KR101570794B1

KR101570794B1 - 백강균 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101570794B1
Application number: KR1020130137745A
Authority: KR
Inventors: 성기호; 공원식; 전창성; 조재한
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-11-13
Filing date: 2013-11-13
Publication date: 2015-12-01
Also published as: KR20150055414A

Abstract

본 발명은 백강균 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 백강균에 포함되어 있는 바시아노리드 생합성 유전자(bassianolide biosynthetase gene)를 검출하여 짧은 시간에 정확하게 백강균을 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

백강균 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도{Specific primer set for determination of Beauveria bassiana, and use thereof}

동충하초를 포함하는 곤충병원성 곰팡이는 전세계적으로 약 100속 750 여종이 분포하는 것으로 알려져 있다. 그 중 완전세대, 즉 자실체를 형성하며 자낭균류(Ascomycetes)에 속하는 곤충병원성 곰팡이로는 코디셉스(Cordyceps)속, 시미즈오마이세스(Shimizuomyces)속, 토루비엘라(Torrubiella)속들을 포함하고, 동충하초라고 할 수 있는 대표적인 속들 중 하나가 코디셉스속이다. 완전세대에 더하여 불완전세대로서 대표적으로 코디셉스속에 속하는 것이 백강균(Beauveria bassiana)이다.

자실체를 형성하는 일부 코디셉스속 동충하초와 불완전균류인 백강잠(Beauveria bassiana)은 중국, 한국, 일본 등지에서 예로부터 훌륭한 한방제로 이용되어 왔고, 백강균은 미생물살충제로 의미를 갖는다. 백강균은 여러 종으로 구성된 다양한 종 복합체(species complex)인 것이 최근의 분류학적 연구에서 밝혀졌고, 상기 새로운 분류학 기반으로 인해 백강균을 구분할 수 있는 마커가 필요한 실정이다. 또한, 최근에는 생명공학의 발달로 백강균의 분자생물학적으로 종을 판별하는 방법에 관한 연구가 필요한 실정이다.

상대적으로 좁은 국토면적과 빈약한 부존자원을 지닌 우리나라에서는 세계적인 개방화 흐름에 적극적으로 대응할 수 있는 신자원의 개발이 국가 경쟁력을 극대화시키는 최선의 방안이며, 이 같은 측면에서 국내 자생의 유용곰팡이자원을 탐색, 발굴하여 자원화시키는 기술 개발의 중요성이 강조가 되고 있는 실정이다. 특히, 현재 국내외에서 연구가 부족한 백강균의 분자생물학적 분별방법을 실시함으로써 국내 동충하초자원의 분류를 용이하게 하는 것이 필요한 실정이다.

또한, 국내에서는 전통적으로 백강균이 감염된 누에인 백강잠이 전통적인 생약으로 이용되고 있어 백강균이 갖고 있는 많은 잠재력에 대한 연구가 집중되고 있다. 그러나, 실제로 백강균과 다른 곤충병원성 곰팡이를 판별하는 분자생물학적 방법 연구는 아직 미흡한 실정이다.

한편, 곤충병원성 곰팡이의 분류 전문가 및 지원 부족으로 국내 곤충병원성 곰팡이 자원 정보 및 분류체계 미흡한 실정이다. 따라서, 곤충병원성 곰팡이의 판별을 신속·정확하고 간단하게 판별할 수 있는 판별방법이 필요한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 백강균(Beauveria bassiana)과 다른 곤충병원성 곰팡이를 신속·정확하고 간단하게 판별할 수 있는 판별방법 및 상기 판별방법에서 사용되는 프라이머를 제공하려는 목적이 있다.

또한, 본 발명은 시료에 포함되어 있는 백강균의 함량을 정량적으로 분석할 수 있는 프로브를 제공하려는 목적이 있다.

본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 백강균 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 백강균 판별은 백강균에 포함되어 있는 바시아노리드 생합성 유전자(bassianolide biosynthetase gene)를 검출하여 수행하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 균주에서 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하는 단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로, 본 발명의 백강균 판별용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 수행으로 생성한 PCR 산물을 확인하는 단계;를 포함하는 백강균 판별방법을 제공한다.

