株1、2、5～12而言，在275bp附近未见条带。此外，下栏的曲线图是针对供试菌株3的图，其示出268bp的峰。
因此可以判断，当使用了具有弯曲菌的核糖体基因(16S rRNA)的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株3、4时，利用试验3的PCR用引物对，正确地扩增出扩增对象区域。
另一方面，在参照使用了其他的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株1、2、5～11的条带时，未见可误认为是弯曲菌的核糖体基因(16S rRNA)得到扩增而形成的条带那样的非对象区域的扩增。
由此可确认，通过使用具备了由序列编号5和6所示的碱基序列组成的引物的PCR用引物对，能够特异性地扩增弯曲菌的核糖体基因(16S rRNA)。
(试验4)
使用了具备由序列编号7和8所示的碱基序列组成的引物的引物对作为PCR用引物对，除此之外，与试验1同样地进行实验。将其结果示于图6。
试验4的PCR用引物对的扩增对象区域为大肠杆菌基因组DNA的生物体内必需区域中的尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)，扩增产物为157bp。
在图6中，当使用了具有大肠杆菌的尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)的供试菌株5的基因组的DNA作为试样的DNA时，在160bp附近可见条带， 对于其他的供试菌株1～4、6～12而言，在160bp附近未见条带。此外，下栏的曲线图是针对供试菌株5的图，其示出159bp的峰。
因此可以判断，当使用了具有大肠杆菌的尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株5时，利用试验4的PCR用引物对，正确地扩增出扩增对象区域。
另一方面，在参照使用了其他的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株1～4、6～11的条带时，未见可误认为是大肠杆菌的尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)得到扩增而形成的条带那样的非对象区域的扩增。
由此可确认，通过使用具备了由序列编号7和8所示的碱基序列组成的引物的PCR用引物对，能够特异性地扩增大肠杆菌的尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)。
(试验5)
使用了具备由序列编号9和10所示的碱基序列组成的引物的引物对作为PCR用引物对，除此之外，与试验1同样地进行实验。将其结果示于图7。
试验5的PCR用引物对的扩增对象区域为李斯特菌基因组DNA的生物体内必需区域中的热休克蛋白基因(dnaJ)，扩增产物为176bp。
在图7中，当使用了具有李斯特菌的热休克蛋白基因(dnaJ)的供试菌株6的基因组的DNA作为试样的DNA时，在200bp附近可见条带，对于其他的供试菌株1～5、7～12而言，在200bp附近未见条带。此外，下栏的曲线图是针对供试菌株6的图，其示出198bp的峰。
因此可以判断，当使用了具有李斯特菌的热休克蛋白基因(dnaJ)的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株6时，利用试验5的PCR用引物对，正确地扩增出扩增对象区域。
另外，在试验5中，发现理论上的扩增产物的长度和实际的扩增产物的长度有20bp左右的差异。该原因推定为，在供试菌株6中的热休克蛋白基因(dnaJ)中发生了某种序列的插入。
另一方面，在参照使用了其他的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株1～5、7～11的条带时，未见可误认为是李斯特菌的热休克蛋白基因(dnaJ)得到扩增而形成的条带那样的非对象区域的扩增。
由此可确认，通过使用具备了由序列编号9和10所示的碱基序列组成的引物的PCR用引物对，能够特异性地扩增李斯特菌的热休克蛋白基因(dnaJ)。
(试验6)
使用了具备由序列编号11和12所示的碱基序列组成的引物的引物对作为PCR用引物对，除此之外，与试验1同样地进行实验。将其结果示于图8。
试验6的PCR用引物对的扩增对象区域为沙门氏菌基因组DNA的毒素区域中的侵袭性因子相关基因(invA)，扩增产物为180bp。
在图8中，当使用了具有沙门氏菌侵袭性因子相关基因(invA)的供试菌株7的基因组的DNA作为试样的DNA时，在190bp附近可见条带，对于其他的供试菌株1～6、8～12而言，在190bp附近未见条带。此外，下栏的曲线图是针对供试菌株7的图，其示出183bp的峰。
因此可以判断，当使用了具有沙门氏菌的侵袭性因子相关基因(invA)的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株7时，利用试验6的PCR用引物对，正确地扩增出扩增对象区域。
