KR20220058287A - 바실러스 균주 구별용 프라이머 세트 및 이를 이용하는 방법 - Google Patents

바실러스 균주 구별용 프라이머 세트 및 이를 이용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물 농약 균주인 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis)와 식중독균 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 포함하여 바실러스 균주들을 신속하고 정확하게 구별할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 균주의 구별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머트 세트를 이용하면, 생화학적, 유전적으로 매우 유사하여 종래 생화학적인 방법으로 신속하고 정확하게 검출이 어려웠던 친환경 미생물 농약 균주인 바실러스 터린지엔시스와 식중독균인 바실러스 세레우스에 대하여, 검출능을 향상시키면서 빠르게 구별해 낼 수 있는 장점을 가진다. 더욱이 기타의 바실러스 균주들에 대한 구별도 함께 진행할 수 있기 때문에 보다 더 구체적이고 정확한 분석 정보를 제공할 수 있다.

Description

바실러스 균주 구별용 프라이머 세트 및 이를 이용하는 방법 {Primer set for distinguishing of Bacillus species, and using thereof}
본 발명은 미생물 농약 균주인 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis)와 식중독균 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 포함하여 바실러스 균주를 신속하고 정확하게 구별할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 균주의 구별 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 형광 물질 기반의 프라이머 세트에 관한 것으로 이를 이용하여 바실러스 터린지엔시스, 바실러스 세레우스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리체니포르미스를 동시에 신속하게 구별할 수 있는 프라이머 세트 및 구별 방법에 관한 것이다.
바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 포자 형성 세균으로 자연계에 흔히 존재하고 식중독을 일으킨다. 더욱이, 포자는 저항성이 강하여 일반적인 식품 제조 및 조리 과정에서는 사멸하지 않는다. 따라서 식품의약품안전청에서는 식품의 종류에 따라 바실러스 세레우스의 허용규격을 설정하여 관리하고 있다.
바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 역시 포자 형성 세균이나, 특이하게도 해충에 선택적인 살충성 독소를 생성하므로 친환경적인 미생물 농약으로 근래에 그 사용량이 점차 증가하고 있다. 따라서 식품의 원부재료로 사용되는 농작물에 바실러스 터린지엔시스가 잔류할 가능성은 충분히 높다.
그런데, 위와 같이 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis)는 모두 포자 형성 세균으로 이들 간의 구별이 어렵다는 문제점이 존재한다. 또한, 바실러스 세레우스와 바실러스 터린지엔시스는 생화학적으로나 유전적으로 매우 유사하여 식품공전상의 생화학적 방법으로는 두 균주를 구분하기 어려운 실정이다. 이는 식품에 친환경적 미생물 농약으로 사용된 바실러스 터린지엔시스의 잔존이 식중독균으로 오인될 수 있다는 문제점을 발생시킨다.
이러한 두 균주를 구별하기 위하여, 포자를 형성시켜 살충독소를 관찰하는 현미경 검사법을 일반적으로 이용하고 있다. 그러나, 이 방법은 많은 시간, 노력, 비용이 소요되는 단점이 있으며, 특히 crystal protein을 구분하는데 있어서 많은 혼동을 일으킨다는 문제점을 가지고 있기 때문에 그 정확도 또한 떨어지는 문제가 있다.
근래 유기농산물을 포함한 친환경농산물을 찾는 소비자가 늘어남에 따라 미생물농약의 사용증가로 식품에 잔류하는 바실러스 터린지엔시스가 바실러스 세레우스로 오인되어 식품규격을 초과하는 사례가 발생하고 있다. 이는 결국 경제적 손실로 이어질 수 있기 때문에, 보다 간편하고 신속한 검출법의 개발에 대한 요구가 있다. 특히, 현재 시판중인 식중독 검출키트 중 바실러스 세레우스에 특이적인 프라이머 세트는 바실러스 터린지엔시스와 바실러스 세레우스를 구분없이 검출한다는 문제점이 있기 때문에, 위 두 균주에 대한 구별 방법에 대한 연구 개발이 절실히 필요하다.