나아가, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 백강균 판별용 프로브를 제공한다.

더불어, 본 발명의 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브;를 포함하는 백강균 판별을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 실시간 PCR(Real time polymerase chain reaction)일 수 있다.

게다가, 시료로부터 DNA를 추출하는 1단계; 추출한 DNA를 주형으로, 백강균 판별용 프라이머 세트 및 백강균 판별용 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하고 DNA에 대한 증폭 산물을 수득하는 2단계; 및 상기 DNA에 대한 증폭 산물의 양을 표준 정량곡선과 대비 및 환산하여 시료에 포함되어 있는 백강균의 양을 산출하는 3단계; 를 포함하는 백강균 정량 분석방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 백강균 판별용 프라이머 세트는 상술한 프라이머 세트이고, 상기 백강균 판별용 프로브는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브일 수 있다.

또한, 상술한 프라이머 세트를 포함하는 백강균 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 백강균 검출용 키트는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브를 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 용어를 설명한다.

본 발명에서 '프라이머'는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

또한, 본 발명에서 '프로브'는 상보적인 단일가닥 표적 서열과 혼성화하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 단일 가닥 핵산 서열을 말한다. 상기 포르브는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되거나, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding nonfluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제물질(Quencher)로 표지될 수 있다. 상기 프로브가 듀플렉스 RT-PCR에 사용되는 경우 각 프로브는 서로 다른 형광 표지인자로 표지하는 것이 바람직하다.

나아가, 본 발명의 '키트'란, 시료 내에서 검출 또는 정량하고자 하는 백강균을 대표하는 유전자의 복제 수를 RT-PCR로 확인하여 표적 균주의 절대 정량을 가능케 하는 도구를 의미한다. 본 발명에 따른 백강균 검출용 키트는, RT-PCR의 검량성 작성을 위한 표준시료로서 검출 또는 정량하고자 하는 균주를 대표하는 유전자에 특이적인 하나 이상의 프라이머 및/또는 프로브 부위를 포함하는 인위적 염기서열뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.

본 발명은 백강균과 다른 곤충병원성 곰팡이를 신속·정확하고 간단히 판별할 수 있는 판별방법 및 상기 판별방법에서 사용되는 프라이머를 제공하는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 시료에 포함되어 있는 백강균의 함량을 정량적으로 분석할 수 있는 프로브를 제공하는 효과를 갖는다.

도 1은 실시예 2에서 디자인한 프라이머 세트 및 프로브의 부위를 나타내는 그림이다.
도 2는 실시예 3에서 수행한 PCR 증폭 산물을 확인한 결과이다.
도 3은 실시예 4-2에서 작성한 실시간 PCR용 검량선이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 백강균과 다른 곤충병원성 곰팡이를 판별하는 분자생물학적 방법에 대한 연구가 미흡한 실정이고, 곤충병원성 곰팡이의 분류 전문가 및 지원 부족으로 국내 곤충병원성 곰팡이자원 정보 및 분류체계도 미흡한 문제점이 있었다.

이에 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 백강균 판별용 프라이머 세트를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 백강균과 다른 곤충병원성 곰팡이를 분자생물학적으로 신속하고 정확하며 간단하게 판별할 수 있다.

본 발명의 백강균 판별용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

상기 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 20 내지 40 bp의 길이일 수 있다. 상기 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 통상적으로 프라이머를 선별하기 위해 구축할 수 있는 라이브러리에서 얻은 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 백강균(Beauveria bassiana)의 DNA를 사용하여 구축된 염기서열 라이브러리로부터 얻은 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 백강균(Beauveria bassiana)의 바시아놀라이드 생합성 유전자(Bassianolide biosynthetase gene; BbBS)를 사용하여 구축된 염기서열 라이브러리로부터 얻은 것일 수 있다.

