CN105483220A - 一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重lamp检测引物及试剂盒 - Google Patents

一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重lamp检测引物及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105483220A
CN105483220A CN201510924111.6A CN201510924111A CN105483220A CN 105483220 A CN105483220 A CN 105483220A CN 201510924111 A CN201510924111 A CN 201510924111A CN 105483220 A CN105483220 A CN 105483220A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
ompw
toxr
seqidno
vibrio
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510924111.6A
Other languages
English (en)
Inventor
相兴伟
胡兴娟
邵宏宏
周秀锦
周向阳
廖妙飞
洪瑶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Complex Art Service Centre Of Zhoushan Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Original Assignee
Complex Art Service Centre Of Zhoushan Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Complex Art Service Centre Of Zhoushan Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau filed Critical Complex Art Service Centre Of Zhoushan Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Priority to CN201510924111.6A priority Critical patent/CN105483220A/zh
Publication of CN105483220A publication Critical patent/CN105483220A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测引物及试剂盒，包括3对霍乱弧菌LAMP扩增引物和3对副溶血性弧菌LAMP扩增引物，引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。<!-- 2 -->

Description

一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及水产品生物检测技术领域，特别涉及一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测引物及试剂盒。
背景技术
随着人们生活水平的提高，食品安全问题越来越受到人们的重视，已成为重大的世界性公共问题，而病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一。副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和霍乱弧菌(Vibriocholerae)在世界范围内被公认是两种重要的肠道致病菌。前者广泛存在于海洋环境中，是威胁海水养殖业的主要病原菌之一，能够感染鱼、虾和贝类等，引起虾红体病、鱼类皮肤溃疡等疾病，对水产养殖业造成重大经济损失。人类食用该菌污染的海产品后可引起食物中毒，会有腹泻、恶心、呕吐、发热，甚至脱水、昏迷等症状，严重的可导致败血症甚至死亡，是日本、欧美和东南亚国家食物中毒和急性腹泻病的重要病原菌。霍乱弧菌是环境水体自然菌群中的一种，霍乱弧菌中的O1群和O139群菌株可以引起很严重的人类腹泻病，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水若抢救不及时，病死率较高，属于国际检疫传染病，在我国被列为甲类传染病。近年来，食用鲜活海产品的人群和地域在不断增多，由此两种病原菌引发的食品安全问题也显得越来越重要。
鉴于其高度危害性，我国对人工养殖及海捕水产品中这霍乱和副溶血性弧菌有着严格的限量要求。目前我国用于检测食品中这两种菌的国家标准和行业标准，皆属于传统的培养及生化鉴定方法，检测周期长、工作量大，不能满足水产品质量安全快速反应体系的需求。LAMP作为一种新的核酸扩增技术，较其它分子生物学检测方法而言具有实验条件低、灵敏度高和特异性强等优势，在微生物的检测中受到青睐并推广应用。该技术在食源性致病菌的检测中已有初步研究，但都是采用单一检测，耗时长，检测成本高。同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP体系未见报道。若采用多重LAMP体系，由于存在多对引物，引物之间的干扰以及引物与模板的错配而造成灵敏度下降与非特异性扩增反应增加等问题。
发明内容
