KR100994820B1

KR100994820B1 - 식중독 병원체의 검출 방법 및 신속한 검출 키트

Info

Publication number: KR100994820B1
Application number: KR1020070093037A
Authority: KR
Inventors: 남용석; 김수복; 백묘아; 최선미; 홍성원
Original assignee: 주식회사 코젠바이오텍
Priority date: 2007-09-13
Filing date: 2007-09-13
Publication date: 2010-11-16
Also published as: KR20090027875A

Abstract

본 발명은 식중독 병원체의 검출 방법 및 신속한 검출 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 멀티플렉스 실시간 PCR 방법에 의한 식중독의 원인이 되는 총 12종의 병원체를 동시에 신속 정확하게 검출하는 방법 및 상기 방법을 실시할 수 있는 사용하기 용이한 검출 키트를 제공한다.

식중독, 검출

Description

식중독 병원체의 검출 방법 및 신속한 검출 키트{METHOD OF DETECTING PATHOGENS RESPONSIBLE FOR FOOD POISONING AND FAST DETECTION KIT}

본 발명은 식중독 병원체의 검출 방법 및 신속한 검출 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 멀티플렉스 PCR로 사용가능한 12종의 식중독 병원체 검출용 프라이머를 이용한 식중독 병원체를 검출하여, 식품 안정성을 확인하는 방법에 관한 것이다.

식중독은 자연독이나 유해물질이 함유된 음식물을 섭취함으로써 생기는 급성 또는 만성적인 질환으로, 주로 발열, 구역질, 구토, 설사, 복통 등의 증세를 동반한다. 식중독을 원인물질에 따라 분류하면 세균성 식중독, 화학성 식중독, 자연독 식중독, 미생물 독성대사물질에 의한 식중독으로 구분할 수 있다. 각 부류에 속하는 독성물질은 그 종류가 매우 많으며, 독성물질은 당장 건강을 해칠 만한 양이 아니라 하더라도 많은 식품 중에 널리 분포되어 있어서 만성중독·발암성·돌연변이 유발성 및 기형 유발성 알레르기성 반응을 일으키는 원인이 될 수도 있다.

식중독의 대부분은 세균에 의하여 생기는 세균성 식중독으로서, 여기에는 병원대장균에 의한 감염형 식중독과 병원체가 생성한 독소에 의한 독소형 식중독이 있다.

감염형 식중독은 살아 있는 유해세균을 다량으로 섭취함으로써 발생하는 것이므로, 식품을 가열해서 먹으면 세균은 사멸해 버리기 때문에 중독되는 일이 없다. 그러나 독소형 식중독은 세균은 죽어도 독소는 그대로 남아 있으므로 음식물을 가열해도 남은 독소가 중독을 일으키는 경우이다.

식품에서 집단 식중독을 일으킬 수 있는 대표적인 병원성 세균으로는 하기 12종이 있다: 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejunii), 에셰리키아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia Enterocolitica), 살모넬라 종(Salmonella spp.), 시겔라 종(Shigella spp.), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)가 있다.

이들 식중독을 유발하는 병원성 세균은 식품에 일반적으로 10⁶ 내지 10⁸ CFU/g 이상으로 존재할 경우에 사람에게서 식중독을 발병시킬 수 있다고 알려져 있지만, 병원성 세균에 따라 10 내지 1000 CFU 만으로도 식중독을 발병시킬 수 있다고 한다.

오늘날, 학교 급식 등의 단체 급식 확대 및 외식 기회 증가 등의 식생활 패 턴의 변화와, 냉동 식물 및 레또르뜨 식품을 포함한 즉석 요리 식품 및 다짐육 등과 같은 간편 식품에 대한 수요 증가로 인해 식중독 발생 비율이 증가하고 있으며, 그 규모도 집단화 및 대형화되고 있는 추세이다. 따라서, 식품내 식중독 유발성 병원체의 존재를 신속, 정확하게 판단하여, 식품에 대한 안정성을 보장할 수 있는 방안이 시급히 요구되고 있는 실정이다.

상기 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 사람에게서 식중독을 유발할 수 있는 1 내지 12 종의 식중독 병원체를 정확하고 신속하게 동시에 검출할 수 있는 식중독 병원체에 특이적인 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 각각의 식중독 병원체에 특이적인 프라이머 쌍과 이의 증폭 산물을 탐지하기 위한 프로브 1개로 이루어진 식중독 병원체 검출용 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 2 내지 12종의 식중독 병원체를 다양한 조합으로 동시에 검출할 수 있는 식중독 병원체 검출용 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 단 2시간 이내에 식품내 식중독 병원체의 존재 여부를 정확하게 판단할 수 있는 식중독 병원체 특이적인 프라이머를 이용한 실시간 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 사용이 용이하며, 단시간에 신속 정확하게 식중독 병원체를 검출할 수 있는 검출 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 식중독 병원체 검출용 프라이머를 제공한다:

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejunii)에 특이적인 프라이머 쌍;

서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 에셰리키아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)에 특이적인 프라이머 쌍;

서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 에셰리키아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)에 특이적인 프라이머 쌍;

서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 특이적인 프라이머 쌍;

서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 특이적인 프라이머 쌍;

서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus)에 특이적인 프라이머 쌍;

서열번호 19의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)에 특이적인 프라이머 쌍;

서열번호 22의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia Enterocolitica)에 특이적인 프라이머 쌍;

서열번호 25의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 살모넬라 종(Salmonella spp.)에 특이적인 프라이머 쌍;

서열번호 28의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 시겔라 종(Shigella spp.)에 특이적인 프라이머 쌍;

서열번호 31의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)에 특이적인 프라이머 쌍;

서열번호 34의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)에 특이적인 프라이머 쌍; 및

서열번호 37의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어진 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)에 특이적인 프라이머 쌍.

또한, 본 발명은 하기 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 식중독 병원체 탐지용 프로브를 제공한다:

서열번호 3의 염기서열로 이루어진 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejunii) 탐지용 프로브;

서열번호 6의 염기서열로 이루어진 에셰리키아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7) 탐지용 프로브;

서열번호 9의 염기서열로 이루어진 에셰리키아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7) 탐지용 프로브;

서열번호 12의 염기서열로 이루어진 스타필로코커스 아우레우 스(Staphylococcus aureus) 탐지용 프로브;

서열번호 15의 염기서열로 이루어진 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 탐지용 프로브;

서열번호 18의 염기서열로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus) 탐지용 프로브;

서열번호 21의 염기서열로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 탐지용 프로브;

서열번호 24의 염기서열로 이루어진 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia Enterocolitica) 탐지용 프로브;

서열번호 27의 염기서열로 이루어진 살모넬라 종(Salmonella spp.) 탐지용 프로브;

서열번호 30의 염기서열로 이루어진 시겔라 종(Shigella spp.) 탐지용 프로브;

서열번호 33의 염기서열로 이루어진 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 탐지용 프로브;

서열번호 36의 염기서열로 이루어진 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)탐지용 프로브; 및

서열번호 39의 염기서열로 이루어진 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 탐지용 프로브.

또한, 본 발명은 상기 식중독 병원체 검출용 프라이머 및 상기 식중독 병원 체 탐지용 프로브를 포함하는, 식중독 병원체를 실시간 PCR로 검출하기 위한 식중독 병원체 검출 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 식중독 병원체 검출 세트 1종 이용하여 실시간 PCR을 실시하는 단계 및 실시간 PCR 결과를 확인하여 식중독 병원체의 오염 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 프로브의 3' 말단 및/또는 5' 말단이 FAM(카르복시플루오레세인), VIC(2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), TAMRA(카르복시테트라메틸로다민), JOE(카르복시-4', 5'-디클로로-2', 7'-디메톡시플루오레세인), ROX(카르복시-X-로다민), NED(2'-클로로-5'-플루오로-7' 8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), HEX(2', 4', 5', 7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인), TET(2', 7'-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인) 및 Cy5로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광 표지인자로 표지된 것을 특징으로 하는, 식중독 병원체의 검출 방법을 제공한다. 이들 형광프로브는 형광시약인 SYBR GreenI로 대체할 수 있다.