另一方面，在参照使用了其他的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株1～6、8～11的条带时，未见可误认为是沙门氏菌的侵袭性因子相关基因(invA)得到扩增而形成的条带那样的非对象区域的扩增。
由此可确认，通过使用具备了由序列编号11和12所示的碱基序列组成的引物的PCR用引物对，能够特异性地扩增沙门氏菌的侵袭性因子相关基因(invA)。
(试验7)
使用了具备由序列编号13和14所示的碱基序列组成的引物的引物对作为PCR用引物对，除此之外，与试验1同样地进行实验。将其结果示于图9。
试验7的PCR用引物对的扩增对象区域为金黄色葡萄球菌基因组DNA的生物体内必须区域中的热休克蛋白基因(dnaJ)，扩增产物为236bp。
在图9中，当使用了具有金黄色葡萄球菌的热休克蛋白基因(dnaJ)的供试菌株8的基因组的DNA作为试样的DNA时，在240bp附近可见条 带，对于其他的供试菌株1～7、9～12而言，在240bp附近未见条带。此外，下栏的曲线图是针对供试菌株8的图，其示出238bp的峰。
因此可以判断，当使用了具有金黄色葡萄球菌的热休克蛋白基因(dnaJ)的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株8时，利用试验7的PCR用引物对，正确地扩增出扩增对象区域。
另一方面，在参照使用了其他的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株1～7、9～11的条带时，未见可误认为是金黄色葡萄球菌的热休克蛋白基因(dnaJ)得到扩增而形成的条带那样的非对象区域的扩增。
由此可确认，通过使用具备了由序列编号13和14所示的碱基序列组成的引物的PCR用引物对，能够特异性地扩增金黄色葡萄球菌的热休克蛋白基因(dnaJ)。
(试验8)
使用了具备由序列编号15和16所示的碱基序列组成的引物的引物对作为PCR用引物对，除此之外，与试验1同样地进行实验。将其结果示于图10。
试验8的PCR用引物对的扩增对象区域为副溶血弧菌基因组的毒素区域中的耐热性溶血毒素基因(tdh)，扩增产物为380bp。
在图10中，当使用了具有副溶血弧菌的耐热性溶血毒素基因(tdh)的供试菌株9的基因组的DNA作为试样的DNA时，在400bp附近可见条带，对于其他的供试菌株1～8、10～12而言，在400bp附近未见条带。此外，下栏的曲线图是针对供试菌株9的图，其示出390bp的峰。另外，供试菌株10的基因组(Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802)为不具有耐热性溶血毒素基因(tdh)的副溶血弧菌的菌株，未见扩增对象区域的扩增。
因此可以判断，当使用了具有副溶血弧菌的耐热性溶血毒素基因(tdh)的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株9时，利用试验8的PCR用引物对，正确地扩增出扩增对象区域。
另一方面，在参照使用了其他的基因组DNA作为试样的DNA的供试菌株1～8、10、11的条带时，未见可误认为是副溶血弧菌的耐热性溶血毒素基因(tdh)得到扩增而形成的条带那样的非对象区域的扩增。
由此可确认，通过使用具备了由序列编号15和16所示的碱基序列组 成的引物的PCR用引物对，能够特异性地扩增副溶血弧菌的耐热性溶血毒素基因(tdh)。
综上所述，可确认到，本实施方式的PCR用引物对在各自单独使用时，关于不是该引物对的扩增对象的其他的上述食物中毒菌的基因组DNA，不引起假阳性扩增反应。
接着，对于在同时使用这些PCR用引物对时是否能够特异性地扩增对象区域进行检验。对其结果在以下的实施例1和实施例2中进行说明。
(实施例1)
首先，使用试验1～8中所用的所有的引物对作为PCR用引物对，进行了实验。即，使实施例1的PCR反应液中含有由序列编号1～16所示的碱基序列组成的所有的引物。
实施例1的PCR反应液除了引物、试样的DNA和灭菌水以外与试验1相同，使用了如下组成的物质。
·缓冲液10×Ex Taq buffer(20mM Mg 2+plus)2.0μl
·核酸合成底物dNTP Mixture(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)1.6μl
·弧菌检测用引物F(10ng/μl、最终浓度4ng)0.4μl
·弧菌检测用引物R(10ng/μl、最终浓度4ng)0.4μl
·其他的引物F(10ng/μl、最终浓度2ng)0.2μl×7
·其他的引物R(10ng/μl、最终浓度2ng)0.2μl×7
·核酸合成酶EX Taq(5U/μl)0.1μl
·试样的DNA 1.0μl
·灭菌水11.7μl
此外，使各试样的DNA分别含有下面的1～7所示的食物中毒菌的供试菌株基因组DNA，并分别进行PCR。
1.蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)TIFT 114011
2.空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)ATCC 33560
