CN105331688B - 一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr检测方法及其检测试剂盒 - Google Patents

一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr检测方法及其检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105331688B
CN105331688B CN201510695010.6A CN201510695010A CN105331688B CN 105331688 B CN105331688 B CN 105331688B CN 201510695010 A CN201510695010 A CN 201510695010A CN 105331688 B CN105331688 B CN 105331688B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
primer
sequence
forward primer
reverse primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510695010.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105331688A (zh
Inventor
胡文忠
何煜波
姜爱丽
冯可
刘星伯
郎秋蕾
方超
梁洪
钱刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Lianchuan Biotechnology Co ltd
Dalian Minzu University
Original Assignee
HANGZHOU LC BIOTECH Co Ltd
Dalian Nationalities University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HANGZHOU LC BIOTECH Co Ltd, Dalian Nationalities University filed Critical HANGZHOU LC BIOTECH Co Ltd
Priority to CN201510695010.6A priority Critical patent/CN105331688B/zh
Publication of CN105331688A publication Critical patent/CN105331688A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105331688B publication Critical patent/CN105331688B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测方法及其检测试剂盒，提取样品增菌液DNA模板，以5对引物对提取的DNA模板进行五重PCR反应，在五重PCR反应过程中加入荧光标记分子，得到的携带荧光标记PCR产物与基因芯片上合成的杂交探针进行杂交反应，清洗后，通过扫描芯片上的荧光信号即可快速检测致病菌。本发明结合多重PCR技术和基因芯片技术，可同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O‑157和单核细胞增生李斯特菌等5种致病菌，该方法具有准确性高，灵敏度高，特异性强，高效快速等优点。

Description

一种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测方法及其检测 试剂盒
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，特别涉及一种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测方法。
背景技术
鲜活农产品是我国消费者除粮食外最主要的食物营养来源，在日常生活中占据着举足轻重的位置。鲜活农产品在原料，加工，储藏，运输过程中容易受到多种病原微生物(主要是细菌和真菌)的侵染。因微生物侵染产生的病害发生后的交叉感染会造成果蔬的大量损失，失去商品价值，极大地限制了果蔬产业的发展。同时被各种病原微生物污染的鲜活农产品一旦被消费者购买、食用会造成食物中毒，疾病传播等严重后果，危害食品安全，给消费者的身体健康和生命安全带来巨大威胁。
基因芯片检测微生物的基本原理是在芯片表面合成待检验微生物的特异性核酸探针，微生物样品DNA经荧光标记PCR扩增，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。与传统的检测方法(细菌培养、生化鉴定、血清分型等)相比，基因芯片技术的先进性主要体现在：①基因芯片可以实现微生物的高通量和并行检测，一次实验即可得出全部结果；②操作简便快速，整个检测只需24h基本可以出结果(而传统方法一般需4～7d)；③特异性强，敏感性高。
多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。采用这一技术可同时扩增多种病原微生物特异核酸序列，可大大提高病原微生物的检测效率。目前同时对食品或食源性疾病多种病原菌进行分子诊断时常常采用多重PCR方法，因为该方法可同时检测3～4种病原菌，既提高检测速度降又降低了检验成本，由此得到广泛应用。但传统的多重PCR体系中，由于存在多对引物，引物之间的干扰以及引物与模板的错配而造成灵敏度下降与非特异性扩增反应增加等问题，制约多重PCR技术的发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测方法，结合多重PCR技术和基因芯片技术，可同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O-157和单核细胞增生李斯特菌等5种致病菌，该方法具有准确性高，灵敏度高，特异性强，高效快速等优点。