또한, 본 발명은 식중독 병원체 검출 세트 2종 이상을 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하는 단계 및 실시간 멀티플렉스 PCR 결과를 확인하여 식중독 병원체의 오염 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 사용되는 프로브는 각각 3' 말단 및/또는 5' 말단이 서로 다른 색상의 FAM(카르복시플루오레세인), VIC(2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), TAMRA(카르복시테트라메틸로다민), JOE(카르복시-4', 5'-디클로로-2', 7'-디메톡시플루오레세인), ROX(카르복시-X-로다민), NED(2'-클로로-5'-플루오로-7' 8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), HEX(2', 4', 5', 7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인), TET(2', 7'-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인) 및 Cy5로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광 표지인자로 표지된 것을 특징으로 하는, 식중독 병원체의 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 식중독 병원체 검출용 프라이머; 및 각각 3' 말단 및/또는 5' 말단이 서로 다른 색상의 FAM(카르복시플루오레세인), VIC(2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), TAMRA(카르복시테트라메틸로다민), JOE(카르복시-4', 5'-디클로로-2', 7'-디메톡시플루오레세인), ROX(카르복시-X-로다민), NED(2'-클로로-5'-플루오로-7' 8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), HEX(2', 4', 5', 7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인), TET(2', 7'-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인) 및 Cy5로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광 표지인자로 표지된 식중독 병원체 탐지용 프로브를 포함하는, 식중독 병원체 검출용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 현재 국내의 식중독 검사 방법이 시간, 비용, 노동력 측면에서 비효율적임을 인식하여, 다수 종의 식중독 병원체를 한꺼번에 검출하여 식품의 안정성을 평가할 수 있는 방법을 연구하던 중, 하나의 검사 반응물에서 각각의 식중독 병원체를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍, 각 증폭된 산물을 탐지하는 프로브, 상기 2종 이상의 프라이머 쌍 및 프로브가 조합된 상태에서도 서로다른 고유 타겟을 증폭 및 탐지할 수 있는 검출 조건, 및 검출 결과를 한번에 파악할 수 있는 방법을 확립하게 되었으며, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 각 식중독 병원체에 특이적인 표적 유전자를 PCR을 통해 증폭시키고, 동시에 증폭 산물에 혼성가능하며 검출가능한 수단으로 표지된 프로브를 반응시킴으로써, 실시간 PCR 방법을 통해 식중독 병원체를 검출하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 각 식중독 병원체에 특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 한 세트로 하여, 1 세트 또는 2세트 이상의 식중독 병원체 검출용 세트를 동시에 이용하는 방법으로, 식품내 식중독 병원체 오염을 검사에 필요한 과정을 현저하게 단축시킨 신속 정확한 방법이다.

본 발명에서 언급한 실시간 PCR 방법은 thermal cycler와 분광 형광 광도계가 일체화된 장치를 이용하여, 실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링하여 얻고자하는 DNA의 양을 분석하는 방법을 의미한다. 실시간 PCR 방법은 PCR 증폭산물의 확인을 위한 전기영동이 필요 없으며, 증폭이 지수함 수적으로 일어나는 영역에서 증폭 산물량을 비교하여 보다 정확한 정량이 가능한, 신속성과 정량성이 뛰어난 방법이다.

본 발명의 식중독 병원체는 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejunii), 에 셰리키아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia Enterocolitica), 살모넬라 종(Salmonella spp.), 시겔라 종(Shigella spp.), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)로 이루어진 군으로부터 1종 이상, 바람직하기로는 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종 이상 선택될 수 있다. 가장 바람직하기로는 12종이다.

본 발명에서는, 식중독 병원체의 표준균주를 확보하고, 각각의 다양한 독소 유전자 및 특이적 유전자를 검색하여 최종적으로 표적 유전자를 선정하였다. 이들의 염기서열을 GeneBank 등의 데이타베이스에서 확인한 후, 병원체 특이적인 염기서열 부위를 결정하여 이 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 제작하였다. 이후, 확보한 각 표준균주로부터 DNA를 추출하고, 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭된 DNA 절편에 대한 염기서열을 결정하였다. 이러한 염기서열에 대한 정보를 이용하여, 각각의 병원체 특이적인 프라이머를 제작하였고, 이 때, 식품 가공 과정에서 심하게 절편화된 DNA도 검출할 수 있어, 실시간 PCR시 적합하도록 80-150 bp 로 증폭산물 크기를 조정하여 제작하고, 특이도를 높이는 방안으로 증폭산물 크기를 넘어서는 방법도 고려하였다.

아울러, 12종의 식중독 병원체에 특이적 프라이머를 여러 세트로 제작한 다 음, 비특이적 반응이 일어나지 않는 단일 및 멀티플렉스 PCR 최적조건을 확립하였다. 프라이머와 프로브는 30 - 70% 의 GC를 나타내는 부위에서 약 18 - 30 bp 의 길이로 제작하였고, 이때, 모든 프라이머의 Tm 값은 58 - 62 ℃로 하고, 프로브의 Tm 값은 해당 프라이머보다 약 8 - 10℃ 높게 설정하였다. 그리고, 프로브의 5'말단에는 구아니딘 염기가 오는 것은 피하도록 하며, 4개 이상의 염기가 반복되지 않도록 하였다.

이러한 과정으로 제작한, 본 발명의 식중독 병원체 검출 세트의 상세한 사항은 하기와 같다.

1) 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejunii)

- 표적 유전자: Hip O

- 프라이머 쌍

정방향: 5'-TCT TTA TTG CTT GCT GCA AA-3'(서열번호 1)

역방향: 5'-AAA GCC ACA ACA AGT AAA GA-3'(서열번호 2)

- 프로브: 5'-CGG ATA GTT ATA GCA TTG AA-3'(서열번호 3)

- 증폭산물의 크기: 323 bp

2) 에셰리키아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)

- 표적 유전자: stx1, stx2

- 프라이머 쌍:

정방향: 5'-CGT ATG TAG ATT CGC TGA ATG -3'(서열번호 4)

역방향: 5'-GTA AAG ACG TAC CTC CTG ATG -3'(서열번호 5)

정방향 프라이머:5'-GAT AGA CTT TTC GAC CCA ACA AAG -3'(서열번호 7)

역방향: 5'-TTG CTC AAT AAT CAG ACG AAG ATG -3'(서열번호 8)

- 프로브: 5'-TCG CTC TGC AAT AGG TAC -3'(서열번호 6)

5'-CGC GCC TGA TAG ACA TCA AG -3'(서열번호 9)

- 증폭산물의 크기: 81 bp, 204 bp

3) 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)

- 표적 유전자: femA

- 프라이머 쌍:

정방향: 5'- TGA AGG TTA TGA AAC ACA TT -3'(서열번호 10)

역방향: 5'- ATG GTA AAT ATG GAT CGA TAT GTA -3'(서열번호 11)

- 프로브: 5'-AAT AAA AAA CAA TAA TAA CGA GG-3'(서열번호 12)

- 증폭산물의 크기: 237 bp

4) 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)

- 표적 유전자: bceT

- 프라이머 쌍:

정방향: 5'- GACTACATTCACGATTACGCAGAA -3'(서열번호 13)

역방향: 5'- CTATGCTGACGAGCTACATCCATA -3'(서열번호 14)

- 프로브: 5'- ACC ACC ACT TCC AGA AAG GC-3'(서열번호 15)

- 증폭산물의 크기: 237 bp

5) 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus)

- 표적 유전자: tox R

- 프라이머 쌍:

정방향: 5'- CGC GTT ATT TTA TTT TTG GCA CT -3'(서열번호 16)

역방향: 5'- TCT GAT ACT CAC CAA TCT GAC -3'(서열번호 17)

- 프로브: 5'-TTA CTA CCG ATT TGC GTA CT-3'(서열번호 18)

- 증폭산물의 크기: 97 bp

6) 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)

- 표적 유전자: iap

- 프라이머 쌍:

정방향: 5'- CTG GCA CAA AAT TAC TTA CAA CGA -3'(서열번호 19)

역방향: 5'-AAC TAC TGG AGC TGC TTG TTT TTC -3'(서열번호 20)

- 프로브: 5'-GCA GTA AGC ACT CCA GTT GC-3'(서열번호 21)

- 증폭산물의 크기: 455 bp

7) 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia Enterocolitica)

- 표적 유전자: ail

- 프라이머 쌍:

정방향: 5'- GAA AAT AGT ATT TCT ATT GGT -3'(서열번호 22)

역방향: 5'- GTA CTT CAG GTT AAA ACC TTT -3'(서열번호 23)

- 프로브: 5'-CCT GAA GTA CCG TTA TGA AC-3'(서열번호 24)

- 증폭산물의 크기: 95 bp

8) 살모넬라 종(Salmonella spp.)

- 표적 유전자: invA

- 프라이머 쌍:

정방향: 5'- GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC -3'(서열번호 25)

역방향: 5'- CGA ATT GCC CGA ACG TGG CGA -3'(서열번호 26)

- 프로브: 5'- TCC TGC GGT ACT GTT AAT -3'(서열번호 27)

- 증폭산물의 크기: 138 bp

9) 시겔라 종(Shigella spp.)