本发明的目的在于一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测引物，引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。
本发明还提供了一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测试剂盒，不但保持了较高的特异性和敏感性，而且更加方便、快捷和经济，一次反应可检测两种致病菌。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测引物，包括3对霍乱弧菌LAMP扩增引物和3对副溶血性弧菌LAMP扩增引物，3对霍乱弧菌LAMP扩增引物具体如下：
内引物ompw-FIP，序列信息见SEQIDNo.1，
内引物ompw-BIP，序列信息见SEQIDNo.2，
外引物ompw-F3，序列信息见SEQIDNo.5，
外引物ompw-B3，序列信息见SEQIDNo.6，
环引物ompw-LF，序列信息见SEQIDNo.9，
环引物ompw-LB，序列信息见SEQIDNo.10；
3对副溶血性弧菌LAMP扩增引物具体如下：
内引物toxR-FIP，序列信息见SEQIDNo.3，
内引物toxR-BIP，序列信息见SEQIDNo.4，
外引物toxR-F3，序列信息见SEQIDNo.7，
外引物toxR-B3，序列信息见SEQIDNo.8，
环引物toxR-LF，序列信息见SEQIDNo.11，
环引物toxR-LB，序列信息见SEQIDNo.12。
本发明首次开发了双重LAMP技术快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌。针对副溶血性弧菌、霍乱弧菌分别设计3对特异性引物，引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。本发明特别在双重LAMP扩增时引入了特定的环引物，大大提高了扩增效率，缩短了检测时间。
一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测试剂盒，包括双重LAMP扩增反应液，所述双重LAMP扩增反应液以总体积25μL计由以下组分混合而成：
包括双重LAMP扩增反应液，所述双重LAMP扩增反应液以总体积25μL计由以下组分混合而成：
反应缓冲液12.5μL，内引物ompw-FIP1μL，内引物ompw-BIP1μL，内引物toxR-FIP1μL，内引物toxR-BIP1μL，外引物ompw-F30.125μL，外引物ompw-B30.125μL，外引物toxR-F30.125μL，外引物toxR-B30.125μL，环引物ompw-LF0.5μL，环引物ompw-LB0.5μL，环引物toxR-LF0.5μL，环引物toxR-LB0.5μL，BstDNA聚合酶1μL，钙黄绿素1μL，DNA模板2μL，ddH2O余量。
本发明的检测试剂盒中包含荧光试剂，可实现荧光可视化检测，更快速直观。
作为优选，所述反应缓冲液各组分如下：20mmol/LTris-HCl(pH8.8)，6.5mmol/LMgSO4，10mmol/LKCl，10mmol/L(NH4)2SO4，0.1％TritonX-100，1.6mol/L甜菜碱，1.4mmol/LdNTPs，ddH2O余量。
作为优选，内引物ompw-FIP、内引物ompw-BIP、内引物toxR-FIP及内引物toxR-BIP的浓度均为20μmol/L。
作为优选，外引物ompw-F3、外引物ompw-B3、外引物toxR-F3及外引物toxR-B3的浓度均为20μmol/L。
作为优选，环引物ompw-LF、环引物ompw-LB、环引物toxR-LF及环引物toxR-LB的浓度均为20μmol/L。
作为优选，所述BstDNA聚合酶的浓度为8U/μL。
作为优选，所述钙黄绿素的浓度为25μmol/L。
一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测方法，提取样品DNA，将样品DNA作为模板放入双重LAMP扩增反应液中进行LAMP扩增，反应时间60min，反应温度61℃，反应结束后72℃灭活5min。在61℃，反应60min条件下引物的扩增值最高，扩增效果最好。
本发明的有益效果是：
1、引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。
2、与常规LAMP相比，本发明的双重LAMP不但保持了较高的特异性和敏感性，而且更加方便、快捷和经济，一次反应可检测两个致病菌。
附图说明
图1是不同菌种的LAMP扩增产物特异性检测的琼脂糖凝胶电泳图；
图中：M.MarkerDL2000；1.黄色葡萄球菌；2.单增李斯特菌；3.哈维氏弧菌；4.创伤弧菌；5.鳗弧菌；6.霍乱弧菌；7.副溶血弧菌，8.霍乱弧菌和副溶血弧菌DNA混合模板(霍乱弧菌DNA模板1μL+副溶血性弧菌DNA模板1μL)。
图2是不同浓度DNA模板的LAMP扩增曲线图；
图中：1.DNA稀释液10-1；2.DNA稀释液10-2；3.DNA稀释液10-3；4.DNA稀释液10-4；5.DNA稀释液10-5；6.DNA稀释液10-6；7.DNA稀释液10-7；8.DNA稀释液10-8。
图3是不同浓度DNA模板的LAMP扩增产物灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳图；
图中：M：MarkerDL2000；1.DNA稀释液10-1；2.DNA稀释液10-2；3.DNA稀释液10-3；4.DNA稀释液10-4；5.DNA稀释液10-5；6.DNA稀释液10-6；7.DNA稀释液10-7；8.DNA稀释液10-8。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测试剂盒，包括双重LAMP扩增反应液，所述双重LAMP扩增反应液以总体积25μL计由以下组分混合而成：