本发明还提供了检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测试剂盒。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测方法，提取样品增菌液DNA模板，以5对引物对提取的DNA模板进行五重PCR反应，在五重PCR反应过程中加入荧光标记分子，得到的携带荧光标记PCR产物与基因芯片上合成的杂交探针进行杂交反应，清洗后，通过扫描芯片上的荧光信号即可快速检测致病菌；
5对引物对分别为：
沙门氏菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.1所示，沙门氏菌反向引物序列信息见SEQ ID No.2所示；
金黄色葡萄球菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.3所示，金黄色葡萄球菌反向引物序列信息见SEQ ID No.4所示；
大肠杆菌O-157正向引物，序列信息见SEQ ID No.5所示，大肠杆菌O-157反向引物序列信息见SEQ ID No.6所示；
副溶血弧菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.7所示，副溶血弧菌反向引物序列信息见SEQ ID No.8所示；
单核细胞增生李斯特菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.9所示，单核细胞增生李斯特菌反向引物序列信息见SEQ ID No.10所示。
本发明针对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O-157和单核细胞增生李斯特菌，筛选出各个菌种种间特异性强同时种内保守性强的基因区段设计引物。引物特异性强，本发明特定设计的5对引物对，引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。
作为优选，五重PCR反应体系以总体积50μL计，其组成如下：
10×Ex Taq buffer 10μL，
dATP 1.0μL，
dTTP 1.0μL，
dGTP 1.0μL，
dCTP 0.75μL，
cy3-dCTP 2.0μL，
引物混合物 5.0μL，
DNA模板 20ng或10ng，
Ex Taq酶 0.5μL，
ddH2O 补足至50μL。
本发明在反应体系中掺入一定比例的cy3-dCTP是为了在PCR产物中渗入荧光素，在后续的杂交反应中，如果带有荧光素的PCR产物与芯片上的探针成功杂交，则在杂交清洗完毕后，以扫描仪对芯片进行扫描时(扫描波长根据染料进行选择，比如cy3采用532nm)成功杂交的探针位置会发荧光，从而可以得知样品中是否存在探针对应的细菌。
作为优选，dATP、dTTP、dGTP及dCTP浓度均为2.5mmol/L，cy3-dCTP浓度为1nmol/μL，Ex Taq酶浓度为5U/μL。
作为优选，所述引物混合物的由以下浓度为20mmol/L的各引物混合而成：
沙门氏菌正向引物19μL，沙门氏菌反向引物19μL；
金黄色葡萄球菌正向引物20μL，金黄色葡萄球菌反向引物20μL；
大肠杆菌O-157正向引物7.3μL，大肠杆菌O-157反向引物7.3μL；
副溶血弧菌正向引物20μL，副溶血弧菌反向引物20μL；
单核细胞增生李斯特菌正向引物20μL，单核细胞增生李斯特菌反向引物20μL。
作为优选，五重PCR反应的条件为：95℃预变性2min，95℃30sec；55℃30sec；72℃30sec；35个循环，72℃补充延伸10min；4℃保持。
作为优选，清洗温度为40℃。清洗芯片温度确定为40摄氏度来降低芯片总体的背景值，相对提高探针杂交的特异性。
作为优选，针对沙门氏菌的探针有20个，序列见SEQ ID No.132～151所示；针对金黄色葡萄球菌的探针有24个，序列见SEQ ID No.108～131所示；针对大肠杆菌O-157的探针有25个，序列见SEQ ID No.11～35所示；针对副溶血弧菌的探针有46个，序列见SEQ IDNo.62～107所示；针对单核细胞增生李斯特菌的探针有26个，序列见SEQ ID No.36～61所示。
一种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测试剂盒，包括五重PCR反应体系，所述五重PCR反应体系以总体积50μL计，其组成如下：
10×Ex Taq buffer 10μL，
dATP 1.0μL，
dTTP 1.0μL，
dGTP 1.0μL，
dCTP 0.75μL，
cy3-dCTP 2.0μL，
引物混合物 5.0μL，
DNA模板 20ng或10ng，
Ex Taq酶 0.5μL，
ddH2O 补足至50μL。
作为优选，dATP、dTTP、dGTP及dCTP浓度均为2.5mmol/L，cy3-dCTP浓度为1nmol/μL，Ex Taq酶浓度为5U/μL。
作为优选，所述引物混合物的由以下浓度为20mmol/L的各引物混合而成：
沙门氏菌正向引物19μL，沙门氏菌反向引物19μL；
金黄色葡萄球菌正向引物20μL，金黄色葡萄球菌反向引物20μL；
大肠杆菌O-157正向引物7.3μL，大肠杆菌O-157反向引物7.3μL；
副溶血弧菌正向引物20μL，副溶血弧菌反向引物20μL；
单核细胞增生李斯特菌正向引物20μL，单核细胞增生李斯特菌反向引物20μL；