- 표적 유전자: virA

- 프라이머 쌍:

정방향: 5'- CTG CAT TCT GGC AAT CTC TTC ACA -3'(서열번호 28)

역방향: 5'- CAG GCA TGA AAT TAA GCC TG -3'(서열번호 29)

- 프로브: 5'- CGT CTT CCT CTG TGG AAC A -3'(서열번호 30)

- 증폭산물의 크기: 102 bp

10) 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)

- 표적 유전자: vvh

- 프라이머 쌍:

정방향: 5'- ACG AGA CTG GTG TAA TGC GGG -3'(서열번호 31)

역방향: 5'- AGG AGT AAA ACC ATC TGA CGT T -3'(서열번호 32)

- 프로브: 5'- CTT CCA TCG ATG TTC GCG TC -3'(서열번호 33)

- 증폭산물의 크기: 98 bp

11) 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)

- 표적 유전자: alpha-toxin

- 프라이머 쌍:

정방향: 5'- TGC ACT ATT TTG GAG ATA TAG ATA CTC C -3'(서열번호 34)

역방향: 5'- TTT CCT TTC TTC TGC AAA AGT CTC -3'(서열번호 35)

- 프로브: 5'- CAT CCT GCT AAT GTT ACT GC -3'(서열번호 36)

- 증폭산물의 크기: 96 bp

12) 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)

- 표적 유전자: ctx

- 프라이머 쌍:

정방향: 5'- ACT CAA ATG AAT ATC AAC CTT TAT GAT CA -3'(서열번호 37)

역방향: 5'- ACT TCT CAA ACA AAT TGA GGT GGA AAC -3'(서열번호 38)

- 프로브: 5'- GCA AGA GGA ACT CAG ACG -3'(서열번호 39)

- 증폭산물의 크기: 104 bp

본 발명의 식중독 병원체 검출용 세트 총 12종 중 이들의 2종 이상의 조합, 바람직하기로는, 3종 이상, 더 바람직하기로는 4종 이상, 더더 바람직하기로는 5종 이상, 가장 바람직하기로는 6-12종의 조합을 동시에 사용하여 실시간 PCR을 수행할 수 있다. 이들 총 12종의 식중독 병원체 검출용 세트의 조합은 프로브의 3' 및/또는 5' 말단에 검출가능한 수단을 포함하거나, 예컨대 표지되어 있을 수 있다. 이때, 하나의 PCR 반응물에 동시에 사용하는 식중독 병원체 검출용 세트의 종류에 따라, 각각의 프로브는 서로 상이한 검출가능한 수단으로 표지된다. 상기 검출가능한 수단은 프로브에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 모방체 등을 의미한다. 그 예로, 통상적으로 사용되는 형광 표지인자, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 예로, 형광 표지인자가 가장 바람직하다. 형광 표지인자는 현재 시중에 다수 종이 시판되고 있으므로, 용이하게 입수가능하다. 형광 표지인자의 예로는, FAM(카르복시플루오레세인), VIC(2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), TAMRA(카르복시테트라메틸로다민), JOE(카르복시-4', 5'-디클로로-2', 7'-디메톡시플루오레세인), ROX(카르복시-X-로다민), NED(2'-클로로-5'-플루오로-7' 8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), HEX(2', 4', 5', 7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인), TET(2', 7'-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인), Cy5™ 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 형광 표지인자는 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르면 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 PCR 반응물에 함께 사용하는 형광 표지인자는 별개로 검출가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 하며, 서로 다른 색상을 사용할 수 있다. 상기 형광 표지인자에 대한 구체적인 사항 및 선택은 본원 발명에 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명한 것이다.

일 예로, 형광 표지인자는 통상의 방법으로 본 발명에 따른 식중독 병원체 검출용 세트에 포함된 프라이머, 또는 프로브에 표지된다. 표지 방법은 인터컬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자 비콘(Molecualr beacon) 방법들이 있다. 인터컬레이팅 방법은 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(inter-chelator: SYBR Green I, EtBr 등)을 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법으로, 인터컬레이터가 PCR 반응으로 합성된 이중가 닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5'말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3'말단을 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqMan^TM 프로브가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다. 분자 비콘 방법은 양 말단을 형광 표지인자(FAM, TAMRA 등)과 quencher 물질(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 올리고뉴클레오티드 프로브(Molecular Beacon probe)를 PCR 반응계에 첨가하는 방법이다. 분자 비콘 프로브는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하며 형광 표지인자와 quencher 물질에 근접해 있어 형광발생이 억제되지만, 어닐링 단계에서 주형 DNA와 상보적인 영역에서 특이적으로 혼성화할때 형광 표지인자와 quencher 물질과의 거리가 멀어져 quencher 물질에 의한 억제가 해소됨으로써 프로브상의 형광색소가 형광을 나타내게 된다. 그러나, 혼성화되지 않은 분자 비콘 프로브는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않게 된다.

이러한 방법을 본 발명의 식중독 병원체를 검출하기 위한 실시간 멀티플렉스PCR 방법에 적용할 수 있다. 상기한 방법들은 당업계에 공지된 것이므로, 반응 효율, 시간, 형광 표지인자 타입 등을 적절히 고려하여, 특정 방법을 선택할 수 있을 것이다. 본 발명에서는 일 예로, TaqMan™ 프로브 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 식중독 병원체를 검출하는 방법에 있어, 멀티플레스 실시간 PCR 반응 조건은 통상적인 조건을 취할 수 있으며, 일 예로, UDG 활성을 위하여 50℃에서 3분간 처리하고, 초기 변성(initial denaturation)을 94℃에서 2분간 수행 한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 60℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 30초)을 총 40회 실시하고, 마지막으로 연장(extension, 72℃ 5분)을 실시하는 조건을 취할 수 있다.

실시간 PCR의 경우 반응 조건은 50℃에서 2분간 처리하고, 초기 변성(initial denaturation)을 94℃에서 10분간 수행 한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 15초), 결합/연장(annealing/extension, 60℃에서 1 분)을 총 40회 실시하고, 마지막으로 연장(extension, 72℃ 5분)을 실시하는 조건을 취할 수 있다.

또한, 본 발명의 식중독 병원체 검출용 세트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여, 실시할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭산물을 비 특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다.

본 발명에 사용가능한 실시간 PCR 기기로는 AB 사의 Real-time PCR 기기 7900, 7500, 7300, Stratagene 사의 Mx3000p, 및 BioRad 사의 Chromo 4 기기 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. PCR 종료시 이러한 실시간 PCR 기기의 레이 저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지인자를 감지하여 도 17a-m과 같은 피크를 구현한다. 이에, 전기영동과정없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다.

본 발명의 식중독 병원체 검출용 세트 및 이를 이용한 식중독 병원체 검출 방법에 의해, 기존의 식중독 병원체를 식별하기 위한 PCR 과정을 현저하게 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다. 이러한 방법은 전기영동법으로는 분별하기 어려웠던 적은 농도의 DNA 절편의 유무나 100 bp 미만의 PCR 산물의 확인을 레이저 감광으로 구분할 수 있고, PCR 산물에 의한 오염에 대한 우려가 없으며, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 시험과정이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집, 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다.

또한, 본 발명은 식중독 병원체 검출용 프라이머; 및 각각 3' 말단 및/또는 5' 말단이 서로 다른 색상의 FAM(카르복시플루오레세인), VIC(2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), TAMRA(카르복시테트라메틸로다민), JOE(카르복시-4', 5'-디클로로-2', 7'-디메톡시플루오레세인), ROX(카르복시-X-로다민), NED(2'-클로로-5'-플루오로-7' 8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), HEX(2', 4', 5', 7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인), TET(2', 7'-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인) 및 Cy5로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광 표지인자로 표지된 식중독 병원체 탐지용 프로브를 포함하는, 식중독 병원체 검출용 키트를 제공한다. 상기 프라이머 쌍 및 프로브는 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징된다. 또한, 본 발명의 키트는 텍 중합효소(Taq polymerase), MgCl₂를 포함한 반응 완충액, dNTP 및 안정화제(stabilizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 당업계에 공지된 다른 시약, 예컨대 실시간 PCR용 마스터 믹스를 추가적으로 포함할 수 있다.

일 예로, 본 발명의 키트는 멀티플렉스 실시간 PCR 키트이며, 도 1과 같은 키트로 제작된다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 식중독 병원체 검출용 검출 세트 및 검출 방법은 실시간 멀티플렉스 PCR 방법에 의해 식중독의 원인이 되는 총 12종의 병원체를 동시에 검출함으로써, 식품내 식중독 병원체의 오염 여부를 신속 정확하게 판단할 수 있다.