反应缓冲液12.5μL，浓度20μmol/L的内引物ompw-FIP1μL，浓度20μmol/L的内引物ompw-BIP1μL，浓度20μmol/L的内引物toxR-FIP1μL，浓度20μmol/L的内引物toxR-BIP1μL，浓度20μmol/L的外引物ompw-F30.125μL，浓度20μmol/L的外引物ompw-B30.125μL，浓度20μmol/L的外引物toxR-F30.125μL，浓度20μmol/L的外引物toxR-B30.125μL，浓度20μmol/L的环引物ompw-LF0.5μL，浓度20μmol/L的环引物ompw-LB0.5μL，浓度20μmol/L的环引物toxR-LF0.5μL，浓度20μmol/L的环引物toxR-LB0.5μL，浓度8U/μL的BstDNA聚合酶(市售)1μL，浓度为25μmol/L的钙黄绿素1μL，DNA模板2μL，ddH2O余量。
所述反应缓冲液各组分如下：20mmol/LTris-HCl，6.5mmol/LMgSO4，10mmol/LKCl，10mmol/L(NH4)2SO4，0.1％(体积分数)TritonX-100，1.6mol/L甜菜碱，1.4mmol/LdNTPs，ddH2O余量。
1、引物设计
通过NCBI数据库分析副溶血性弧菌的toxR(SEQIDNo.14)和霍乱弧菌的ompW(SEQIDNo.13)种特异性基因，分别在其保守区设计引物。利用Primerpremier5.0软件设计针对靶基因的6个区域设计特异引物并合成，引物合成委托生物公司完成。
霍乱弧菌LAMP引物序列见表1
表1
6条霍乱弧菌LAMP引物在ompW基因序列保守区域的相对位置
副溶血性弧菌LAMP引物序列见表2
表2
6条副溶血性弧菌LAMP引物在toxR基因序列保守区域的相对位置
2、样品DNA的提取：
样品处理：取水产品类样品25g与225mL碱性蛋白胨水(配制方法：蛋白胨20g，氯化钠20g，蒸馏水1000mL,混匀后调解pH值至8.6±0.2(25℃)，121℃灭菌15min)用拍打器进行混匀，制成混合液后置36±1℃培养8-18h，得增菌液。
DNA提取：取上述增菌液1mL，12000rpm离心3min，弃上清，所得沉淀按照细菌基因组DNA抽提试剂盒(艾德莱细菌DNA提取试剂盒，市售)的说明书提取样品的基因组DNA获得样品DNA，提取完成后用超微量核酸蛋白分析仪Nanodrop2000c测定提取DNA浓度。
3、荧光可视化检测：采用本发明的试剂盒组分配成LAMP检测体系，25μL的LAMP检测体系的具体配置为：反应缓冲液12.5μL，浓度20μmol/L的内引物ompw-FIP1μL，浓度20μmol/L的内引物ompw-BIP1μL，浓度20μmol/L的内引物toxR-FIP1μL，浓度20μmol/L的内引物toxR-BIP1μL，浓度20μmol/L的外引物ompw-F30.125μL，浓度20μmol/L的外引物ompw-B30.125μL，浓度20μmol/L的外引物toxR-F30.125μL，浓度20μmol/L的外引物toxR-B30.125μL，浓度20μmol/L的环引物ompw-LF0.5μL，浓度20μmol/L的环引物ompw-LB0.5μL，浓度20μmol/L的环引物toxR-LF0.5μL，浓度20μmol/L的环引物toxR-LB0.5μL，浓度8U/μL的BstDNA聚合酶(市售)1μL，浓度为25μmol/L的钙黄绿素1μL，DNA模板2μL，ddH2O余量。
61℃下反应60min后，在紫外灯下观察颜色，若出现绿色荧光表明呈阳性，表明至少污染了霍乱弧菌、副溶血性弧菌中的一种，可快速观察结果，且无需开盖，避免污染。要精确确认污染的是哪种菌，采取步骤4的方案。
4、进一步检测：采用双重LAMP检测体系(不加荧光剂)，25μL的双重LAMP检测体系的具体配置为：
反应缓冲液12.5μL，
浓度20μmol/L的内引物ompw-FIP(SEQIDNo.1)1μL，
浓度20μmol/L的内引物ompw-BIP(SEQIDNo.2)1μL，
浓度20μmol/L的内引物toxR-FIP(SEQIDNo.3)1μL，
浓度20μmol/L的内引物toxR-BIP(SEQIDNo.4)1μL，
浓度20μmol/L的外引物ompw-F3(SEQIDNo.5)0.125μL，
浓度20μmol/L的外引物ompw-B3(SEQIDNo.6)0.125μL，
浓度20μmol/L的外引物toxR-F3(SEQIDNo.7)0.125μL，
浓度20μmol/L的外引物toxR-B3(SEQIDNo.8)0.125μL，
浓度20μmol/L的环引物ompw-LF(SEQIDNo.9)0.5μL，
浓度20μmol/L的环引物ompw-LB(SEQIDNo.10)0.5μL，
浓度20μmol/L的环引物toxR-LF(SEQIDNo.11)0.5μL，
浓度20μmol/L的环引物toxR-LB(SEQIDNo.12)0.5μL，
浓度8U/μL的BstDNA聚合酶1μL，
DNA模板2μL，
ddH2O补足至25μL。
61℃扩增反应60min，LAMP反应在实时浊度仪(LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控，浊度仪实时监测扩增情况，反应结束后72℃灭活5min，将LAMP扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后观察结果。
5、双重LAMP检测试剂盒的特异性检测：