沙门氏菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.1所示，沙门氏菌反向引物序列信息见SEQ ID No.2所示；金黄色葡萄球菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.3所示，金黄色葡萄球菌反向引物序列信息见SEQ ID No.4所示；大肠杆菌O-157正向引物，序列信息见SEQ IDNo.5所示，大肠杆菌O-157反向引物序列信息见SEQ ID No.6所示；副溶血弧菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.7所示，副溶血弧菌反向引物序列信息见SEQ ID No.8所示；单核细胞增生李斯特菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.9所示，单核细胞增生李斯特菌反向引物序列信息见SEQ ID No.10所示。
本发明的有益效果是：本发明结合多重PCR技术和基因芯片技术，可同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O-157和单核细胞增生李斯特菌等5种致病菌，该方法具有准确性高，灵敏度高，特异性强，高效快速等优点
附图说明
图1是荧光多重PCR验证结果图；图中：1、五种菌混合，2、副溶血弧菌(理论扩增长度440bp)3、沙门氏菌(理论扩增长度932bp)，4、金黄色葡萄球菌(理论扩增长度547bp)，5、单核细胞增生李斯特菌(理论扩增长度958bp)，6、大肠杆菌O-157(理论扩增长度350bp)，L、Marker。
图2是沙门氏菌荧光多重PCR产物杂交结果图。
图3是金黄色葡萄球菌荧光多重PCR产物杂交结果图。
图4是大肠杆菌O-157荧光多重PCR产物杂交结果图。
图5是副溶血弧菌荧光多重PCR产物杂交结果图。
图6是单核细胞增生李斯特菌荧光多重PCR产物杂交结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
仪器和试剂
仪器
梯度PCR仪器(MG96G杭州朗基)，电泳仪(EPS-1001上海天能)，凝胶成像系统(TAN-2500天能)，微量分光光度计(ASP-3700ATCGene)，扫描仪(GenePix 4000B MolecularDevices)。
试剂(市售)
Ex Taq(TaKaRa RR001A)
Deoxynucleotide(dNTP)Solution Set(NEB N0446S)
CY3-DCTP(GE Healthcare PA53021)
LCS_beads(LC Sciences)
20×SSPE(Ambion AM9767)
SDS(Sigma L-5750)
100×BSA(NEB B9001S)
EDTA(Shanghai Zeheng CSJ6088-500G Amresco分装)
Nuclease-free water(Qiagen 129117)
Formamide(HCONH2)(Amresco 4660C97)
Hybridization buffer(杂交液HB)：6×SSPE，25％Formamide(N-甲酰脱乙酰秋水仙碱)，PH6.6to 6.8
Wash buffer(洗液WB)：500μL HB，500μL H2O，20μL 10％SDS，注意，Wash buffer要现配现用。
100×heat-treated BSA：100×BSA(10mg/ml)60℃孵育30min降至室温。以0.2μm滤膜过滤后存储于-20℃备用。
Blocking buffer(封闭液BSA)：153μL HB，2μL of 100×heat-treated BSA*
Stripping buffer(解吸缓冲液SP)0.3mM EDTA，50％Formamide(N-甲酰脱乙酰秋水仙碱)pH＝6.63。
实施例：
1、引物设计
从NCBI数据库下载了5种病原菌132株系基因组，在每个菌种中选出1个株系基因组序列，将选出的基因组序列用BLAT软件进行两两比对，找出任意两个基因组之间的相似序列，对每一个菌种基因组，根据得到的各个有相似性比对结果的序列区间，做一个互补取反操作，得到特异于该菌种的序列区间。这一步的目的是初步筛选，缩小筛选范围。将这些筛选出来的区段在NCBI数据库上进行手工blast比对，筛选出种特异的基因区段。筛选得到的种特异基因区段再进行种内的alignment，最终找到在待检病原菌的基因序列中种内同源性＞95％，种间同源性＜75％的基因序列区段(各个菌种种间特异性强同时种内保守性强的基因区段)。作为引物探针设计的基础。
各菌种筛选出的备用序列所在基因见表1：
表1
菌种 筛选出的备用序列所在基因
沙门氏菌(Salmonella) hila
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) SasH
大肠杆菌O-157(O：157Escherichia coli) O antigen polymerase
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) DNA internalization-related competence protein ComEC/Rec2
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) hly
根据筛选出的序列设计多重PCR引物，引物合成委托生物公司完成，引物序列见表2：
表2
2、病原菌定量菌液的制备
将上述病原菌的标准菌株培养至对数期，通过LB琼脂平板计数测得每mL菌落数，将菌样分别用生理盐水进行10倍连续稀释至10-8CFU/mL。
3、病原菌基因组DNA提取：