하기 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시 예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1: 식중독 병원체에 특이적인 프라이머 제조

1-1. 식중독 유발성 대한 표준균주 확보

우리나라에서 대표적으로 식중독을 유발하는 것으로 알려진 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejunii), 에셰리키아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia Enterocolitica), 살모넬라 종(Salmonella spp.), 시겔라 종(Shigella spp.), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnifcus), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)를 확보하였다.

아울러, 검출 특이도를 조사할 수 있는 통합성(inclusivity) 및 독점성(exclusivity)을 측정하기 위하여, VITEC, PCR, 실시간 PCR 등과 비교하였던 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 그레이(Listeria grayi), 리스테리아 무로이(Listeria murroy), 리스테리아 미노쿠이아(Listeria innocuia) 등의 균주도 확보하였다.

1-2. 식중독 병원체의 특이적인 유전자 선정

각 식중독 병원체의 정확한 검출을 위해, 매우 다양한 독소 유전자 및 특이적인 유전자를 검색하여 최종적으로 표적 유전자를 선정하였다(표 1).

식중독 병원체의 PCR 검출을 위한 유전자 부위

식중독 병원체	표적 유전자	후보 유전자
캠필로박터 제주니	Hip O	ccoN, gyrA
에셰리키아 콜리 O157:H7	stx1, stx2	eaeA
스타필로코커스 아우레우스	femA	nuclease gene
바실러스 세레우스	bceT	hemolysin
비브리오 파라헤몰리티커스	tox R	tdh, trh
리스테리아 모노사이토게네스	iap	hlyA
여시니아 엔테로콜리티카	ail	yadA
살모넬라 종	invA	hilA
비브리오 콜레라	ctx	hlyA
비브리오 불니피쿠스	vvh	hly
클로스트리듐 퍼프린젠스	alpha-toxin	장독소
시겔라 종	virA	ipaH

1-3. 프라이머 및 프로브 제작

선별한 식중독 병원체 특이적인 유전자의 염기서열을 NCBI, EMBL, GeneBank등에서 확인하여, 특이적인 염기서열 부위를 결정하였고, 이 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머와 프로브를 제작하였다. 프라이머는 식품 가공 과정 중에 심하게 절편화된 DNA도 검출할 수 있도록 제작하였고, 아울러 실시간 PCR에 적합하게 80-150 bp의 증폭 산물이 증폭되도록 제안하였다.

프라이머/프로브 제작 전용 프로그램으로, 각 병원체에 대한 특이적 유전자부위를 검색하여, 30 내지 70%의 GC를 나타내는 부위에서 약 18 내지 30 bp의 길이로 프라이머와 프로브를 여러 세트 제작하였다. 모든 프라이머의 Tm 값은 58 - 62 ℃이고, 프로브의 Tm 값은 해당 프라이머보다 약 8 - 10 ℃ 높게 설정하였다. 프로브의 5'말단에는 구아니딘 염기가 오지 않게 하였고, 동일한 염기가 4개 이상 반복되지 않게 하였다.

1-3-1. 캠필로박터 제주니

캠필로박터 제주니의 표적 유전자로, hipO(GeneBank accession number, AL111168) 유전자를 정하고, NCBI, EMBL, GeneBank 등의 데이터베이스를 통해 hipO 의 염기서열을 확보하였다. 비교 분석 결과, 동일한 염기서열 나타내는 부분에서 특이 프라이머와 프로브를 제작하였다(도 2).

hipO 유전자 염기서열을 분석한 결과, 실시간 PCR에 적정한 150 bp의 증폭 산물 크기를 만족시킬 수 있는 부위가 없어, 150 bp 이상의 부위를 선정하였다. 또한, 프라이머의 Tm 값은 58 - 61 ℃로 제작하였다. 또한, 프로브는 제작된 프라이머 증폭 산물 내에 위치하도록 하였으며, 프로브의 Tm 값은 프라이머의 보다 약 10 ℃ 높게 제작하였다. 캠필로박터 제주니의 특이적인 프라이머 및 프로브는 하기 표 2에 나타낸다. 이때 프로브의 5' 말단은 FAM(카르복시플루오레세인), 3' 말단은 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)으로 표지되도록 하였다.

캠필로박터 제주니의 특이적인 프라이머 및 프로브

서열번호	명명	서열	산물 크기
1	CJ-hip F	5'-TCT TTA TTG CTT GCT GCA AA-3'	323 bp
2	CJ-hip R	5'-AAA GCC ACA ACA AGT AAA GA-3'	323 bp
3	CJ-hip FAM	5'-FAM CGG ATA GTT ATA GCA TTG AA MGBNFQ-3'

1-3-2. E. coli O157:H7

E. coli O157:H7은 독성 유전자로 stx1 또는 stx2를 각각 하나씩 가지거나, 또는 stx1 및 stx2 둘다를 모두 가지고 있다. 이에, 이 2가지 유전자를 모두 검출하기 위하여 이중(duplex)으로 제작하였다.

stx1-1(AB083044) 염기서열을 기초로 NCBI, EMBL, GeneBank 등에서 검색한 8 종류의 stx1에 해당되는 유전자간의 염기서열들을 비교, 분석하였으며, 그 중 보존적인 부분에서 프라이머와 프로브를 제작하였다(도 3).

E. coli O157:H7의 독성 유전자 stx1 유전자의 특이적인 프라이머는 81 bp의 증폭산물 크기로 제작하였고, Tm 값이 58 - 61 ℃로 하였다. 프로브는 프라이머의 증폭산물 내에 위치하도록 하였으며, 효율을 향상시키기 위하여 정방향 프라이머 가까이 위치하도록 제작하였다. 프로브의 Tm 값은 프라이머의 Tm 보다 약 10 ℃ 높게 하였다(표 3).

상기와 동일한 방법으로 stx2(stx2-2, AB071845) 유전자를 검색된 7 종의 염기서열과 비교하여(도 4), 표 3의 프라이머 및 프로브를 제작하였다. stx2 유전자는 검색된 7종의 미생물에서 염기서열이 다양하여, 실시간 PCR에 적정한 150 bp의 증폭산물 크기를 만족시킬 수 있는 부위를 찾기 힘들었다. 이에, 염기서열이 최대한 일치하는 부위를 선정하였으며, 프라이머의 Tm 값은 58 - 61 ℃로 하였다. 특이적인 프로브는 제작된 프라이머의 증폭산물 내에 위치하도록 제작하였으며, 제작된 프라이머보다 Tm 값이 약 10 ℃ 높게 제작하였다. 이때 프로브의 5' 말단은 VIC(2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인) 또는 FAM(카르복시플루오레세인), 3' 말단은 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)으로 표지되도록 하였다.

E. coli O157:H7의 stx1, stx2 유전자의 특이적인 프라이머 및 프로브

서열번호	명명	서열	산물의 크기
4	Stx1-F	5'-CGT ATG TAG ATT CGC TGA ATG -3'	81 bp
5	Stx1-R	5'-GTA AAG ACG TAC CTC CTG ATG -3'	81 bp
6	Stx1-VIC	5'-VIC TCG CTC TGC AAT AGG TAC MGBNFQ-3'
7	EC-up	5'-GAT AGA CTT TTC GAC CCA ACA AAG -3'	204 BP
8	EC-down	5'-TTG CTC AAT AAT CAG ACG AAG ATG -3'	204 BP
9	EC-FAM	5'-FAM CGC GCC TGA TAG ACA TCA AG MGBNFQ-3'

1-3-3. 스타필로코커스 아우레우스

스타필로코커스 아우레우스에 대한 표적 유전자로 femA(consensus: M23918)를 선정하였고, 4종의 염기서열을 분석하였다. 동일한 염기서열을 보이는 특이적인 부분에서 프라이머와 프로브를 제작하였다(도 5).

스타필로코커스 아우레우스의 특이적인 프라이머는 실시간 PCR에 적합하도록 150 bp로 증폭산물 크기를 조정하여 제작하려 하였으나, 조건에 맞는 위치가 발견되지 않아 증폭산물의 크기가 237 bp이도록, 프라이머를 선정하였다. 또한 프라이머의 Tm 값은 58 - 61 ℃로 제작하였다. 프로브는 제작된 프라이머에 의한 증폭산물 내에 존재하도록 제작하였으며, 정방향 프라이머 가까이 위치하도록 제작하였다. 또한, 프라이머의 Tm 값보다 약 10 ℃ 높게 제작하였다. 스타필로코커스 아우레우스의 특이적인 프라이머 및 프로브는 하기 표 4에 나타낸다. 이때 프로브의 5' 말단은 FAM(카르복시플루오레세인), 3' 말단은 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)으로 표지되도록 하였다.