국내에서 미생물 농약 균주인 바실러스 터린지엔시스와 식중독균인 바실러스 세레우스를 동시에 구분하는 형광 물질 기반 real time PCR법은 아직 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 매우 유사한 두 종에 대하여 특이적인 프라이머 세트와 형광 물질을 이용하여 구별할 수 있는 방법을 개발함으로써 미생물 농약 균주인 바실러스 터린지엔시스와 식중독균인 바실러스 세레우스 뿐만 아니라 바실러스 서브틸리스와 바실러스 리체니포르미스를 신속하게 구분 검출할 수 있는 시스템을 완성하였다.
공개특허공보 제10-2009-0027875호
이에 따라, 본 발명은 보다 빠르고 정확하게 검출이 가능하게 하는 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 균주의 식별 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로, 본 발명은 (a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와, zmaR 증폭을 위한 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트 및 chit 증폭을 위한 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물을 분석하여 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 식별하여 확인하는 단계;를 포함하는 바실러스 균주의 식별 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 zmaR 증폭을 위한 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트 및 chit 증폭을 위한 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 균주 구별용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 바실러스 균주 구별용 조성물 및 증폭용 시약을 포함하는 의의 구별용 키트를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와, zmaR 증폭을 위한 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트 및 chit 증폭을 위한 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물을 분석하여 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 식별하여 확인하는 단계;를 포함하는 바실러스 균주의 식별 방법을 제공한다.
본 발명의 바실러스 균주의 식별 방법은 (a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계;를 포함한다.
상기 시료는 통상적으로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및/또는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)의 포함 여부의 구별이 필요한 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들어, 미생물농약으로 바실러스 터린지엔시스가 처리된 미가공된 농산물, 가공처리된 농산물, 식품 등 섭취를 목적으로 하는 식품 관련 제품이라면 어떠한 것이라도 본 발명의 시료로 이용될 수 있다.
시료로부터 DNA를 수득하는 것은 통상의 알려진 DNA 수득 방법을 이용할 수 있다. 출발물질이 gDNA인 경우 gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 출발물질이 mRNA인 경우에는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성될 수도 있다. 예를 들어, 상기 DNA 분리는 통상적으로 시료에서 제노믹 DNA(Genomic DNA, gDNA)를 분리하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 퀴아젠(Qiagen)사의 DNeasy mini kit 등의 상업적으로 판매되는 DNA 분리 키트 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 시료는 미생물 농약으로 바실러스 터린지엔시스가 처리된 농산물일 수 있다.
본 발명의 바실러스 균주의 식별 방법은 (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와, zmaR 증폭을 위한 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트 및 chit 증폭을 위한 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 "프라이머"는 복제하려는 핵산가닥에 상보적인 단일가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 진단하고자 하는 균주(예컨대, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis))의 핵산 가닥에 상보적으로 결합할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 뜻하며, 균주의 DNA 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있다.
상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야한다. 상기 프라이머의 길이는 10 ~ 30 뉴클레오티드이다. 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. Primer F는 Primer Foward를 뜻하며, 복사하고자 하는 DNA 주형 가닥의 5' 말단부터 전사시킬 수 있고, Primer R은 Primer Reverse를 뜻하며, 복사하고자 하는 DNA 주형 가닥의 3' 말단부터 전사시킬 수 있다.
본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다. 본 명세서에서 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다.
본 발명의 "실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)”은 목표 DNA분자의 증폭과 양의 측정을 동시 실시하는 방법으로, DNA샘플에서 하나 또는 그 이상의 특정 서열을 위하여, 실시간 중합효소연쇄반응은 검출과 양의 측정을 할 수 있는 방법이다. 계량은 절대적인 복제 수 또는 상대적인 양을 셀 수 있다.
중합효소연쇄 반응을 실시할 때에는 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 반응에 필요한 성분들의 과량은, 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 필요하다. 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
중합효소연쇄 반응은 94-95℃에서 주형 DNA를 전 변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.