3.大肠杆菌(Escherichia coli)NBRC 102203
4.单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 15313
5.肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)ATCC 9270
6.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)NBRC 100910
7.副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)GTC 2055
在利用PCR法进行基因扩增时，与试验1同样地，使用了ep梯度(Eppendorf株式会社制)，在如下条件下进行。
(1)95℃2分钟
(2)95℃10秒钟(DNA链的解离工序)
(3)68℃30秒钟(退火工序)
(4)72℃30秒钟(DNA合成工序)
(5)72℃2分钟
将(2)～(4)进行40个循环
接着，利用电泳使通过PCR法而得到的产物按各扩增对象区域进行电泳，对于各试样的DNA，进行是否得到了该扩增对象区域得到扩增的正确的扩增产物的确认。将该结果示于图11。
在图11中，在使用上述供试菌株1～7的基因组DNA作为试样的DNA时，通过PCR法而得到的各扩增产物分别示出以下的峰。
这些与各自理论上的扩增产物的碱基序列的长度相似，可以认为，通过本实施方式的PCR用引物对，能够特异性地扩增各个作为对象的食物中毒菌的扩增对象区域。
另外，供试菌株4的李斯特菌的扩增产物为195bp，与图1所示的李斯特菌的扩增产物176bp相比，差不多长20bp，如上所述，该原因推定为，该菌株中发生了某种序列的插入。
(实施例2)
使实施例2的PCR反应液中含有实施例1中的供试菌株1～7的所有 的食物中毒菌的基因组DNA作为试样DNA。除了试样的DNA和灭菌水以外与试验1相同，使用了如下组成的物质。
·缓冲液10×Ex Taq buffer(20mM Mg 2+plus)2.0μl
·核酸合成底物dNTP Mixture(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)1.6μl
·弧菌检测用引物F(10ng/μl、最终浓度4ng)0.4μl
·弧菌检测用引物R(10ng/μl、最终浓度4ng)0.4μl
·其他的引物F(10ng/μl、最终浓度2ng)0.2μl×7
·其他的引物R(10ng/μl、最终浓度2ng)0.2μl×7
·核酸合成酶EX Taq(5U/μl)0.1μl
·试样的DNA 1.0μl×7
·灭菌水5.7μl
使用该PCR反应液，在与实施例1同样的条件下，利用PCR法，一次性进行扩增对象区域的扩增。
接着，使用MultiNA(株式会社岛津制作所制)进行扩增产物的电泳。将其结果示于图12。
如图12所示，可见如下8个扩增产物的峰。
(1)168bp (2)172bp (3)187bp (4)201bp
(5)224bp (6)243bp (7)273bp (8)387bp
与实施例1的结果对照后可认为，这些峰分别示出以下的供试菌株的扩增产物。
(1)供试菌株3.大肠杆菌(Escherichia coli)NBRC 102203
(2)供试菌株5.肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)ATCC 9270
(3)供试菌株4.单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 15313
(4)供试菌株1.蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)TIFT 114011
(5)供试菌株6.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)NBRC100910
(6)供试菌株1.蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)TIFT 114011
(7)供试菌株2.空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)ATCC 33560
(8)供试菌株7.副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)GTC 2055
这样，可知根据本实施方式的PCR用引物对，能够同时且特异性地扩增蜡样芽孢杆菌、弯曲菌、大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌的食物中毒菌。
并且，由该结果可确认，能够同时且分别特异性地检测出这些食物中毒菌。
本发明并不限定于以上的实施方式或实施例，在本发明的范围内可以实施各种变更是理所当然的。