스타필로코커스 아우레우스의 특이적인 프라이머 및 프로브

서열번호	명명	서열	산물의 크기
10	Sta-F	5'- TGA AGG TTA TGA AAC ACA TT -3'	237 bp
11	Sta-2	5'- ATG GTA AAT ATG GAT CGA TAT GTA -3'	237 bp
12	Sta-FAM	5'-FAM AAT AAA AAA CAA TAA TAA CGA GG MGBNFQ-3'

1-3-4. 바실러스 세레우스

바실러스 세레우스의 표적 유전자로는 독소 유전자인 bceT를 선정하였고, 염기서열을 검색하였다. 그 결과, 6종의 염기서열을 확인할 수 있었다. 6종의 염기서열에서 동일한 부분을 찾아, 프라이머와 프로브를 제작하였다(도 6).

프라이머의 Tm 값이 58 - 61 ℃로 제작하였다. 프로브는 제작된 프라이머에 의한 증폭산물 내에 존재하도록 제작하였으며, 정방향의 프라이머 가까이 위치하도록 제작하였다. 또한, 프라이머의 Tm 값보다 약 10 ℃ 높게 제작하였다. 바실러스 세레우스의 특이적인 프라이머와 프로브는 표 5에 나타낸다. 이때 프로브의 5' 말단은 FAM(카르복시플루오레세인), 3' 말단은 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)으로 표지되도록 하였다.

바실러스 세레우스의 특이적인 프라이머 및 프로브

서열번호	명명	서열	산물의 크기
13	bceT-up	5'- GACTACATTCACGATTACGCAGAA -3'	237 bp
14	bceT-down	5'- CTATGCTGACGAGCTACATCCATA -3'	237 bp
15	BC-FAM	5'-FAM ACC ACC ACT TCC AGA AAG GC MGBNFQ-3'

1-3-5. 비브리오 파라헤몰리티쿠스

비브리오 파라헤몰리티쿠스의 표적 유전자로 독소 유전자인 toxR(AB063113) 유전자를 선정하여, 염기서열을 검색하였다. toxR 유전자는 비브리오 종에서 공통적으로 발견되는 독소 유전자이다. toxR 유전자는 비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum)(VAtoxR1) 및 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)(VVtoxR1, VVtoxr2)를 대상으로 염기서열을 검색 및 비교하여, 비브리오 파라헤몰리티쿠스의 특이적인 부위를 이용하여 프라이머와 프로브를 제작하였다(도 7).

비브리오 파라헤몰리티쿠스의 독소 유전자인 toxR의 프라이머는 비브리오 안구일라룸 및 비브리오 불니피쿠스의 toxR 유전자의 염기서열과 비교하여 일치하지 않는 위치 즉, 비브리오 파라헤몰리티쿠스의 특이적인 지역을 실시간 PCR에 가장 적합한 97 bp 의 증폭산물 크기로 제작하였고, 프라이머의 Tm 값은 58 - 61 ℃로 제작하였다. 프로브는 제작된 프라이머의 증폭산물 내에 위치하도록 제작하였으며, 이론적으로 가장 효율이 좋은 정방향의 프라이머 가까이 위치하도록 제작하였다. 또한 제작된 프라이머보다 Tm 값이 약 10 ℃ 높게 제작하였다. 제작한 프라이머 및 프로브는 표 6에 나타낸다. 이때 프로브의 5' 말단은 FAM(카르복시플루오레세인), 3' 말단은 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)으로 표지되도록 하였다.

비브리오 파라헤몰리티쿠스에 특이적인 프라이머 및 프로브

서열번호	명명	서열	산물의 크기
16	VP-F	5'- CGC GTT ATT TTA TTT TTG GCA CT -3'	97 bp
17	VP-R	5'- TCT GAT ACT CAC CAA TCT GAC -3'	97 bp
18	VP-FAM	5'-FAM TTA CTA CCG ATT TGC GTA CT MGBNFQ-3'

1-3-6. 리스테리아 모노사이토게네스

리스테리아 모노사이토게네스의 표적 유전자로 iap(AF532302) 유전자를 선정하여, 염기서열을 검색 및 비교하였다(도 8).

프라이머는 실시간 PCR에 적합하도록 150 bp 로 증폭산물 크기를 조정하여 제작하려 하였으나, 이 조건에 적합한 위치가 발견되지 않아, 증폭산물이 455 bp인 프라이머를 제작하였다. 또한, 프라이머의 Tm 값은 58 - 61 ℃로 제작하였다. 프로브는 제작된 프라이머의 증폭산물 내에 존재하도록 제작하였으며, 프라이머의 Tm 값보다 약 10 ℃ 높게 제작하였다. 리스테리아 모노사이토게네스의 toxR 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브는 표 7과 같다. 이때 프로브의 5' 말단은 VIC(2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), 3' 말단은 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)으로 표지되도록 하였다.

리스테리아 모노사이토게네스에 특이적인 프라이머 및 프로브

서열번호	명명	서열	산물의 크기
19	LM-up	5'- CTG GCA CAA AAT TAC TTA CAA CGA -3'	455 bp
20	LM-down	5'- AAC TAC TGG AGC TGC TTG TTT TTC -3'	455 bp
21	LM-VIC	5'-VIC GCA GTA AGC ACT CCA GTT GC MGBNFQ-3'

1-3-7. 여시니아 엔테로콜리티카

여시니아 엔테로콜리티카의 목적 유전자로는 ail(consensus: AJ605740) 유전자를 선정하였고, 여시니아 엔테로콜리티카 5종과 염기서열을 비교하여 특이적인 프라이머와 프로브를 제작하였다(도 9).

여시니아 엔테로콜리티카의 특이적인 프라이머는 실시간 PCR에 적합한 95 bp 크기의 증폭산물이 증폭되도록 프라이머를 제작하였고, 프라이머의 Tm 값은 58 - 61 ℃로 제작하였다. 프로브는 제작된 프라이머에 의한 증폭산물 내에 존재하도록 제작하였으며, 프라이머의 Tm 값보다 약 10 ℃ 높게 제작하였다. 여시니아 엔테로콜리티카의 ail 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브는 표 8에 나타낸다. 이때 프로브의 5' 말단은 VIC(2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), 3' 말단은 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)으로 표지되도록 하였다.

여시니아 엔테로콜리티카에 특이적인 프라이머 및 프로브

서열번호	명명	서열	산물의 크기
22	YER-up	5'- GAA AAT AGT ATT TCT ATT GGT -3'	95 bp
23	YER-down	5'- GTA CTT CAG GTT AAA ACC TTT -3'	95 bp
24	YER-VIC	5'-VIC CCT GAA GTA CCG TTA TGA AC MGBNFQ-3'

1-3-8. 살모넬라 종

살모넬라 종의 표적 유전자로 invA(U43273) 유전자를 선정하였고, CNBI, EMBL, Genebank에서 염기서열을 검색하여 동일한 염기서열을 지니는 부분에서 프라이머 및 프로브를 제작하였다(도 10).

살모넬라 종에 특이적인 프라이머는 Tm 값이 58 - 61 ℃가 되게 선정하였다. 프라이머 쌍에 의한 증폭산물의 크기는 138 bp이다. 프로브는 제작된 프라이머에 의한 증폭산물 내에 존재하도록 하기 표 9와 같이 제작하였고, 프라이머의 Tm 값보다 약 10 ℃ 높게 하였다. 실시간 PCR에 사용되는 살모넬라 종의 invA 유전자의 특이적인 프라이머와 프로브는 표 9와 같다. 이때 프로브의 5' 말단은 VIC(2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), 3' 말단은 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)으로 표지되도록 하였다.

살모넬라 종에 특이적인 프라이머 및 프로브

서열번호	명명	서열	산물의 크기
25	SAL-up	5'- GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC -3'	138 bp
26	SAL-down	5'- CGA ATT GCC CGA ACG TGG CGA -3'	138 bp
27	SAL-VIC	5'-VIC TCC TGC GGT ACT GTT AAT MGBNFQ-3'

1-3-9. 시겔라 종

시겔라 종의 표적 유전자로 virA 유전자를 선정하여, 염기서열을 검색 및 비교하였다. 총 4종의 virA(D２６４６８) 염기서열이 검색되었으며(도 11), 공통된 염기서열을 이용하여 시겔라 종에 특이적인 프라이머와 프로브를 제작하였다.