본 발명에서는 65℃부터 95℃까지 0.5℃씩 올리면서 멜팅 곡선(melting curve)을 그렸다. 멜팅 커브(melting curve)는 증폭시키고자 하는 타겟 프로덕트(target product)와 다른 경쟁적 프로덕트(competitor product)의 Tm 값이 서로 다른 점을 이용하여, 타겟 프로덕트 이외의 비특이적 증폭 여부를 확인하기 위해 사용된다. PCR 반응 종료 후, sample template를 약 55℃ 정도로 설정하고, 온도를 0.5℃씩 증가시키면서 형광 신호의 크기를 측정한다. 특정 온도가 되면 형광 신호의 크기가 급 감소하는 지점이 발생하게 되는데, 이 지점을 피크(peak)라고 하며, PCR 반응의 산물이 이중가닥에서 단일가닥으로 해리되는 순간을 뜻한다.
이 때, Tm 값은 이중가닥 DNA가 단일가닥 DNA로 해리되는 온도 변화에 있어서, 이중가닥 DNA와 단일가닥 DNA의 비율이 1:1인 경우의 온도를 Tm이라고 한다. Tm 값은 DNA의 길이, 염기 조성에 따라 다르게 나타나며, Tm 값이 높을수록 primer와 대상 DNA 간의 결합 정도를 의미한다.
본 발명에서는 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 zmaR 증폭을 위한 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하고, (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 chit 증폭을 위한 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행할 수 있다. 즉, 각각의 프라이머 세트와 개별적으로 반응을 수행하고, 이들의 산물의 데이터를 함께 해석하는 것일 수 있다. 이러한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는 실시간 다중 PCR(real-time multiplex PCR)을 통해 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와, zmaR 증폭을 위한 프라이머 세트 및 chit 증폭을 위한 프라이머 세트로 실시간 다중 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득할 수 있다. 즉, 다중 리얼타임(multiplex real-time) PCR로 한 번의 실시간 PCR 반응으로 여러 개의 원하는 유전자를 동시에 증폭시켜, 이를 이용하여 한번에 원하는 PCR 산물들을 얻을 수도 있다.
본 발명에서, 각각의 특정 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍이 조합된 상태에서도 서로 다른 고유 타겟을 증폭 및 탐지할 수 있는 검출 조건, 및 검출 결과를 한번에 파악할 수 있는 방법이 확립되어 있기 때문에, 실시간 다중 중합 효소 반응을 이용하더라도 하나의 검사 반응물에서 각 균주의 존재 및 구별이 가능하다.
본 발명에서 프라이머 세트는 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 세트를 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 세트이다.
zwittermicin A-resistance (zmaR) 증폭을 위한 프라이머 세트는 중합효소반응을 통해 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및/또는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)를 구별할 수 있는 정보를 제공한다. 본 발명에 따른 zmaR 증폭을 위한 프라이머 세트는 바람직하게, 서열번호 1 및 2로 이루어질 수 있다.
chit 증폭을 위한 프라이머 세트는 중합효소반응을 통해 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및/또는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)의 유무에 관한 정보를 제공한다. 즉, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및/또는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)의 존재와 다른 미생물들의 존재를 구별할 수 있는 정보를 제공할 수 있다. 구체적으로, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 존재 유무에 대한 정보를 제공하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 chit 증폭을 위한 프라이머 세트는 바람직하게, 서열번호 3 및 4로 이루어질 수 있다.
본 발명의 바실러스 균주의 식별 방법은 (c) 상기 PCR 산물을 분석하여 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 식별하여 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 chit 증폭을 위한 프라이머 세트는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 존재와 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)와 같은 기타의 미생물을 구별할 수 있는 정보를 제공한다. 즉, 바실러스 세레우스 및 바실러스 터린지엔시스가 존재하는 경우, chit 증폭을 위한 프라이머 세트를 통한 중합효소반응을 이용하여 위 균주들의 존재를 확인할 수 있으며, 발생하는 멜팅 곡선 차이 통해 특히 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)와 같은 기타의 바실러스 균주와 차이를 확인할 수 있다.
그리고 나서, 본 발명에 따른 zmaR 증폭을 위한 프라이머 세트는 바실러스 세레우스 및 바실러스 터린지엔시스를 구별할 수 있는 정보를 제공한다. 즉, 바실러스 세레우스 및 바실러스 터린지엔시스에 대하여 각기 상이한 멜팅 곡선 등의 정보를 제공한다. 즉, zmaR 증폭을 위한 프라이머 세트를 통한 중합효소반응을 이용하여 위 균주들을 구별할 수 있다.