取2步定量细菌悬液1mL放入1.5mL eppendof管，15000rpm高速离心5min，倒去上清，以细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技DP302)进行DNA提取，得到的DNA溶液，定量后作为DNA模板使用。
4、荧光多重PCR
10×Ex Taq buffer 10μL，
dATP(2.5mmol/L) 1.0μL，
dTTP(2.5mmol/L) 1.0μL，
dGTP(2.5mmol/L) 1.0μL，
dCTP(2.5mmol/L) 0.75μL，
cy3-dCTP(1nmol/μL) 2.0μL，
引物混合物 5.0μL，
DNA模板 20ng或10ng，
Ex Taq酶(5U/μL) 0.5μL，
ddH2O 补足至50μL。
引物混合物的配制：各个引物稀释至20mM，按照表3配制引物混合物：
表3
PCR扩增程序
在反应体系中掺入一定比例的cy3-dCTP是为了在PCR产物中渗入荧光素，在后续的杂交反应中，如果带有荧光素的PCR产物与芯片上的探针成功杂交，则在杂交清洗完毕后，以扫描仪对芯片进行扫描时(扫描波长根据染料进行选择，比如cy3采用532nm，)成功杂交的探针位置会发荧光，从而可以得知样品中是否存在探针对应的细菌。
荧光多重PCR验证结果见图1，结果可见，多重扩增效果良好，混合模板扩增中沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌扩增产物长度相差过小，无法用电泳进行分辨，但可在下一步芯片杂交中进行确认。
5、芯片探针设计
针对各个菌种的多重PCR产物序列进行探针设计，芯片探针序列见表4：
表4
芯片探针排布：五种病原菌检测探针单次重复构成一个16×10的亚阵列，16×10的亚阵列共九个，这九个亚阵列以3行空白为间隔，构成一个大阵列。与大阵列间隔3行空白另有一个五种病原菌检测探针单次重复构成的一个6×30的亚阵列。
6、多重PCR产物纯化和荧光渗入密度计算
荧光掺入多重PCR产物以LCS_beads磁珠进行纯化，去除多余的引物和杂质后，以ASP-3700微量分光光度计进行测量260nm和550nm吸光值以确定荧光渗入密度。荧光渗入密度的计算：
荧光掺入密度(FOI)＝(A/E)×10×106×【324.5/(吸光值260nm×50)】
FOI在20-50最适宜杂交。A＝cy3在550nm的吸光值。E＝消光系数：cy3＝150000。
产物荧光掺入情况：
荧光多重PCR产物 A260 A550 FOI
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) 0.012 0.241 21.54356846
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 0.02 0.255 33.93464052
大肠杆菌O-157(O：157Escherichia coli) 0.02 0.333 25.98598599
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 0.015 0.215 30.18604651
沙门氏菌(Salmonella) 0.009 0.182 21.3956044
各个样品均达到杂交标准。
7、芯片杂交和扫描
7.1芯片杂交流程
A清洗系统
连接通路，换上废旧芯片，用以下溶液进行清洗系统：
(1)1ml于95℃预热的1％SDS，在最高速下循环清洗20min；
(2)排除1％SDS于废液管后，用3ml Nuclease-free water(无核酸酶水)进行清洗；
(3)1ml于95℃预热的Nuclease-free water，在最高速下循环清洗5-6min；
(4)排除Nuclease-free water于废液管后，用3ml Nuclease-free water进行清洗。
B芯片清洗
(1)更换新的芯片，用1ml Stripping buffer(解吸缓冲液SP)于结合速度下循环清洗20min(注意转换进液方向以排除芯片中气泡)；
Stripping buffer成分：0.3mM EDTA，50％Formamide.PH 6.6to 6.8，该缓冲液可以清洗掉已经杂交在探针上的核酸序列。
(2)扫描仪对清洗后的芯片进行扫描。
备注：以上系统清洗和芯片清洗过程中芯片台座温度均为40℃。
这一步骤是为了将芯片上可能存在的杂质以及可能杂交上的核酸序列清洗掉，得到比较干净均一的背景，准备杂交。
C样本杂交
(1)1ml Hybridization buffer(杂交液HB)于结合速度(500μl/min)下循环清洗10min；Hybridization buffer(杂交液HB)成分：6×SSPE，25％Formamide，PH 6.6to 6.8，Hybridization buffer(杂交液HB)为杂交反应提供一个适宜的PH环境和盐离子浓度，其中的Formamide可以降低DNA双链的Tm值，使样品在30℃时进行杂交反应。
(2)1ml Blocking buffer(封闭液BSA)于结合速度下循环清洗5-6min；
Blocking buffer(封闭液BSA)：148μL HB，2μL of 100×heat-treated BSA，该缓冲液中的BSA可以封闭芯片上无探针部分，以降低芯片背景信号。
(3)杂交样品制备：200ng纯化后的多重PCR产物+等体积Hybridization buffer(杂交液HB，最终体积50ul)，95℃变性5min后迅速置于冰上3min，将制备的样本加入到Blocking buffer中，混匀后于于结合速度下循环运行16hrs进行杂交。
设定杂交时间为16h是为了使杂交反应时间足够长，达到反应平衡，实际操作中可以适当调整。
备注：样本杂交过程芯片台座温度为40℃。
D杂交后清洗