프라이머는 실시간 PCR에 적합한 80 - 150 bp 크기의 증폭산물내 위치에서 4종류의 염기서열이 모두 일치하는 위치를 찾아 프라이머로 선정하였다. 프라이머의 Tm 값이 58 - 61 ℃로 제작하였다. 또한, 프로브는 제작된 프라이머에 의한 증폭산물 내에 존재하도록 제작하였으며, 정방향의 프라이머 가까이 위치하도록 제작하였다. 프로브의 Tm 값은 프라이머의 Tm 값보다 약 10 ℃ 높게 제작하였다. 실시간 PCR에 사용되는 시겔라 종의 virA 유전자에 특이적인 프라이머와 프로브는 표 10에 나타낸다. 이때 프로브의 5' 말단은 VIC(2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), 3' 말단은 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)으로 표지되도록 하였다.

시겔라 종에 특이적인 프라이머 및 프로브

서열번호	명명	서열	산물의 크기
28	Sh-vir F	5'- CTG CAT TCT GGC AAT CTC TTC ACA -3'	102 bp
29	Sh-vir R	5'- CAG GCA TGA AAT TAA GCC TG -3'	102 bp
30	SH-VIC	5'-VIC CGT CTT CCT CTG TGG AAC A MGBNFQ-3'

1-3-10. 비브리오 불니피쿠스

비브리오 불니피쿠스의 표적 유전자로 vvh(AE016809) 유전자를 선정하여, 염기서열을 검색하였다. 총 5종의 vvhA, vvhB 염기서열을 분석하여(도 12), 비브리오 불니피쿠스에 특이적인 프라이머와 프로브를 제작하였다.

비브리오 불니피쿠스 특이적인 프라이머는 실시간 PCR에 적합한 80 - 150 bp 크기의 증폭산물내 위치에서 5종류의 염기서열이 모두 일치하는 위치를 찾아 프라이머로 선정하였으며, 프라이머의 Tm 값이 58 - 61 ℃로 제작하였다. 프로브는 제작된 프라이머에 의한 증폭산물 내에 존재하도록 제작하였고, 정방향의 프라이머 가까이 위치하도록 제작하였다. 또한 프라이머의 Tm 값보다 약 10 ℃ 높게 제작하였다. 실시간 PCR에 사용되는 비브리오 불니피쿠스의 vvhA, vvhB 유전자의 특이적인 프라이머와 프로브는 표 11에 나타낸다. 이때 프로브의 5' 말단은 FAM(카르복시플루오레세인), 3' 말단은 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)으로 표지되도록 하였다.

비브리오 불니피쿠스에 특이적인 프라이머 및 프로브

서열번호	명명	서열	산물의 크기
31	Vv-F	5'- ACG AGA CTG GTG TAA TGC GGG -3'	98 bp
32	Vv-R	5'- AGG AGT AAA ACC ATC TGA CGT T -3'	98 bp
33	Vv-FAM	5'-FAM CTT CCA TCG ATG TTC GCG TC MGBNFQ-3'

1-3-11. 클로스트리듐 퍼프린젠스

독소 유전자인 알파-톡신(alpha-toxin)을 표적 유전자로 선정하고 염기서열을 검색하였다. 그 결과, 알파-톡신을 코딩하는 유전자인 plc(AY277724) 유전자에 대한 염기서열 11가지가 확인되었다(도 13). 확인된 11가지의 염기서열을 분석하여, 특이적 프라이머와 프로브를 제작하였다.

클로스트리듐 퍼프린젠스에 특이적인 프라이머는 실시간 PCR에 적합한 80 - 150 bp 크기의 증폭산물내 위치에서 11종류의 염기서열 중 상당수 일치하는 위치를 찾아 프라이머로 제작하였다. 프라이머의 Tm 값이 58 - 61 ℃로 제작하였다. 또한, 프로브는 프라이머에 의한 증폭산물 내에 존재하도록 제작하였으며, 정방향의 프라이머 가까이 위치하도록 제작하였다. 또한 프라이머의 Tm 값보다 약 10 ℃ 높게 제작하였다. 실시간 PCR에 사용되는 클로스트리듐 퍼프린젠스의 특이적인 프라이머와 프로브는 표 12에 나타낸다. 이때 프로브의 5' 말단은 FAM(카르복시플루오레세인), 3' 말단은 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)으로 표지되도록 하였다.

클로스트리듐 퍼프린젠스에 특이적인 프라이머 및 프로브

서열번호	명명	서열	산물의 크기
34	CP-F	5'- TGC ACT ATT TTG GAG ATA TAG ATA CTC C -3'	96 bp
35	CP-R	5'- TTT CCT TTC TTC TGC AAA AGT CTC -3'	96 bp
36	CP-FAM	5'- FAM CAT CCT GCT AAT GTT ACT GC MGBNFQ-3'

1-3-12. 비브리오 콜레라

비브리오 콜레라의 표적 유전자로 독소 유전자인 ctx (AY277724)를 선정하여, NCBI, EMBL, Genebank 등의 데이터베이스 검색을 통해, 총 5종의 비브리오 콜레라 ctx 유전자의 염기서열을 확인하였다(도 14). 또한, 동일한 염기서열을 선택하여 비브리오 콜레라의 특이 프라이머와 프로브를 선정하였다.

비브리오 콜레라 특이적인 프라이머는 실시간 PCR에 적합한 80 - 150 bp 크기의 증폭산물을 형성되도록 제작하였고, 프라이머의 Tm 값은 58 - 61 ℃로 제작하였다. 프로브는 제작된 프라이머를 기준으로 형성되는 증폭산물 안에서 정방향의 프라이머와 인접하도록 제작하였으며, 프라이머의 Tm 값보다 약 10 ℃ 높게 제작하였다. 실시간 PCR에 사용되는 비브리오 콜레라의 특이적인 프라이머와 프로브는 표 13에 나타낸다. 이때 프로브의 5' 말단은 FAM(카르복시플루오레세인), 3' 말단은 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)으로 표지되도록 하였다.

비브리오 콜레라에 특이적인 프라이머와 프로브

서열번호	명명	서열	산물의 크기
37	VC-3F	5'- ACT CAA ATG AAT ATC AAC CTT TAT GAT CA -3'	104 bp
38	VC-2R	5'- ACT TCT CAA ACA AAT TGA GGT GGA AAC -3'	104 bp
39	VC-FAM	5'- FAM GCA AGA GGA ACT CAG ACG MGBNFQ-3'

실시예 2: 식중독 병원체 특이 프라이머 및 프로브의 특이도 검증

2-1. 프라이머 특이도

실시예 1에서 제작한 각각의 프라이머 염기서열을 NCBI, EMBL, Genebank 등의 데이터베이스로 특이도를 확인하였다. 그 결과, 해당 미생물 외에는 100% 일치하는 염기서열이 확인되지 않았다.

아울러, 12종 각각의 프라이머 쌍의 서로간 PCR 교차 반응을 확인하였다. 본 실험에서는 최적의 1회 실시간 PCR 조건을 수립하였다. 본 실험의 실시간 PCR 조건은 표 14 및 15와 같다. 실시간 PCR 장치로 Applied Biosystems 사의 ABI 7700을 사용하였다.

PCR 반응 조성

시약	최종 농도	부피 /샘플(㎕)
주형 DNA	50 ng 내지 100 ng	5
텍 중합효소	1 unit	1
정방향 프라이머	10 pmol	2
역방향 프라이머	10 pmol	2
5x 완충액(dNTP, MgCl₂)	1	5
증류수		10
총		25

PCR 반응 조건

단계	온도	시간	사이클cycles
초기 변성	94 ℃	10 분	1
변성	94 ℃	30 초	35
어닐링	60 ℃	30 초
연장	72 ℃	30 초

그 결과는, 도 15에 나타낸다. 도 15는 실시예 1에서 제작한 12종의 식중독 병원체 각각에 대한 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 실시한 것이다. 도 14에서, M은 100 bp의 DNA 마커(ladder)이며, N은 음성 대조군이며, 레인 1은 살모넬라 종의 DNA이고, 레인 2는 비브리오 파라헤몰리티쿠스의 게놈 DNA이고, 레인 3은 비브리오 불니피쿠스의 게놈 DNA이고, 레인 4는 시겔라 종의 게놈 DNA이고, 레인 5는 여시니아 엔테로콜리티카의 게놈 DNA이고, 레인 6은 E.coli O-157:H7 stx1의 게놈 DNA이고, 레인 7은 E.coli O-157:H7 stx2의 게놈 DNA이고, 레인 8은 비브리오 콜레라의 게놈 DNA이고, 레인 9는 바실러스 세레우스의 게놈 DNA이고, 레인 10은 리스테리아 모노사이토게네스의 게놈 DNA이고, 레인 11은 클로스트리듐 퍼프린젠스의 게놈 DNA이고, 레인 12는 캠필로박터 제주니의 게놈 DNA이고, 레인 13은 스타필로코커스 아우레우스의 게놈 DNA이다. A는 바실러스 세레우스에 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR한 결과이고, B는 E.coli O-157:H7 stx1에 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR한 결과이고, C는 클로스트리듐 퍼프린젠스에 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR한 결과이고, D는 클로스트리듐 퍼프린젠스에 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR한 결과이고, E는 비브리오 콜레라에 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR한 결과이고, F-1은 비브리오 파라헤몰리티쿠스에 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR한 결과이고, F-2는 비브리오 불니피쿠스에 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR한 결과이고, G는 스타필로코커스 아우레우스에 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR한 결과이고, H는 여시니아 엔테로콜리티카에 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR한 결과이고, I는 E.coli O-157:H7 stx2에 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR한 결과이고, J는 캠필로박터 제주니에 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR한 결과이고, K는 살모넬라 종에 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR한 결과이고, L는 시겔라 종에 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR한 결과이다.