따라서, 위 chit 증폭을 위한 프라이머 세트와 zmaR 증폭을 위한 프라이머 세트의 결과를 조합하면, 어떠한 균주들이 시료내 포함되어 있는지 구체적으로 확인할 수 있다.
일실시양태로서 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 존재는 chit 증폭을 위한 프라이머 세트를 통한 균주 유무를 확인하고 zmaR 증폭을 위한 프라이머 세트로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 구별할 수 있게 디자인된다.
일실시양태로서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 존재는 chit 증폭을 위한 프라이머 세트를 통한 균주 유무를 확인하고 zmaR 증폭을 위한 프라이머 세트로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 구별할 수 있게 디자인된다.
일실시양태로서 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)의 존재는 zmaR 증폭을 위한 프라이머 세트로 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis)와 동일 결과를 나타내면서 chit 증폭을 위한 프라이머 세트를 통해 상이한 멜팅 곡선 차이를 나타내는 결과를 확인함으로써 구별할 수 있게 디자인된다.
일실시양태로서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 의 존재는 zmaR 증폭을 위한 프라이머 세트와 chit 증폭을 위한 프라이머 세트 모두에서 타 균주로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)와 상이한 멜팅 곡선 차이를 확인함으로써 구별할 수 있게 디자인된다.
상기 증폭된 PCR 산물의 분석은 DNA 칩. 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 PCR 수행을 통해 증폭된 PCR 산물은 검출 가능한 표지 물질로 표지될수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방산선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.
또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다.
또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.
또한, 상기 PCR 수행을 통해 증폭된 PCR 산물은 검출 가능하도록 형광 시약, 예컨대 SybrGreen 또는 Evagreen 등으로 염색될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, PCR 산물을 분석하는 것은 PCR 산물의 발색 (바람직하게, 형광) 변화를 real time PCR을 통해 확인하여, 바실러스 균주에 대한 식별 정보, 보다 구체적으로 바실러스 세레우스 및 바실러스 터린지엔시스의 유무에 관한 정보와 바실러스 세레우스 및 바실러스 터린지엔시스의 구별에 관한 정보를 제공하는 것일 수 있다.
상기 발색 변화를 확인하기 위한 발광물질은 당해분야에서 일반적으로 사용되는 것을 적용할 수 있으나, 바람직하게는 SybrGreen 또는 Evagreen 등을 사용하는 것이 가능하다. 상기 SybrGreen 또는 Evagreen 등은 DNA 이중가닥에 결합하고 이에 따라 실시간으로 증폭 수준 등에 대한 정보를 제공함으로써, 위 언급된 (c) 단계들에서 구별되는 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, PCR 산물 분석은 PCR 산물의 크기 분석을 포함하는 단편 분석(fragment analysis)를 수행하는 것 일 수 있다.
증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.
본 발명은 zmaR 증폭을 위한 프라이머 세트 및 chit 증폭을 위한 프라이머 세트를 포함한다. 본 발명에 따른 프라이머 세트들은 일부의 서열이 부가, 결실 또는 치환되더라도, 목적하는 유전자 부위의 일부 이상을 증폭 시킬 수 있다면, 해당 서열도 본 발명의 범위 내로 포함될 수 있다. 즉, 상기 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.
바람직하게, 본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 구성되는 zmaR 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 염기서열로 구성되는 chit 프라이머 세트를 포함한다.
본 발명은 zmaR 증폭을 위한 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트 및 chit 증폭을 위한 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 균주 구별용 조성물을 제공한다.
본 발명은 바람직하게, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 구성되는 zmaR 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 염기서열로 구성되는 chit 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 균주 구별용 조성물을 제공한다.
상기 바실러스 균주는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 바실러스 균주 구별용 조성물 및 증폭용 시약을 포함하는 바실러스 균주 구별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 구별용 키트는 실시간 중합효소 반응, 실시간 다중 중합 효소 반응 등을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 키트는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트와 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는, 검출 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 실시간 검출을 위해 형광시약인 SYBR GreenI로 염색될 수 있다. 또한, 이러한 형광 시약을 대신하여, 3' 말단 및/또는 5' 말단이 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED , HEX , TET, Cy5, MGB 및 BHQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광 표지인자로 표지될 수도 있다.