(1)1ml Hybridization buffer(杂交液HB)于清洗速度(100μl/min)下循环清洗20min(芯片台座温度32℃)；
(2)1ml Wash buffer(洗液WB)于清洗速度下，在40℃下循环清洗20min。
Wash buffer(洗液WB)：500μL HB，500μL Nuclease-free water，20μL 10％SDS，注意，Wash buffer要现配现用。
E芯片扫描
根据GenePix 4000B的说明设定相关的光电倍增管(PMT＝300-400)、聚焦距离(focal position＝100-150)和扫描波长(532nM)等对芯片进行扫描。
7.2各个菌种荧光多重PCR产物杂交实验
将各个菌种荧光多重PCR产物纯化测定FOI值后，与芯片进行杂交反应。
各个菌种荧光多重PCR产物杂交结果见下图2-6。
8、方法现场验证
随机选择50份日常检测样本，以出入境行业标准检测方法(SN/T)和本发明的检测方法对上述5种病原菌作平行检测，并以SN/T检测方法的检测结果为标准来验证基因芯片检测的特异性与灵敏度。行业标准检测方法编号为：大肠杆菌O157(SN/T 1059.5-2006)，沙门氏菌(SN/T T0170-2010)，金黄色葡萄球菌(SN/T 0172-2010)，单核细胞增生李斯特菌(GB/T 4789.30-2010)。
结果，随机选择50份日常检测样本，以出入境行业标准检测方法(SN/T)和本发明的检测方法对上述5种病原菌平行检测结果一致，未见假阳性与假阴性结果。
一种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测试剂盒，包括五重PCR反应体系，所述五重PCR反应体系以总体积50μL计，其组成如下：
10×Ex Taq buffer 10μL，
dATP(2.5mmol/L) 1.0μL，
dTTP(2.5mmol/L) 1.0μL，
dGTP(2.5mmol/L) 1.0μL，
dCTP(2.5mmol/L) 0.75μL，
cy3-dCTP(1nmol/μL) 2.0μL，
引物混合物 5.0μL，
DNA模板 20ng或10ng，
Ex Taq酶(5U/μL) 0.5μL，
ddH2O补足至50μL。
所述引物混合物的由以下浓度为20mmol/L的各引物混合而成：
沙门氏菌正向引物19μL，沙门氏菌反向引物19μL；
金黄色葡萄球菌正向引物20μL，金黄色葡萄球菌反向引物20μL；
大肠杆菌O-157正向引物7.3μL，大肠杆菌O-157反向引物7.3μL；
副溶血弧菌正向引物20μL，副溶血弧菌反向引物20μL；
单核细胞增生李斯特菌正向引物20μL，单核细胞增生李斯特菌反向引物20μL；
沙门氏菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.1所示，沙门氏菌反向引物序列信息见SEQ ID No.2所示；金黄色葡萄球菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.3所示，金黄色葡萄球菌反向引物序列信息见SEQ ID No.4所示；大肠杆菌O-157正向引物，序列信息见SEQ IDNo.5所示，大肠杆菌O-157反向引物序列信息见SEQ ID No.6所示；副溶血弧菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.7所示，副溶血弧菌反向引物序列信息见SEQ ID No.8所示；单核细胞增生李斯特菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.9所示，单核细胞增生李斯特菌反向引物序列信息见SEQ ID No.10所示。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (9)

1.一种检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测方法，其特征在于：提取样品增菌液DNA模板，以5对引物对提取的DNA模板进行五重PCR反应，在五重PCR反应过程中加入荧光标记分子，得到的携带荧光标记PCR产物与基因芯片上合成的杂交探针进行杂交反应，清洗后，通过扫描芯片上的荧光信号即可快速检测致病菌；
5对引物对分别为：
沙门氏菌正向引物，序列信息见SEQ IDNo.1所示，沙门氏菌反向引物序列信息见SEQID No.2所示；
金黄色葡萄球菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.3所示，金黄色葡萄球菌反向引物序列信息见SEQIDNo.4所示；
大肠杆菌O-157正向引物，序列信息见SEQ ID No.5所示，大肠杆菌O-157反向引物序列信息见SEQ IDNo.6所示；
副溶血弧菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.7所示，副溶血弧菌反向引物序列信息见SEQ IDNo.8所示；
单核细胞增生李斯特菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.9所示，单核细胞增生李斯特菌反向引物序列信息见SEQ ID No.10所示；
针对沙门氏菌的探针有20个，序列见SEQ ID No.132～151所示；针对金黄色葡萄球菌的探针有24个，序列见SEQ ID No.108～131所示；针对大肠杆菌O-157的探针有25个，序列见SEQ ID No.11～35所示；针对副溶血弧菌的探针有46个，序列见SEQ ID No.62～107所示；针对单核细胞增生李斯特菌的探针有26个，序列见SEQ ID No.36～61所示。
2.根据权利要求1所述的五重PCR检测方法，其特征在于：五重PCR反应体系以总体积50μL计，其组成如下：
10×ExTaqbuffer10μL，
