CN102277422A - 一种快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法 - Google Patents

Abstract

一种快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法，涉及一种检测液体乳中单增李斯特活菌的方法。它解决了现有LAMP检测方法不能有效区分死菌和活菌、传统的液体乳中致病菌检测方法存在检测时间长，检测成本高的问题。方法：受检乳样的前处理；样品DNA的提取；LAMP扩增；鉴定，即完成检测。本发明方法耗时较短，检测灵敏度高，约1.5小时即可完成，大大缩短了检测时间，可以显著减少原料乳加工前和成品出厂前的等待检测结果的储藏时间。对液体乳中单增李斯特菌活菌的检出限为6.37×10¹cfu/mL。可广泛应用于食源性致病菌检测领域。

Description

一种快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法

技术领域

本发明涉及一种检测单增李斯特菌活菌的方法。

背景技术

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)，简称“单增李斯特菌”，是重要的食源性致病菌之一，分布广泛，生存环境可塑性大，新生儿、孕妇和40岁以上的成人和免疫功能缺陷者易被感染，其致死率很高，WHO已将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一，因此，单增李斯特菌是许多国家食品中微生物检测的必检指标之一。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，简称LAMP)发展迅速，其针对目的基因的六个区域设计4条特异引物(两条外引物和两条内引物)，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件下，1h内即可实现核酸的高效扩增，已广泛用于单增李斯特菌的检测。但是LAMP方法会同时扩增样品中的死菌和活菌的DNA，不能有效区分死菌和活菌，易造成高估实际样品中存在的活菌水平。

随着中国经济快速发展，人民对液体乳安全也备受关注，国家也加大了检测液体乳中食源性致病菌的力度，但目前的分子生物学技术(PCR技术或LAMP技术)，都需要采用预增菌步骤(一般最增菌时间为8h～12h)，虽然能够达到很低的检出限，但是增加了检测时间和检测成本。所以现在还没有一种快速检测液体乳中单增李斯特活菌的方法。

发明内容

本发明是要解决现有的LAMP检测方法不能有效区分死菌和活菌、传统的液体乳中致病菌检测方法存在检测时间长，检测成本高的问题，提供一种快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法。

本发明快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法，按以下步骤进行：一、受检乳样的前处理：向1mL受检乳中加入PMA，使PMA的浓度为50μmol/L，然后置于暗处放置5～30min，接着置于距650W卤素灯15～20cm处，曝光5～30min；二、样品DNA的提取：向步骤一处理后的受检乳中加入150μL浓度为250g/L的柠檬酸钠和100μL浓度为1mol/L的氢氧化钠，然后于10000r/min离心2min，弃上清，得沉淀；三、用质量浓度为0.85％的生理盐水洗涤沉淀，然后于10000r/min离心1min，弃上清，用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，得提取物；四、以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；五、鉴定：取5μL LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。

本发明针对单增李斯特菌独有的致病基因——hlyA基因来设计引物，进行LAMP扩增。本发明使用的荧光染料PMA(Propidium Monoazide)结构中带有一个叠氮基团(-N3)，在光激发下脱去(-N2)形成活跃的氮宾中间体，能插入死细胞DNA与其形成共价键(-NH-CH2-)，使DNA不能发生扩增反应，从而抑制LAMP扩增，可以有效区分死细菌和活细菌，避免造成对待测样品中实际存活的单增李斯特菌含量的错误评估。

本发明的方法不需要预增菌步骤，能够直接、快速的检测出液体乳中单增李斯特活菌。本发明方法对仪器设备要求简单，只需水浴条件即可完成，耗时较短，约1.5小时即可完成，大大缩短了检测时间，可以显著减少原料乳加工前和成品出厂前的等待检测结果的储藏时间。将本发明的电泳结果使用凝胶成像系统成像，能够检测出扩增条带的即说明受检乳中含有单增李斯特菌活菌。本发明的方法检测灵敏度高，对单增李斯特菌活菌的检出限为6.37×10¹cfu/mL。本发明为食品中致病菌的检测开辟了新思路。

附图说明

图1为具体实施方式十一的检测结果电泳图；图2为具体实施方式十一中PMA抑制单增李斯特死菌的LAMP扩增结果电泳图；图3为具体实施方式十一中灵敏度测试实验的电泳图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法，按以下步骤进行：一、受检乳样的前处理：向1mL受检乳中加入PMA，使PMA的浓度为50μmol/L，然后置于暗处放置5～30min，接着置于距650W卤素灯15～20cm处，曝光5～30min；二、样品DNA的提取：向步骤一处理后的受检乳中加入150μL浓度为250g/L的柠檬酸钠和100μL浓度为1mol/L的氢氧化钠，然后于10000r/min离心2min，弃上清，得沉淀；三、用质量浓度为0.85％的生理盐水洗涤沉淀，然后于10000r/min离心1min，弃上清，用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，得提取物；四、以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；五、鉴定：取5μL LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。