또한, 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다.
또한, 설명서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명에 따른 프라이머트 세트를 이용하면, 생화학적, 유전적으로 매우 유사하여 종래 생화학적인 방법으로 신속하고 정확하게 검출이 어려웠던 친환경 미생물 농약 균주인 바실러스 터린지엔시스와 식중독균인 바실러스 세레우스에 대하여, 검출능을 향상시키면서 빠르게 구별해 낼 수 있는 장점을 가진다. 더욱이 기타의 바실러스 균주들에 대한 구별도 함께 진행할 수 있기 때문에 보다 더 구체적이고 정확한 분석 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 3 및 4로 구성되는 chit 프라이머 세트를 이용하여 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)에 대해 Real-time PCR을 수행하고, 이의 멜팅 커브(melting curve)를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1 및 2로 구성되는 zmaR 프라이머 세트를 이용하여 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)에 대해 Real-time PCR을 수행하고, 이의 멜팅 커브(melting curve)를 나타낸 것이다.
실시예 1. 바실러스 세레우스 및 바실러스 터린지엔시스 구별용 프라이머 세트의 제조
미국 국립생물공학정보센터 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 데이터베이스에 등록된 바실러스 터린지엔시스아와 바실러스 세레우스의 서열을 분석 후에 다음 표 1의 유전자의 프라이머 서열을 제작하였다.
분류 서열
zmaR_Forward 5'- AGAACACCACATTGGAAGAC-3' (서열번호 1)
zmaR_Reverse 5'- TAAAGCTCGTCCCTCTTCA-3'(서열번호 2)
chit_Forward 5- TGACGGCATTTAAAAGTTCGG-3'(서열번호 3)
chit_Reverse 5'- ATTCACACTGCTATTACTAT-3'(서열번호 4)
본 발명에서는 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis)와 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 구별이 가능하게 하고 추가의 바실러스 균주와 차별성을 나타내게 할 수 있는 zwittermicin A-resistance (zmaR) 의 증폭을 위한 프라이머 세트와 바실러스 터린지엔시스와 바실러스 세레우스 외 다른 미생물을 구별하기 위한 chit유전자의 증폭을 위한 프라이머 세트를 구성하여, 프라이머 세트를 구성하였다.
실시예 2. Real-time PCR을 통한 바실러스 균주의 존재 확인
바실러스 균주의 구별을 위해서는 우선적으로 주로 목적하는 두 균주인 바실러스 세레우스 및 바실러스 터린지엔시스의 존재 여부를 확인할 필요가 있다.
이들 시료 내의 두 균주의 존재가 확인되는 경우 이들을 구별할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 균주를 보다더 구체적으로 구별할 필요가 있다.
바실러스 터린지엔시스, 바실러스 세레우스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리체니포르미스의 게놈 DNA를 추출하고 이후 SYBR green 기반 Real-time 반응법의 주형으로 사용하였다.
SYBR green 기반 chit 세트를 이용하여 바실러스 터린지엔시스와 바실러스 세레우스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리체니포르미스를 확인하는데 사용 가능한지를 보기 위하여 SYBR green 기반 Real-time PCR 조성물을 제조하였다. 이의 조성과 반응 조건은 하기 표와 같다.
내용물 조성 용량(㎕)
2x SYBR premix 10
chit_Forward(10 pmol/㎕) (서열번호 3) 1
chit_Reverse(10 pmol/㎕) (서열번호 4) 1
DNA 2
증류수 6
최종 용량 20
PCR 온도 조건은 95℃에서 10분간 실시 후 95℃ 10초, 55℃ 30초, 72℃ 30초를 1 cycle로 하여 총 50 cycle을 진행하였다. 65℃부터 95℃까지 0.5℃씩 올리면서 용해 곡선(melting curve)를 그렸다. 상기 실험 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 모두 81.5-82℃에서 단일 피크를 나타내어, chit를 통해 균주의 존재를 확인할 수 있음을 확인하였다.
반면, 바실러스 서브틸리스는 85.5 -86℃에서 단일 피크를 나타내었고, 바실러스 리체니포르미스는 86.5℃에서 단일 피크를 나타내어 각각 다른 피크를 나타냄을 확인할 수 있었다.