상기 프라이머 세트는 백강균과 다른 곤충병원성 곰팡이를 판별하는 효과를 가지며, 상기 판별은 백강균에 포함되어 있는 바시아노리드 생합성 유전자(bassianolide biosynthetase gene)를 검출하여 수행하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상술한 바와 같은 백강균 판별용 프라이머를 이용하여 백강균을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 백강균 판별방법은 균주에서 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하는 단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로, 상술한 바와 같은 백강균 판별용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 수행으로 생성한 PCR 산물을 확인하는 단계;를 포함한다.

먼저, 균주에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 설명한다.

상기 균주는 통상적으로 백강균인지 아닌지 판별이 필요한 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 통상적으로 판매 및/또는 증식한 균주를 사용할 수 있다.

상기 게놈 DNA 분리는 통상적으로 곰팡이 균에서 DNA를 분리하는데 사용되는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 균주를 액체 질소를 이용하여 분쇄한 후 분쇄한 균주를 CTAB buffer(Doyle and Doyle,1987)용액을 처리한 후 CTAB Rapid Genomic DNAIsolation 방법으로 처리하여 DNA를 분리할 수 있다.

다음으로, 상기 게놈 DNA를 주형으로, 상술한 바와 같은 백강균 판별용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계를 설명한다.

상기 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)은 특정 DNA 영역을 시험관 내에서 효소를 이용하여 원하는 부분을 증폭하는, 대표적인 핵산증폭기술(NAT) 중의 하나이다. 1985년 물리스(Mullis) 등에 의해 개발되었고, DNA 분자의 어느 부분이든지 그 경계 서열만 알면 이 방법을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 기본적으로 변성, 결합, 연장의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. PCR의 제 1단계는 주형 DNA를 단일쇄로 변성시킨다(변성단계). 제 2단계는 목적하는 영역을 사이에 두는 두 종류의 단일쇄 DNA에 결합시킨다(결합단계). 제 3단계는 프라이머로부터 고열에 내성인 DNA 폴리머라제에 의해 DNA를 합성하고 이상의 사이클을 20 내지 40회 반복할 수 있다.

상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 중합효소를 이용하여 표적 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 서열을 증폭하는 방법으로, PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수 있다.

또한, 상기 PCR을 수행으로 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 통상적으로 프라이머 표지 물질로 사용되는 것이라면, 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 브롬화에티디움(ethidium bromide) 또는 훽스트(Hoechst) 33258 염료를 사용할 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.

나아가, 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 PCR 조건은 통상적으로 곰팡이 균 DNA의 증폭에 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 결합 온도(어닐링 온도; annealing temperature)가 45 ~ 60 ℃의 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 48 ~ 55 ℃일 수 있다.

만약, 결합 온도가 45 ℃ 미만일 경우, 프라이머 세트가 표적 서열이 아닌 다른 부위에 결합하여 원하지 않는 DNA가 증폭되는 문제가 발생할 수 있으며, 결합온도가 60 ℃를 초과할 경우, 프라이머 세트가 표적 서열에 너무 약하게 결합하여 증폭된 DNA 산물의 양이 적은 문제가 발생할 수 있다.

더불어, 상기 PCR 수행으로 생성된 PCR 산물, 즉 증폭된 DNA의 크기는 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 130 ~ 200 염기쌍(베이스페어; base pair; bp)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 150 ~ 175 염기쌍일 수 있다.

다음, 상기 PCR 수행으로 생성한 PCR 산물을 확인하는 단계를 설명한다.

상기 PCR 산물을 확인하는 방법은 통상적으로 PCR 산물을 검출하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다.

상기 모세관 전기영동은 예를 들면, 에이비 시퀀서(ABi Sequencer)를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 상기 증폭 산물의 방사성을 측정할 수 있다.

게다가, 본 발명은 서열번호 3을 포함하는 백강균 판별용 프로브를 제공한다.

상기 프로브는 서열번호 3을 포함하는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 서열번호 3의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

상기 프로브의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프로브의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 40 bp의 길이일 수 있다. 프로브는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.