分别提取金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌(均为市售菌种)DNA进行双重LAMP特异性试验，检测条件参见步骤3，将LAMP扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(附图1所示)，结果表明：双重LAMP反应特异性良好。
6、双重LAMP检测试剂盒的灵敏度检测：
将提取的霍乱弧菌、副溶血弧菌DNA模板用超纯水以10的倍数依次稀释，进行双重LAMP特异性试验，检测条件参见步骤3(检测体系中DNA模板组成为：霍乱弧菌DNA模板1μL+副溶血性弧菌DNA模板1μL)。从图2结果显示：霍乱弧菌、副溶血弧菌DNA经10的倍数梯度稀释后，100至10-7基本都在25min前起峰，且均有明显的扩增峰，当模板DNA稀释至10-8时，扩增曲线在50min后出现抬头峰，认为这是出现了非特异性扩增，因此双重PCR灵敏度达到10-7。
将LAMP扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(附图3所示)，霍乱弧菌、副溶血弧菌模板混合物经10倍数稀释至10-8时，仍有明显扩增，但由于考虑前面LAMP扩增结果图稀释至10-8时应该为非特异扩增，因此认为双重LAMP的灵敏度为10-7。
7、水产品样品的实际检测：利用本发明的试剂盒检测海产品100份(采用国际GB/T4789.1-2010方法进行副溶血弧菌和霍乱弧菌的分离)，包括贝类20份、虾类40份和鱼类40份(被检海产品样品按照《出口食品中副溶血性弧菌检验方法》(SN/T0173)、《出口食品中霍乱弧菌检验方法》(SN/T1022)进行验证)，100份产品中1份同时检测出霍乱弧菌和副溶血性弧菌，3份单检测出霍乱弧菌，2份单检测出副溶血性弧菌，检测结果与《出口食品中副溶血性弧菌检验方法》(SN/T0173)、《出口食品中霍乱弧菌检验方法》(SN/T1022)方法检测结果一致。验证本发明试剂盒的可靠性和实用性。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (9)

1.一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测引物，其特征在于：包括3对霍乱弧菌LAMP扩增引物和3对副溶血性弧菌LAMP扩增引物，3对霍乱弧菌LAMP扩增引物具体如下：
内引物ompw-FIP，序列信息见SEQIDNo.1，
内引物ompw-BIP，序列信息见SEQIDNo.2，
外引物ompw-F3，序列信息见SEQIDNo.5，
外引物ompw-B3，序列信息见SEQIDNo.6，
环引物ompw-LF，序列信息见SEQIDNo.9，
环引物ompw-LB，序列信息见SEQIDNo.10；
3对副溶血性弧菌LAMP扩增引物具体如下：
内引物toxR-FIP，序列信息见SEQIDNo.3，
内引物toxR-BIP，序列信息见SEQIDNo.4，
外引物toxR-F3，序列信息见SEQIDNo.7，
外引物toxR-B3，序列信息见SEQIDNo.8，
环引物toxR-LF，序列信息见SEQIDNo.11，
环引物toxR-LB，序列信息见SEQIDNo.12。
2.一种采用权利要求1的引物制备的水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括双重LAMP扩增反应液，所述双重LAMP扩增反应液以总体积25μL计由以下组分混合而成：
反应缓冲液12.5μL，内引物ompw-FIP1μL，内引物ompw-BIP1μL，内引物toxR-FIP1μL，内引物toxR-BIP1μL，外引物ompw-F30.125μL，外引物ompw-B30.125μL，外引物toxR-F30.125μL，外引物toxR-B30.125μL，环引物ompw-LF0.5μL，环引物ompw-LB0.5μL，环引物toxR-LF0.5μL，环引物toxR-LB0.5μL，BstDNA聚合酶1μL，钙黄绿素1μL，DNA模板2μL，ddH2O余量。
3.根据权利要求1所述的双重LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液各组分如下：20mmol/LTris-HCl，6.5mmol/LMgSO4，10mmol/LKCl，10mmol/L(NH4)2SO4，0.1％TritonX-100，1.6mol/L甜菜碱，1.4mmol/LdNTPs，ddH2O余量。
4.根据权利要求2或3所述的双重LAMP检测试剂盒，其特征在于：内引物ompw-FIP、内引物ompw-BIP、内引物toxR-FIP及内引物toxR-BIP的浓度均为20μmol/L。
5.根据权利要求2或3所述的双重LAMP检测试剂盒，其特征在于：外引物ompw-F3、外引物ompw-B3、外引物toxR-F3及外引物toxR-B3的浓度均为20μmol/L。
6.根据权利要求2或3所述的双重LAMP检测试剂盒，其特征在于：环引物ompw-LF、环引物ompw-LB、环引物toxR-LF及环引物toxR-LB的浓度均为20μmol/L。
7.根据权利要求2或3所述的双重LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述BstDNA聚合酶的浓度为8U/μL。
8.根据权利要求2或3所述的双重LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述钙黄绿素的浓度为25μmol/L。
9.一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测方法，其特征在于：提取样品DNA，将样品DNA作为模板放入权利要求2的双重LAMP扩增反应液中进行LAMP扩增，反应时间60min，反应温度61℃，反应结束后72℃灭活5min。