즉, 위 프라이머 세트를 이용하여 타 미생물 군에 의한 오차 또는 오류를 배제하고, 위 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 균주들의 존재를 확인할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. Real-time PCR을 통한 바실러스 균주의 구별
바실러스 터린지엔시스와 바실러스 세레우스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리체니포르미스의 게놈 DNA를 추출하고 이후 SYBR green 기반 Real-time 반응법의 주형으로 사용하였다.
SYBR green 기반 zmar 프라이머 세트를 이용하여 바실러스 터린지엔시스와 세레우스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리체니포르미스를 구별하는데 사용 가능한지를 확인하기 위하여 SYBR green 기반 Real-time PCR 조성물을 제조하였다. 이의 조성과 반응 조건은 하기 표와 같다.
내용물 조성 용량(㎕)
2x SYBR premix 10
zmaR_Forward(10 pmol/㎕) (서열번호 1) 1
zmaR_Reverse(10 pmol/㎕) (서열번호 2) 1
DNA 2
증류수 6
최종 용량 20
PCR 온도 조건은 95℃에서 10분간 실시 후 95℃ 10초, 55℃ 30초, 72℃ 30초를 1 cycle로 하여 총 49 cycle을 진행하였다. 65℃부터 95℃까지 0.5℃씩 올리면서 용해 곡선(melting curve)를 그렸다. 상기 실험 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 경우 84.5℃에서 단일 피크를 나타내었는 반면, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 경우 81.0 및 84.5℃에서 이중 피크를 나타내어, Real-time PCR을 통해 두 균주가 구별 가능하다는 것을 확인하였다.
또한, 바실러스 서브틸리스는 85.5 -86℃에서 단일 피크를 나타내었고, 바실러스 리체니포르미스는 84.5℃에서 단일 피크를 나타내어 각각 다른 피크를 나타냄을 확인할 수 있었다.
특히, 상기 실시예 2 및 3에서의 zmaR과 chit 프라이머를 사용하여 Real-time PCR법으로 바실러스 균주를 구별할 수 있었다. 즉, chit 프라이머와 zmar 프라이머를 사용한 PCR 후의 얻은 융해 곡선 분석 결과를 조합하여 바실러스 터린지엔시스, 바실러스 세레우스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리체니포르미스를 구별 가능함을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 프라이머 세트의 구성은 바실러스 터린지엔시스와 바실러스 세레우스의 존재 유무와 함께 이들을 명확히 구별해주고, 이와 함께 기타의 바실러스 균주들도 구별하게 해줌으로써, 다양한 바실러스 균주의 구별과 함께 검출이 가능한 결과를 제공함을 보여준다.
이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Chromach.co.,Ltd <120> Primer set for distinguishing of Bacillus species, and using thereof <130> 1 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zmaR_Forward <400> 1 agaacaccac attggaagac 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zmaR_Reverse <400> 2 taaagctcgt ccctcttca 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chit_Forward <400> 3 tgacggcatt taaaagttcg g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chit_Reverse <400> 4 attcacactg ctattactat 20

Claims (9)

  1. (a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와, zmaR 증폭을 위한 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트 및 chit 증폭을 위한 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물을 분석하여 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 식별하여 확인하는 단계;를 포함하는 바실러스 균주의 식별 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 zmaR 증폭을 위한 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트인, 바실러스 균주의 식별 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 chit 증폭을 위한 프라이머 세트는 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트인, 바실러스 균주의 식별 방법.
  4. 제1항에 있어서, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 실시간 중합 효소 연쇄반응인, 바실러스 균주의 식별 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (c) 상기 PCR 산물을 분석하여 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 식별하여 확인하는 단계;는 형광시약으로 SybrGreen 또는 Evagreen을 처리하여 실시간으로 확인하는 것인, 바실러스 균주의 식별 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 바실러스 균주의 식별은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식별인, 바실러스 균주의 식별 방법.
  7. zmaR 증폭을 위한 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트 및 chit 증폭을 위한 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 균주 구별용 조성물.
  8. 제7항의 조성물, 및 증폭용 시약을 포함하는 바실러스 균주 구별용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 키트는 실시간 다중 중합 효소 반응을 수행하기 위한 키트인, 바실러스 균주 구별용 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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