상기 프로브는 통상적으로 프로브를 선별하기 위해 구축할 수 있는 라이브러리에서 얻어진 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 백강균(Beauveria bassiana)의 DNA를 사용하여 구축된 염기서열 라이브러리로부터 얻어진 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 백강균(Beauveria bassiana)의 바시아놀라이드 생합성 유전자(Bassianolide biosynthetase gene; BbBS)를 사용하여 구축된 염기서열 라이브러리로부터 얻어진 것일 수 있다.

상기 프로브는 백강균을 정량적으로 판별할 수 있는 효과를 가지며, 상기 판별은 백강균에 포함되어 있는 바시아노리드 생합성 유전자(bassianolide biosynthetase gene)를 검출하여 수행하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상술한 바와 같은 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브;를 포함하는 백강균 정량 분석을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물을 제공한다.

상기 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction) 조성물은 시료에 포함된 백강균의 양을 정량 분석하기 위한 조성물로, 상기 조성물에는 본 발명에서 설계한 프라이머 및 프로브 이외에 역전사 반응과 중합반응을 수행하기 위한 당업계에 공지된 DNA 중합효소, 역전사효소, dNTP 및 반응 완충액을 더 포함할 수 있다. 나아가 필요한 경우 DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수도 있다.

상기 PCR은 일반적으로 증폭반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한, PCR을 이용한 일련의 반응을 의미하는 것으로, PCR에는 기준이 되는 표준시료를 사용하는 내부 표준법과, 증폭반응에 있어서 경쟁하는 분자를 사용하는 경쟁법이 포함될 수 있다. 또한, 각 서열의 분자 수를 정확하고 간편하게 결정하기 위해서 표준시료라고 불리는 기준이 되는 주형 DNA 서열을 이용한 PCR 방법을 사용하고, 반응 중 임의의 시점에서 반응의 진행상황, 즉 증폭의 정도를 확인한다. 따라서, 본 발명에서 'PCR'이란 증폭반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한 PCR로서, 반응 중 임의의 시점에서 증폭대상의 분자에 대해 증폭을 확인할 수 있는 PCR을 의미한다. 정량을 위해서는 일반적으로 그와 같은 PCR과, 반응 개시 시의 주형 DNA 분자 수와 그 증폭의 지표가 되는 신호를 관련짓는 검량선(檢量線)이 조합된다. 이 검량선은 분자 수가 알려진 표준시료를 이용하여 제작할 수 있다.

나아가, 상기 PCR은 통상적으로 시료에 포함되어 있는 주형 DNA의 양을 정량하기 위해 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 실시간 PCR일 수 있다.

더불어, 본 발명은 시료로부터 DNA를 추출하는 1단계; 추출한 DNA를 주형으로, 백강균 판별용 프라이머 세트 및 백강균 판별용 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하고 DNA에 대한 증폭 산물을 수득하는 2단계; 및 상기 DNA에 대한 증폭 산물의 양을 표준 정량곡선과 대비 및 환산하여 시료에 포함되어 있는 백강균의 양을 산출하는 3단계; 를 포함하는 백강균 정량 분석방법을 제공한다.

먼저, 시료로부터 DNA를 추출하는 1단계를 설명한다.

상기 시료는 통상적으로 백강균인지 아닌지 판별이 필요한 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 통상적으로 판매 및/또는 증식한 시료를 사용할 수 있다.

DNA 추출은 통상적으로 곰팡이 균에서 DNA를 분리하는데 사용되는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 균주를 액체질소에 침지하여 미세한 분말가루 형태로 마쇄한 후 CTAB Buffer로 처리한 후 CTAB Rapid Genomic DNA Isolation하는 방법으로 DNA를 추출할 수 있다.

다음으로, 추출한 DNA를 주형으로, 백강균 판별용 프라이머 세트 및 백강균 판별용 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하고 2단계를 설명한다.

상기 실시간 PCR은 통상적으로 시료에 포함되어 있는 주형 DNA의 양을 정량하기 위해 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않는다.

다음, 상기 DNA에 대한 증폭 산물의 양을 표준 정량곡선과 대비 및 환산하여 시료에 포함되어 있는 백강균의 양을 산출하는 3단계를 설명한다.