dATP1.0μL，
dTTP1.0μL，
dGTP1.0μL，
dCTP0.75μL，
cy3-dCTP2.0μL，
引物混合物5.0μL，
DNA模板20ng或10ng，
ExTaq酶0.5μL，
ddH2O补足至50μL。
3.根据权利要求2所述的五重PCR检测方法，其特征在于：dATP、dTTP、dGTP及dCTP浓度均为2.5mmol/L，cy3-dCTP浓度为1nmol/μL，ExTaq酶浓度为5U/μL。
4.根据权利要求2所述的五重PCR检测方法，其特征在于：所述引物混合物由以下浓度为20mmol/L的各引物混合而成：
沙门氏菌正向引物19μL，沙门氏菌反向引物19μL；
金黄色葡萄球菌正向引物20μL，金黄色葡萄球菌反向引物20μL；
大肠杆菌O-157正向引物7.3μL，大肠杆菌O-157反向引物7.3μL；
副溶血弧菌正向引物20μL，副溶血弧菌反向引物20μL；
单核细胞增生李斯特菌正向引物20μL，单核细胞增生李斯特菌反向引物20μL。
5.根据权利要求1所述的五重PCR检测方法，其特征在于：五重PCR反应的条件为：95℃预变性2min，95℃30sec；55℃30sec；72℃30sec；35个循环，72℃补充延伸10min；4℃保持。
6.根据权利要求1所述的五重PCR检测方法，其特征在于：清洗温度为40℃。
7.一种用于权利要求1所述检测方法的检测鲜活农产品中致病菌的五重PCR检测试剂盒，包括五重PCR反应体系，其特征在于：
含有引物和探针；
其中，引物分别为：
沙门氏菌正向引物，序列信息见SEQ IDNo.1所示，沙门氏菌反向引物序列信息见SEQID No.2所示；
金黄色葡萄球菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.3所示，金黄色葡萄球菌反向引物序列信息见SEQIDNo.4所示；
大肠杆菌O-157正向引物，序列信息见SEQ ID No.5所示，大肠杆菌O-157反向引物序列信息见SEQ ID No.6所示；
副溶血弧菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.7所示，副溶血弧菌反向引物序列信息见SEQ IDNo.8所示；
单核细胞增生李斯特菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.9所示，单核细胞增生李斯特菌反向引物序列信息见SEQ ID No.10所示；
探针为：针对沙门氏菌的探针有20个，序列见SEQ ID No.132～151所示；针对金黄色葡萄球菌的探针有24个，序列见SEQ ID No.108～131所示；针对大肠杆菌O-157的探针有25个，序列见SEQ ID No.11～35所示；针对副溶血弧菌的探针有46个，序列见SEQ ID No.62～107所示；针对单核细胞增生李斯特菌的探针有26个，序列见SEQ ID No.36～61所示；
所述五重PCR反应体系以总体积50μL计，其组成如下：
10×ExTaqbuffer10μL，
dATP1.0μL，
dTTP1.0μL，
dGTP1.0μL，
dCTP0.75μL，
cy3-dCTP2.0μL，
引物混合物5.0μL，
DNA模板20ng或10ng，
ExTaq酶0.5μL，
ddH2O补足至50μL。
8.根据权利要求7所述的五重PCR检测试剂盒，其特征在于：dATP、dTTP、dGTP及dCTP浓度均为2.5mmol/L，cy3-dCTP浓度为1nmol/μL，ExTaq酶浓度为5U/μL。
9.根据权利要求7所述的五重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述引物混合物由以下浓度为20mmol/L的各引物混合而成：
沙门氏菌正向引物19μL，沙门氏菌反向引物19μL；
金黄色葡萄球菌正向引物20μL，金黄色葡萄球菌反向引物20μL；
大肠杆菌O-157正向引物7.3μL，大肠杆菌O-157反向引物7.3μL；
副溶血弧菌正向引物20μL，副溶血弧菌反向引物20μL；
单核细胞增生李斯特菌正向引物20μL，单核细胞增生李斯特菌反向引物20μL；
沙门氏菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.1所示，沙门氏菌反向引物序列信息见SEQID No.2所示；金黄色葡萄球菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.3所示，金黄色葡萄球菌反向引物序列信息见SEQ ID No.4所示；大肠杆菌O-157正向引物，序列信息见SEQ ID No.5所示，大肠杆菌O-157反向引物序列信息见SEQ ID No.6所示；副溶血弧菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.7所示，副溶血弧菌反向引物序列信息见SEQ ID No.8所示；单核细胞增生李斯特菌正向引物，序列信息见SEQ ID No.9所示，单核细胞增生李斯特菌反向引物序列信息见SEQ ID No.10所示。
CN201510695010.6A 2015-10-22 2015-10-22 一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr检测方法及其检测试剂盒 Active CN105331688B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510695010.6A CN105331688B (zh) 2015-10-22 2015-10-22 一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr检测方法及其检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510695010.6A CN105331688B (zh) 2015-10-22 2015-10-22 一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr检测方法及其检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105331688A CN105331688A (zh) 2016-02-17