도 15에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1에서 제작한 각 프라이머 쌍은 각각의 의도한 병원체만 증폭시키며, 다른 병원체에 대해서는 교차반응을 일으키지 않았다. 특히, 레인 6과 7에서 stx1과 stx2의 특이도도 확인되었다.

2-2. 프로브 특이도

실시예 1에서 제작한 프로브의 염기서열을 NCBI, EMBL, Genebank 등의 데이터베이스로 검색하여, 타 균주에 대한 특이도를 확인하였다.

또한, 제작된 프로브의 특이도 확인을 위해, 실험적인 방법으로 ABI 7700 실시간 PCR을 실시하였다. PCR 반응 조성 및 온도 조건은 표 16 및 17과 같다. 본 실험에 사용한 온도 조건은 일반 PCR 방법과 다르게 어닐링(annealing)과 연장 (extension)의 과정이 60 ℃에서 동일하게 이루지게 하였다.

실시간 PCR의 반응 조성

시약	최종 농도	부피/샘플(㎕)
주형 DNA	50 ng - 100 ng	5
2x 마스터 믹스(반응 완충액, dUTP, UDG, 텍 중합효소)	1x	10
정방향 프라이머	10 pmol	2
역방향 프라이머	10 pmol	2
프로브	2 pmol	1
증류수		5
총		25

실시간 PCR의 온도 조건

단계	온도	시간	사이클
초기 변성	94℃	10 분	5
변성 어닐링 및 연장	94℃ 60℃	30 초 1 분	40

실험으로, A행 12열을 NTC(주형 DNA가 없는 대조군)로 반응하였고, H열 12 열은 PTC(양성 대조군)로 이용하여 실시간 PCR 반응 과정중의 오염과 PCR의 정상적인 수행 여부를 확인하였다. 아울러, 프로브에는 FAM 및 VIC 형광 다이를 사용하였고, FAM은 1 - 6열, 11열 및 12열을 세로 방향으로 설정하였고, VIC 다이는 6 - 10열을 이용하였다. 6열은 E. coli O-157을 검출하는 열로 FAM과 VIC 다이를 모두 사용한 멀티플렉스로 PCR 반응을 확인하였다. 1 - 12열까지 세로 방향으로 각 종에 대한 특이도를 확인 하였다.

FAM에 해당하는 1 - 6열, 11열과 12열의 경우, 1열은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 특이적 프로브; 2열은 비브리오 불니피쿠스 특이적 프로브; 3열은 비브리오 콜레라 특이적 프로브; 4열은 바실러스 세레우스 특이적 프로브, 5열은 클로스트리듐 퍼프린젠스 특이적 프로브; 6열은 E.coli O-157 (stx2) 특이적 프로브; 11열은 캠필로박터 제주니 특이적 프로브; 및 12열은 스타필로코커스 아우레우스 특이적 프로브를 반응시켰다. 또한, VIC 다이에 해당하는 6열은 E.coli O-157 (stx1)특이적 프로브; 7열은 살모넬라 종 특이적 프로브; 8열은 여시니아 엔테로콜리티카 특이적 프로브; 9열은 시겔라 종 특이적 프로브; 및 10열은 리스테리아 모노사이토게네스 특이적 프로브를 반응시켰다.

그 결과는 도 16에 나타낸다. 도 16은 12종의 식중독 병원체에 특이적인 프로브 및 게놈 DNA를 96웰 플레이트상에서 실시간 PCR한 결과이다. B행 1 내지 6열은 비브리오 파라헤몰리티쿠스, B행 7 내지 12열은 살모넬라 종, C행 1 내지 6열은 비브리오 불니피쿠스, C행 7 내지 12열은 여시니아 엔테로콜리티카, D행 1 내지 6열은 브리오 콜레라, D행 7 내지 12열은 시겔라 종, E행 1 내지 6열은 바실러스 세레우스, E행 7 내지 12열은 리스테리아 모노사이토게네스, F행 1 내지 6열은 클로스트리듐 퍼프린젠스, F행 7 내지 12열은 캠필로박터 제주니, G행 1 내지 6열은 E.coli O-157 (stx 1, stx2), G행 7 내지 12열은 스타필로코커스 아우레우스 게놈 DNA를 각각 시료로 사용하였다. 그 결과, 다른 식중독 병원체에 대한 증폭은 실시간 PCR로 검출되지 않았으며, 각 특이 프로브는 고유 역할을 충실히 수행하였다.

실시예 3: 12종의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용한 실시간 멀티플렉스 PCR 방법

실시예 1에서 제작한 총 12종의 프라이머 쌍 및 프로브를 실시간 PCR 방법으로 단일 용기에서 동시에 수행하였다. 실시간 PCR 반응 조성 및 반응 조건은 표 16 및 17과 동일하게 사용하였다.

그 결과는 도 17에 나타낸다. 도 17은 12종의 식중독 병원체에 특이적인 프로브 및 프라이머로 식중독 병원체에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다. a는 비브리오 파라헤몰리티쿠스; b는 비브리오 불니피쿠스; c는 비브리오 콜레라; d는 바실러스 세레우스, e는 클로스트리듐 퍼프린젠스; f는 E.coli O-157 (stx1); g는 E.coli O-157 (stx2); h는 살모넬라 종; i는 여시니아 엔테로콜리티카; j는 시겔라 종; k는 리스테리아 모노사이토게네스; l은 캠필로박터 제주니; 및 m은 스타필로코커스 아우레우스의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. 도 17에서, 반응성 확인에 사용된 DNA의 농도는 낮은 Ct 값부터 50 ng, 5 ng, 0.5 ng 그리고 0.05ng의 DNA를 순차적으로 반응한 결과이다. 12종류 모두 Ct 32 - 34에서 검출되었다. 상기 결과로, 본 발명의 12종의 식중독 병원체 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시할 수 있음을 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명의 멀티플렉스 실시간 PCR 키트의 일 예이다.

도 2는 캠필로박터 제주니의 hipO 유전자 염기서열을 비교 정렬하여, 특이적인 프라이머 및 프로브 부위를 선정한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 E.coli O-157의 stx1 유전자 염기서열을 비교 정렬하여, 특이적인 프라이머 및 프로브 부위를 선정한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 E.coli O-157의 stx2 유전자 염기서열을 비교 정렬하여, 특이적인 프라이머 및 프로브 부위를 선정한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 스트필로코커스 아우레우스의 femA 유전자 염기서열을 비교 정렬하여, 특이적인 프라이머 및 프로브 부위를 선정한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 바실러스 세레우스의 독소 유전자인 bceT 유전자 염기서열을 비교 정렬하여, 특이적인 프라이머 및 프로브 부위를 선정한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 비브리오 안구일라룸 및 비브리오 불니피쿠스의 toxR 유전자 염기서열을 비교 정렬하여, 특이적인 프라이머 및 프로브 부위를 선정한 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 리스테리아 모노사이토게네스의 iap 유전자 염기서열을 비교 정렬하여, 특이적인 프라이머 및 프로브 부위를 선정한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 여시니아 엔테로콜리티카의 ail 유전자 염기서열을 비교 정렬하여, 특이적인 프라이머 및 프로브 부위를 선정한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 살모넬라 종의 invA g유전자 염기서열을 비교 정렬하여, 특이적인 프라이머 및 프로브 부위를 선정한 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 시겔라 종의 virA 유전자 염기서열을 비교 정렬하여, 특이적인 프라이머 및 프로브 부위를 선정한 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 비브리오 불니피쿠스의 vvhA, vvhB 유전자 염기서열을 비교 정렬하여, 특이적인 프라이머 및 프로브 부위를 선정한 결과를 나타낸 것이다.

도 13은 클로스트리듐 퍼프린젠스의 알파-톡신을 코딩하는 plc 유전자 염기서열을 비교 정렬하여, 특이적인 프라이머 및 프로브 부위를 선정한 결과를 나타낸 것이다.