상기 DNA에 대한 증폭 산물의 양은 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여 확인할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭산물을 비특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다.

본 발명에 사용 가능한 실시간 PCR 장치는 통상적으로 실시간 PCR 수행시 사용할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 예를 들면 AB 사의 실시간 PCR 기기 7900, 7500, 7300, Stratagene사의 Mx3000p, 및 BioRad 사의 Chromo 4 기기 등을 사용할 수 있다. PCR 종료시 이러한 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 산물의 프로브에 표지된 형광표지 인자를 감지하여 피크를 구현한다. 이에, 전기영동과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다.

상기 표준 정량곡선은 분자 수가 알려진 표준시료를 이용하여 제작할 수 있다.

게다가, 상기 백강균 판별용 프라이머 세트는 본 발명의 프라이머 세트를 사용할 수 있으며, 상기 백강균 판별용 프로브는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 백강균 판별용 프라이머 세트를 포함하는 백강균 검출용 키트를 제공한다.

상기 백강균 검출용 키트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

나아가, 상기 백강균 검출용 키트는 서열번호 3의 염기서열을 더 포함할 수 있으며, 서열번호 3의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

더불어, 본 발명의 백강균 검출용 키트는 상기 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 키트 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 상기 키트 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함될 수 있다.

상기 적합한 담체로는 통상적으로 PCR에 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 예를 들면, 가용성 담체, 불용성 담체 등을 포함할 수 있다.

상기 가용성 담체는 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS를 사용할 수 있으며, 상기 불용성 담체는 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[ 실시예 ]

실시예 1. DNA 추출

본 발명에서 이용한 백강균은 머쉬텍(Mushtech)에서 분양받은 C101, C103, C1002 및 C1046(학명: Cordyceps bassiana) 균주를 사용하였다.

상기 균주를 화염소독한 핀을 활용하여 감염된 기주 곤충으로부터 포자분리 배양 후 현미경 Zeiss dissecting microscope Stemi SV11(Zeiss, West Germany)을 이용하여 단포자를 분리하였다. 상기 단포자는 25 ℃, 암조건의 SDAY(Sabouraud-dextrose-yeast extract) 배지에서 72 시간 동안 정체 배양하여 증식시켰다. 상기 증식으로 수득한 균사체는 액체 질소로 급랭시켜 막자사발을 이용하여 분말상태가 되도록 마쇄한 후 CTAB Buffer(Doyle and Doyle, 1987)용액을 처리한 후 CTAB Rapid Genomic DNA Isolation을 사용하여 프로토콜대로 DNA를 추출하였다.

상술한 바와 같이, 추출한 DNA는 Nanodrop(미국 소재 서모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사 제품) 기기를 이용하여 농도를 측정하였으며, DNA 각각의 최종농도는 멸균된 증류수를 이용하여 83.3 ng/㎕로 조정하였다.

실시예 2. 프라이머 세트 디자인

백강균 유전자의 염기서열을 분석하여 본 발명에 이용하기에 가장 적합한 프라이머를 선정하여, 백강균 유전체에 존재하는 바시아놀라이드 생합성 유전자(Bassianolide biosynthetase gene; BbBS)를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트 및 프로브를 제조하였다. 상기 프라이머 세트 및 프로브의 염기서열 부위는 도면 1에 나타내었다.

본 발명의 바람직한 프라이머 세트는 BbBs로 명명하고 서열번호 1 및 서열번호 2로 나타냈으며, 하기 표 1에 나타냈다. 또한, 본 발명의 바람직한 프로브는 Probe_BbBs로 명명하고 서열번호 3으로 나타냈으며, 하기 표 1에 나타냈다.

이름	Sequence(5'→3')
BbBs	ATTTTTACTCGAGGTTCTAACTACCTTGATTC	서열번호 1
BbBs	CCTCTGGTTTCATTGTCGTCATGTA	서열번호 2
Probe_BbBs	GGATTTATACGACAAAGCCAGATCAAC	서열번호 3

비교예 1.