CN105331688B true CN105331688B (zh) 2019-04-09

Family

ID=55282451

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510695010.6A Active CN105331688B (zh) 2015-10-22 2015-10-22 一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr检测方法及其检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105331688B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113621720A (zh) * 2021-08-13 2021-11-09 河北省畜牧兽医研究所 检测并鉴定3种食源性致病菌的多重荧光定量pcr方法
CN114214443B (zh) * 2021-12-28 2023-05-16 上海市质量监督检验技术研究院 可同时检测多种微生物的多重荧光定量pcr检测方法和多重荧光定量pcr检测试剂盒
CN114381536B (zh) * 2022-01-21 2024-05-17 江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院 五种食源性致病菌的多重pcr检测引物组、试剂盒和方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006090945A1 (en) * 2005-02-28 2006-08-31 Samsung Everland Inc. Primer for detecting food poisoning and method for rapid detection of food born pathogene
WO2011129091A1 (ja) * 2010-04-14 2011-10-20 東洋製罐株式会社 Ｐｃｒ用プライマーセット、ｐｃｒ用反応液、食中毒菌の検出方法
CN103540668A (zh) * 2013-10-22 2014-01-29 宁波大学 检测10种海域致病菌的基因芯片
CN104328167A (zh) * 2014-09-17 2015-02-04 宁夏大学 可并行检测奶牛乳房炎十种主要致病菌的基因芯片及检测方法
CN104962617A (zh) * 2015-06-08 2015-10-07 国家海洋环境监测中心 一种浴场海水中致病性细菌的基因芯片检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006090945A1 (en) * 2005-02-28 2006-08-31 Samsung Everland Inc. Primer for detecting food poisoning and method for rapid detection of food born pathogene
WO2011129091A1 (ja) * 2010-04-14 2011-10-20 東洋製罐株式会社 Ｐｃｒ用プライマーセット、ｐｃｒ用反応液、食中毒菌の検出方法
CN103540668A (zh) * 2013-10-22 2014-01-29 宁波大学 检测10种海域致病菌的基因芯片
CN104328167A (zh) * 2014-09-17 2015-02-04 宁夏大学 可并行检测奶牛乳房炎十种主要致病菌的基因芯片及检测方法
CN104962617A (zh) * 2015-06-08 2015-10-07 国家海洋环境监测中心 一种浴场海水中致病性细菌的基因芯片检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
常见7种食源性致病菌xMAP液相芯片快速筛查方法的建立及应用;吕东月等;《卫生研究》;20120131;第41卷(第1期);96-101

Also Published As

Publication number Publication date
CN105331688A (zh) 2016-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dorigo et al. Molecular approaches to the assessment of biodiversity in aquatic microbial communities
Cooke et al. Tools to detect, identify and monitor Phytophthora species in natural ecosystems
Cocolin et al. Molecular detection and identification of Brettanomyces/Dekkera bruxellensis and Brettanomyces/Dekkera anomalus in spoiled wines