도 14는 비브리오 콜레라의 독소 유전자인 ctxB 유전자 염기서열을 비교 정렬하여, 특이적인 프라이머 및 프로브 부위를 선정한 결과를 나타낸 것이다.

도 15는 실시예 1에서 제작한 12종의 식중독 병원체 각각에 대한 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 실시한 것이다.

도 16은 12종의 식중독 병원체에 특이적인 프로브 및 게놈 DNA를 96웰 플레이트상에서 실시간 PCR한 결과이다.

도 17a - m은 12종의 식중독 병원체에 특이적인 프로브 및 프라이머로 식중독 병원체에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.

<110> Kogene Biotech Co., LTD <120> METHOD OF DETECTING PATHOGENS RESPONSIBLE FOR FOOD POISONING AND FAST DETECTION KIT <130> 1 <160> 39 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Campylobacter jejunii <400> 1 tctttattgc ttgctgcaaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Campylobacter jejunii <400> 2 aaagccacaa caagtaaaga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe specific to Campylobacter jejunii <400> 3 cggatagtta tagcattgaa 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to stx1 gene of Escherichia coli O157:H7 <400> 4 cgtatgtaga ttcgctgaat g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to stx1 gene of Escherichia coli O157:H7 <400> 5 gtaaagacgt acctcctgat g 21 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe specific to stx1 gene of Escherichia coli O157:H7 <400> 6 tcgctctgca ataggtac 18 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to stx2 gene of Escherichia coli O157:H7 <400> 7 gatagacttt tcgacccaac aaag 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to stx2 gene of Escherichia coli O157:H7 <400> 8 ttgctcaata atcagacgaa gatg 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe specific to stx2 gene of Escherichia coli O157:H7 <400> 9 cgcgcctgat agacatcaag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Staphylococcus aureus <400> 10 tgaaggttat gaaacacatt 20 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Staphylococcus aureus <400> 11 atggtaaata tggatcgata tgta 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe specific to Staphylococcus aureus <400> 12 aataaaaaac aataataacg agg 23 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Bacillus cereus <400> 13 gactacattc acgattacgc agaa 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Bacillus cereus <400> 14 ctatgctgac gagctacatc cata 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe specific to Bacillus cereus <400> 15 accaccactt ccagaaaggc 20 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Vibrio parahaemolyticus <400> 16 cgcgttattt tatttttggc act 23 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Vibrio parahaemolyticus <400> 17 tctgatactc accaatctga c 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe specific to Vibrio parahaemolyticus <400> 18 ttactaccga tttgcgtact 20 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Listeria monocytogenes <400> 19 ctggcacaaa attacttaca acga 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Listeria monocytogenes <400> 20 aactactgga gctgcttgtt tttc 24 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe specific to Listeria monocytogenes <400> 21 gcagtaagca ctccagttgc 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Yersinia Enterocolitica <400> 22 gaaaatagta tttctattgg t 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Yersinia Enterocolitica <400> 23 gtacttcagg ttaaaacctt t 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe specific to Yersinia Enterocolitica <400> 24 cctgaagtac cgttatgaac 20 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Salmonella spp. <400> 25 gaatcctcag tttttcaacg tttc 24 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Salmonella spp. <400> 26 cgaattgccc gaacgtggcg a 21 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe specific to Salmonella spp. <400> 27 tcctgcggta ctgttaat 18 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Shigella spp. <400> 28 ctgcattctg gcaatctctt caca 24 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Shigella spp. <400> 29 caggcatgaa attaagcctg 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe specific to Shigella spp. <400> 30 cgtcttcctc tgtggaaca 19 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Vibrio vulnificus <400> 31 acgagactgg tgtaatgcgg g 21 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Vibrio vulnificus <400> 32 aggagtaaaa ccatctgacg tt 22 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe specific to Vibrio vulnificus <400> 33 cttccatcga tgttcgcgtc 20 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Clostridium perfringens <400> 34 tgcactattt tggagatata gatactcc 28 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Clostridium perfringens <400> 35 tttcctttct tctgcaaaag tctc 24 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe specific to Clostridium perfringens <400> 36 catcctgcta atgttactgc 20 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Vibrio cholerae <400> 37 actcaaatga atatcaacct ttatgatca 29 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer specific to Vibrio cholerae <400> 38 acttctcaaa caaattgagg tggaaac 27 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe specific to Vibrio cholerae <400> 39 gcaagaggaa ctcagacg 18

Claims

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서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표현되는 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejunii)에 특이적인 프라이머 쌍과 서열번호 3의 염기서열로 표현되는 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejunii) 탐지용 프로브;

서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 표현되는 에셰리키아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)에 특이적인 프라이머 쌍과 서열번호 6의 염기서열로 표현되는 에셰리키아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7) 탐지용 프로브;

서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표현되는 에셰리키아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)에 특이적인 프라이머 쌍과 서열번호 9의 염기서열로 표현되는 에셰리키아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7) 탐지용 프로브;

서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 표현되는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 특이적인 프라이머 쌍과 서열번호 12의 염기서열로 표현되는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 탐지용 프로브

서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 표현되는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 특이적인 프라이머 쌍과 서열번호 15의 염기서열로 표현되는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 탐지용 프로브;

서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 표현되는 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus)에 특이적인 프라이머 쌍과 서열번호 18의 염기서열로 표현되는 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus) 탐지용 프로브;

서열번호 19 및 서열번호 20의 염기서열로 표현되는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)에 특이적인 프라이머 쌍과 서열번호 21의 염기서열로 표현되는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 탐지용 프로브;

서열번호 22 및 서열번호 23의 염기서열로 표현되는 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia Enterocolitica)에 특이적인 프라이머 쌍과 서열번호 24의 염기서열로 표현되는 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia Enterocolitica) 탐지용 프로브;

서열번호 25 및 서열번호 26의 염기서열로 표현되는 살모넬라 종(Salmonella spp.)에 특이적인 프라이머 쌍과 서열번호 27의 염기서열로 표현되는 살모넬라 종(Salmonella spp.) 탐지용 프로브;

서열번호 28 및 서열번호 29의 염기서열로 표현되는 시겔라 종(Shigella spp.)에 특이적인 프라이머 쌍과 서열번호 30의 염기서열로 표현되는 시겔라 종(Shigella spp.) 탐지용 프로브;

서열번호 31 및 서열번호 32의 염기서열로 표현되는 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)에 특이적인 프라이머 쌍과 서열번호 33의 염기서열로 표현되는 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 탐지용 프로브;

서열번호 34 및 서열번호 35의 염기서열로 표현되는 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)에 특이적인 프라이머 쌍과 서열번호 36의 염기서열로 표현되는 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)탐지용 프로브; 및

서열번호 37 및 서열번호 38의 염기서열로 표현되는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)에 특이적인 프라이머 쌍과 서열번호 39의 염기서열로 표현되는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 탐지용 프로브

를 포함하는, 식중독 병원체를 실시간 PCR로 검출하기 위한 식중독 병원체용 검출 세트.
제 14항의 식중독 병원체 검출 세트를 이용하여 실시간 PCR을 실시하는 단계 및 실시간 PCR 결과를 확인하여 식중독 병원체의 오염 여부를 결정하는 단계를 포함하며,

프로브의 3' 말단 또는 5' 말단이 FAM(카르복시플루오레세인), VIC(2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), TAMRA(카르복시테트라메틸로다민), JOE(카르복시-4', 5'-디클로로-2', 7'-디메톡시플루오레세인), ROX(카르복시-X-로다민), NED(2'-클로로-5'-플루오로-7' 8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), HEX(2', 4', 5', 7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인), TET(2', 7'-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인) 및 Cy5로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광 표지인자로 표지된 것을 특징으로 하는, 식중독 병원체의 검출 방법.
삭제
제 14항의 식중독 병원체 검출 세트를 포함하고,

프로브의 3' 말단 또는 5' 말단이 서로 다른 색상의 FAM(카르복시플루오레세인), VIC(2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), TAMRA(카르복시테트라메틸로다민), JOE(카르복시-4', 5'-디클로로-2', 7'-디메톡시플루오레세인), ROX(카르복시-X-로다민), NED(2'-클로로-5'-플루오로-7' 8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), HEX(2', 4', 5', 7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인), TET(2', 7'-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인) 및 Cy5로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광 표지인자로 표지된, 식중독 병원체 검출용 키트.
제 17항에 있어서, 상기 식중독 병원체 검출 세트는 하나의 반응 용기, 스트립(strip) 또는 마이크로플레이트에 패키징되는 것을 특징으로 하는 키트.