한국농업미생물자원센터에서 분양받은 KACC 47484(Beauveria pseudobassiana 균)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 DNA를 추출하였다.

비교예 2.

한국농업미생물자원센터에서 분양받은 KACC 47481(Beauveria sungii 균)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 DNA를 추출하였다.

비교예 3.

한국농업미생물자원센터에서 분양받은 KACC 43316(Cordyceps militaris 균) 및 동충하초은행에서 분양받은 EFCC 10304(Cordyceps militaris 균)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 DNA를 추출하였다.

비교예 4.

한국농업미생물자원센터에서 분양받은 KACC 44470(Cordyceps pruinosa 균을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 DNA를 추출하였다.

비교예 5.

한국농업미생물자원센터에서 분양받은 KACC 47485(Isaria tenuipes 균)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 DNA를 추출하였다.

비교예 6.

한국농업미생물자원센터에서 분양받은 KACC 47486(Isaria farinosa 균)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 DNA를 추출하였다.

실시예 3. 중합효소연쇄반응 ( PCR ) 수행

상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 6에서 추출한 DNA로부터 중합효소연쇄반응(PCR)을 Eppendorf thermal cycler(에펜도르프(Eppendorf)사 제품)으로 수행하였다.

PCR 반응액의 총 부피는 20 ㎕로서, 1 ㎕의 실시예 1 및 비교예 1 내지 6 중 어느 하나의 DNA, 10 pmole의 실시예 2에서 디자인한 프라이머 세트 및 증류수(distilled water; DW) 1 ㎕를 혼합하여 제조하였다.

또한, PCR 반응은 94 ℃에서 2분 동안 초기 변성(pre-denaturation)과정을 수행한 후, 92 ℃에서 30초, 50 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초로 구성된 증폭(amplifying) 과정을 35 회 반복 수행하였고, 마지막 단계인 마지막 증폭(final extension) 과정은 72 ℃에서 2분 동안 진행하였다.

상기 PCR 반응으로 증폭된 DNA 산물은 2% 아가로스 겔(agarose gel)에서 180 V로 전기 영동한 후, 브롬화 에티디움(EtBr; Ethidium Bromide)으로 염색하여 UV-illuminator에서 밴드(band)를 확인한 후 현상을 사진으로 기록하였다. 상기 PCR 반응으로 수득한 DNA 산물 band 사진은 도면 2에 나타내었다.

도면 2의 M1 및 M2는 사이즈 마커(Size marker; Bioneer사, 제품명: D-1050, 0.6 ㎕/㎖), 1번 레인 내지 7번 레인은 Beauveria bassiana 균주들이고, 1번 레인은 C101이고, 2번 레인은 C103이고, 3번 레인은 C1002이고, 4번 레인은 C1046이고, 6번 레인은 비교예 1의 Beauveria pseudobassiana 균, 7번 레인은 비교예 2의 Beauveria sungii 균, 8번 레인은 비교예 3의 Cordyceps militaris 균, 9번 레인은 비교예 4의 Cordyceps pruinosa 균, 10번 레인은 비교예 5의 Isaria tenuipes 균, 11번 레인은 비교예 6의 Isaria farinosa 균, C는 멸균증류수(3DW)를 넣은 대조구를 나타냈다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, BbBs 프라이머 세트는 백강균(Beauveria bassiana)인 1번 내지 5번 레인에서 165bp의 DNA 단편이 확인되어 백강균 균주를 명확하게 판별할 수 있었다. 또한, 상기 프라이머 세트는 백강균을 제외한 다른 곤충병원성진균들을 증폭시키지 않아 백강균에 특이적인 프라이머인 것을 확인할 수 있었다.

이로 인해, 본원 발명의 프라이머 세트는 백강균과 다른 곤충병원성 곰팡이를 정확하게 구분하여 백강균을 판별할 수 있는 효과를 알 수 있었다.