EP2176281A1 (en) Nucleic acid sequences and combination thereof for sensitive amplification and detection of bacterial and fungal sepsis pathogens
Hellberg et al. 16S rRNA partial gene sequencing for the differentiation and molecular subtyping of Listeria species
NO326359B1 (no) Fremgangsmate ved pavisning av forskjellige nukleotidsekvenser i en enkelt prove samt sett for utforelse av fremgangsmaten
CN103898108A (zh) 对河流弧菌o2，o4，o13，o15和o18特异的核苷酸及其应用
CN105331688B (zh) 一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr检测方法及其检测试剂盒
JP2017163970A (ja) 黄色ブドウ球菌を検出するためのオリゴヌクレオチド
CN103820558B (zh) 一种用于检测海产品中九种致病性弧菌的基因芯片
CN101240347B (zh) 检测芯片的制备方法及利用该芯片检测病原体的方法
Schoebel et al. Development of new polymorphic microsatellite markers for three closely related plant-pathogenic Phytophthora species using 454-pyrosequencing and their potential applications
CN105483220A (zh) 一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重lamp检测引物及试剂盒
CN102676664A (zh) 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法
CN105331610B (zh) 一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr引物及探针和试剂盒
CN103160587B (zh) 10种常见致病军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒
US20230265529A1 (en) Methods and Compositions for Determining Salmonella Presence and Concentration Using PCR Primers of Varying Amplification Efficiencies
Böhme et al. Detection of food spoilage and pathogenic bacteria based on ligation detection reaction coupled to flow‐through hybridization on membranes
JP2017163969A (ja) ブドウ球菌を検出するためのオリゴヌクレオチド
KR20180055075A (ko) 고추 풋마름병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 snp 마커 및 이의 용도
Galluzzi et al. Current molecular techniques for the detection of microbial pathogens
Sheikha et al. Is PCR‐DGGE an innovative molecular tool for the detection of microbial plant pathogens?
Aslan et al. Nucleic Acid–Based Methods in the Detection of Foodborne Pathogens
KR20110101612A (ko) 그람양성 식중독 유발 세균 검출용 올리고뉴클레오타이드 및 이의 용도
Suo et al. Optimization and Application of a Custom Microarray for the Detection and Genotyping of E. coli O157: H7 in Fresh Meat Samples

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 116600, No. 18 West Liaohe Road, Dalian economic and Technological Development Zone, Liaoning, Dalian

Patentee after: DALIAN MINZU University

Patentee after: HANGZHOU LIANCHUAN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 116600, No. 18 West Liaohe Road, Dalian economic and Technological Development Zone, Liaoning, Dalian

Patentee before: DALIAN MINZU University

Patentee before: HANGZHOU LC BIOTECH Co.,Ltd.