CN201510924111.6A 2015-12-11 2015-12-11 一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重lamp检测引物及试剂盒 Pending CN105483220A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510924111.6A CN105483220A (zh) 2015-12-11 2015-12-11 一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重lamp检测引物及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510924111.6A CN105483220A (zh) 2015-12-11 2015-12-11 一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重lamp检测引物及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105483220A true CN105483220A (zh) 2016-04-13

Family

ID=55670491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510924111.6A Pending CN105483220A (zh) 2015-12-11 2015-12-11 一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重lamp检测引物及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105483220A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106222274A (zh) * 2016-08-05 2016-12-14 集美大学 一种霍利斯格里蒙特氏菌的快速检测方法
CN110093428A (zh) * 2019-01-30 2019-08-06 宁波大学 一种致病性弧菌的高通量定量检测试剂盒
CN111850155A (zh) * 2020-06-29 2020-10-30 新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所 特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用
CN113736897A (zh) * 2021-09-18 2021-12-03 上海海洋大学 一种基于双重raa-lfd技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的引物组、试剂盒及方法
WO2022095922A1 (en) * 2020-11-05 2022-05-12 Becton, Dickinson And Company Rapid identification and typing of vibrio parahaemolyticus

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101570783A (zh) * 2009-03-20 2009-11-04 郑秋月 水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101570783A (zh) * 2009-03-20 2009-11-04 郑秋月 水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIRO NEMOTO等: "Rapid and Specific Detection of the Thermostable Direct Hemolysin Gene in Vibrio parahaemolyticus by Loop-Mediated Isothermal Amplification", 《JOURNAL OF FOOD PROTECTION》 *
SIYI CHEN等: "Development of a toxR-based loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio parahaemolyticus", 《BMC MCIROBIOLOGY》 *
许龙岩等: "MPCR检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的研究", 《卫生研究》 *
陈传等: "LAMP技术用于霍乱弧菌检测的研究", 《生命科学研究》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106222274A (zh) * 2016-08-05 2016-12-14 集美大学 一种霍利斯格里蒙特氏菌的快速检测方法
CN106222274B (zh) * 2016-08-05 2020-01-31 集美大学 一种霍利斯格里蒙特氏菌的快速检测方法
CN110093428A (zh) * 2019-01-30 2019-08-06 宁波大学 一种致病性弧菌的高通量定量检测试剂盒
CN110093428B (zh) * 2019-01-30 2022-09-30 浙江正合谷生物科技有限公司 一种致病性弧菌的高通量定量检测试剂盒