실시예 4.백강균의 정량분석

실시예 4-1: 유전자 클로닝

상기 실시예 3에서 수득한 165bp의 증폭 산물을 pGEM-T easy vector에 제작사의 실험방법에 의거하여 클로닝하였다. 클로닝한 증폭 산물을 37℃에서 24 시간 동안 배양한 후 PureHelix™ Fast-nPure Plasmid Kit(ver2.0)를 이용하여 플라스미드 DNA 추출을 하였다. 이후, 추출한 플라스미드 DNA는 M13 프라이머(pGEM-T_M13F(5'-CAG GCT TTT CCC AGT CAC G-3') 및 pGEM-T_M13R(5'-TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C-3'))를 이용한 염기서열 분석 결과 모든 염기서열이 오차 없이 증폭되어 상기 165bp의 증폭 산물이 BbBS 유전자의 한 부분임을 확인하였다.

실시예 4-2: 실시간 PCR 용 검량선 작성

상기 실시예 1에서 추출한 DNA를 83.3 ng, 27.8 ng, 9.3 ng, 3.1 ng, 0.3 ng, 0.1 ng, 0.03 ng 또는 0.01 ng을 첨가한 것을 제외하고는 실시예 3의 PCR 반응액 제조와 동일한 방법으로 여러 농도의 PCR 반응액을 제조하였다.

또한, 상기 여러 농도의 PCR 반응액을 이용하여 Light Cycler R 450 Software(Roche사 제품)을 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 상기 실시간 PCR 반응은 95 ℃에서 10초, 95 ℃에서 10초, 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1초로 구성된 증폭(amplifying) 과정을 45 회 반복 수행하였다.

상기 실시간 PCR 반응 결과로 수득한 검량선은 MicroSoft Exel 2007 프로그램을 이용하여 작성하였으며 도면 3에 나타내었다.

상기 실시예 및 실험예를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 프라이머 세트는 백강균과 다른 곤충병원성 곰팡이를 신속·정확하고 간단히 판별할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 DNA 단편의 증폭 크기를 효과적으로 줄인 프라이머 세트를 제공하여 백강균을 대상으로 단위시간당 처리 능력이 향상된 백강균 판별방법을 제공할 수 있다. 나아가, 본 발명은 백강균의 정량분석에 적합하며, 백강균의 바시아놀라이드 생합성 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 프로브를 제공할 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT:RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Specific primer set for determination of Beauveria bassiana, and use thereof <130> 1040102 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Beauveria bassiana <400> 1 atttttactc gaggttctaa ctaccttgat tc 32 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Beauveria bassiana <400> 2 cctctggttt cattgtcgtc atgta 25 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Beauveria bassiana <400> 3 ggatttatac gacaaagcca gatcaac 27

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 백강균 판별용 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 상기 백강균 판별은 백강균에 포함되어 있는 바시아노리드 생합성 유전자(bassianolide biosynthetase gene)를 검출하여 수행하는 것을 특징으로 하는 백강균 판별용 프라이머 세트.
균주에서 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하는 단계;
상기 게놈 DNA를 주형으로, 제1항 또는 제2항의 백강균 판별용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
상기 PCR 수행으로 생성한 PCR 산물을 확인하는 단계;
를 포함하는 백강균 판별방법.
삭제
제1항 또는 제2항의 프라이머 세트; 및
서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브;
를 포함하는 백강균 판별을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 PCR은 실시간 PCR(Real time polymerase chain reaction)인 것을 특징으로 하는 백강균 판별을 위한 PCR용 조성물.
삭제
시료로부터 DNA를 추출하는 1단계;
추출한 DNA를 주형으로, 백강균 판별용 프라이머 세트 및 백강균 판별용 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하고 DNA에 대한 증폭 산물을 수득하는 2단계; 및
상기 DNA에 대한 증폭 산물의 양을 표준 정량곡선과 대비 및 환산하여 시료에 포함되어 있는 백강균의 양을 산출하는 3단계;를 포함하며,
상기 백강균 판별용 프라이머 세트는 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트이고, 상기 백강균 판별용 프로브는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브인 것을 특징으로 하는 백강균 정량 분석방법.
제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 포함하는 백강균 검출용 키트.
제9항에 있어서, 상기 백강균 검출용 키트는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백강균 검출용 키트.