例如，作为PCR反应液的引物，只要是含有本实施方式的PCR用引物对的引物，则对于其他的成分，可以进行适当变更，例如使用与上述实施方式和实施例不同的物质等。此外，也可以将本实施方式的引物的设计方法适用于以扩增其他菌的基因组DNA为目的的引物设计。
工业应用性
本发明适合利用于如下情况等：同时且特异性地在短时间内检查在食品或制造环境等中是否存在蜡样芽孢杆菌、弯曲菌、大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌。
Claims (6)
1.一种PCR用引物对组，其用于通过PCR法来扩增核酸，其特征在于，由如下引物对组成的组中的6种以上的引物对混合而成，所述引物对包括：
第一引物对：具备用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号1所示的碱基序列组成的引物和由序列编号2所示的碱基序列组成的引物；
第二引物对：具备用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号3所示的碱基序列组成的引物和由序列编号4所示的碱基序列组成的引物；
第三引物对：具备用于扩增弯曲菌(Campylobacter属)的DNA的、由序列编号5所示的碱基序列组成的引物和由序列编号6所示的碱基序列组成的引物；
第四引物对：具备用于扩增大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列编号7所示的碱基序列组成的引物和由序列编号8所示的碱基序列组成的引物；
第五引物对：具备用于扩增李斯特菌(Listeria属)的DNA的、由序列编号9所示的碱基序列组成的引物和由序列编号10所示的碱基序列组成的引物；
第六引物对：具备用于扩增沙门氏菌(Salmonella属)的DNA的、由序列编号11所示的碱基序列组成的引物和由序列编号12所示的碱基序列组成的引物；
第七引物对：具备用于扩增金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA的、由序列编号13所示的碱基序列组成的引物和由序列编号14所示的碱基序列组成的引物；以及
第八引物对：具备用于扩增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA的、由序列编号15所示的碱基序列组成的引物和由序列编号16所示的碱基序列组成的引物。
2.根据权利要求1所述的PCR用引物对组，其特征在于，
所述引物对组是将所述第一至第八的所有的引物对混合而成的。
3.一种PCR用反应液，其特征在于，含有权利要求1或2所述的PCR用引物对组。
4.一种用于非疾病诊断目的的食物中毒菌的检测方法，其特征在于，使用由如下引物对组成的组中的6种以上的引物对，在利用PCR法的扩增对象的试样中包含对应于这些引物对的一个或两个以上的食物中毒菌的核酸时，特异性地扩增该核酸，并基于所得到的扩增产物，检测出食物中毒菌，所述引物对包括：
第一引物对：具备用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号1所示的碱基序列组成的引物和由序列编号2所示的碱基序列组成的引物；
第二引物对：具备用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号3所示的碱基序列组成的引物和由序列编号4所示的碱基序列组成的引物；
第三引物对：具备用于扩增弯曲菌(Campylobacter属)的DNA的、由序列编号5所示的碱基序列组成的引物和由序列编号6所示的碱基序列组成的引物；
第四引物对：具备用于扩增大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列编号7所示的碱基序列组成的引物和由序列编号8所示的碱基序列组成的引物；
第五引物对：具备用于扩增李斯特菌(Listeria属)的DNA的、由序列编号9所示的碱基序列组成的引物和由序列编号10所示的碱基序列组成的引物；
第六引物对：具备用于扩增沙门氏菌(Salmonella属)的DNA的、由序列编号11所示的碱基序列组成的引物和由序列编号12所示的碱基序列组成的引物；
第七引物对：具备用于扩增金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA的、由序列编号13所示的碱基序列组成的引物和由序列编号14所示的碱基序列组成的引物；以及
第八引物对：具备用于扩增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA的、由序列编号15所示的碱基序列组成的引物和由序列编号16所示的碱基序列组成的引物。
5.根据权利要求4所述的食物中毒菌的检测方法，其特征在于，
使用所述第一至第八的所有的引物对，在利用PCR法的扩增对象的试样中包含对应于这些引物对的一个或两个以上的食物中毒菌的核酸时，特异性地扩增该核酸。
6.根据权利要求4或5所述的食物中毒菌的检测方法，其特征在于，将所述扩增产物进行电泳，同时检测一种或两种以上的食物中毒菌。
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