CN111850155A (zh) * 2020-06-29 2020-10-30 新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所 特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用
WO2022095922A1 (en) * 2020-11-05 2022-05-12 Becton, Dickinson And Company Rapid identification and typing of vibrio parahaemolyticus
CN113736897A (zh) * 2021-09-18 2021-12-03 上海海洋大学 一种基于双重raa-lfd技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的引物组、试剂盒及方法
CN113736897B (zh) * 2021-09-18 2023-12-26 上海海洋大学 一种基于双重raa-lfd技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的引物组、试剂盒及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rodríguez-Lázaro et al. Trends in analytical methodology in food safety and quality: monitoring microorganisms and genetically modified organisms
CN105483220A (zh) 一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重lamp检测引物及试剂盒
CN106987653B (zh) 一种马铃薯晚疫病菌lamp检测引物及其可视化检测方法
CN106367492A (zh) 快速恒温检测单核细胞增生李斯特菌的方法、引物及应用
Rodríguez-Lázaro et al. Real-time PCR in food science: PCR diagnostics
CN106868152B (zh) 一种食源性致病菌沙门氏菌的检测方法
CN106191298A (zh) 一种检测副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus的方法
CN101851675A (zh) 检测检疫性实蝇的探针组及检测方法
Eischeid Development and evaluation of a real-time PCR assay for detection of lobster, a crustacean shellfish allergen
Kim et al. Comparison of culture, conventional and real-time PCR methods for Listeria monocytogenes in foods
Zang et al. Can a visual loop-mediated isothermal amplification assay stand out in different detection methods when monitoring Campylobacter jejuni from diverse sources of samples?
CN102277422A (zh) 一种快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法
CN103276103A (zh) 检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用
Xu et al. A cross-priming amplification assay coupled with vertical flow visualization for detection of Vibrio parahaemolyticus
CN110923343A (zh) 一种快速检测鸡白痢沙门菌的等温扩增引物组和试剂盒
CN105483221A (zh) 一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重lamp检测试剂盒
CN102424861B (zh) 检测食品中沙门菌的环介导等温扩增方法及试剂盒
CN106801103B (zh) 一种无乳链球菌的检测引物组、检测试剂盒和多重pcr检测方法
CN105331688B (zh) 一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr检测方法及其检测试剂盒
CN106834500B (zh) 用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用
CN108107037A (zh) 基于核酸酶保护法和电化学发光原理的食源性致病菌检测方法
CN107022601B (zh) 用于检测具有国家限量标准的5种食品致病菌的引物组合及其应用
CN102534038A (zh) 一种空肠弯曲菌的高灵敏快速检测试剂盒
CN105331610B (zh) 一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr引物及探针和试剂盒
CN101591704A (zh) 食品中三种产芽孢菌的检测试剂盒及其检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160413

RJ01 Rejection of invention patent application after publication