能够扩增出条带即说明受检乳中含有单增李斯特菌活菌。

本实施方式方法对仪器设备要求简单，只需水浴条件即可完成，耗时较短，约1.5小时即可完成，检测灵敏度高，对活菌的检出限为6.37×10¹cfu/mL。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中置于暗处放置10～20min。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中置于暗处放置15min。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中置于距650W卤素灯15cm处。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中置于距650W卤素灯18cm处。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中置于距650W卤素灯20cm处。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤一中曝光10～20min。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤一中曝光15min。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤一中曝光5min。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤四中LAMP扩增的反应体系为25μL反应体系，由下列成分组成：

LAMP扩增条件为：95℃5min，迅速置于4℃加入Bst酶，63℃60min，80℃2min。其它与具体实施方式一至九之一相同。

具体实施方式十一：本实施方式快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法，按以下步骤进行：一、取受检乳1和受检乳2作为受检乳样，进行受检乳样的前处理：分别向1mL受检乳1和1mL受检乳2中加入PMA，使PMA的浓度为50μmol/L，然后置于暗处放置5min，接着置于距650W卤素灯20cm处，曝光5min；二、样品DNA的提取：向步骤一处理后的受检乳中分别加入150μL浓度为250g/L的柠檬酸钠和100μL浓度为1mol/L的氢氧化钠，然后于10000r/min离心2min，弃上清，得沉淀1和沉淀2；三、用质量浓度为0.85％的生理盐水洗涤沉淀，然后于10000r/min离心1min，弃上清，用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，得提取物1和提取物2；四、分别以提取物1和提取物2作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；五、鉴定：分别取5μL LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。

本实施方式步骤四中LAMP扩增的反应体系为25μL反应体系，由下列成分组成：

LAMP扩增条件为：95℃5min，迅速置于4℃加入Bst酶，63℃60min，80℃2min。

本实施方式步骤五中使用凝胶成像系统为美国UVP凝胶成像系统。本实施方式的检测结果如图1所示，图1中M为DNA Marker，泳道1为受检乳1，泳道2为受检乳2，从图1中可看出受检乳2中含有单增李斯特活菌，而受检乳1中不含有单增李斯特活菌。

为了证明本实施方式的方法能够选择性只扩增活菌，进行以下试验：以浓度为5×10⁸cfu/mL的单增李斯特菌活菌液作为待检样品A，将浓度为5×10⁸cfu/mL的单增李斯特菌活菌液于95℃水浴3min，得到的死菌液作为待检样品B；将待检样品A平均分成2份，得到待检样品A1和待检样品A2，将待检样品B平均分成2份，得到待检样品B1和待检样品B2；待检样品A1和待检样品B1不经过PMA处理，而将待检样品A2和待检样品B2按照本实施方式的方法进行PMA处理，然后对4个样品分别用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌体DNA，以DNA作为模板，按照本实施方式步骤四的方法进行LAMP扩增，将得到的4个LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。图2中M为DNA Marker，泳道1为待检样品A1(未经PMA处理的活菌)，泳道2为待检样品A2(经PMA处理的活菌)，泳道3为待检样品B1(未经PMA处理的死菌)，泳道4为待检样品B2(经PMA处理的死菌)。

从图2可看出，泳道1至泳道3均有LAMP扩增，而泳道4却未出现LAMP扩增。由此可知本实施方式的方法能够有效地抑制死菌的扩增，只检测出活菌，从而防止假阳性结果的产生。

对本实施方式的方法进行灵敏度的测试，具体如下：将浓度为1.3×10⁸cfu/mL活菌液进行10倍梯度稀释至1.3×10⁷cfu/mL、1.3×10⁶cfu/mL、1.3×10⁵cfu/mL、1.3×10⁴cfu/mL、1.3×10³cfu/mL、1.3×10²cfu/mL、1.3×10¹cfu/mL、1.3×10⁰cfu/mL、1.3×10^-1cfu/mL，之后分别取各稀释度菌液490μL添加到相同体积的1.3×10⁸cfu/mL的死菌液中，混合均匀，再加入PMA至浓度为50μmol/L，按照本实施方式步骤一的方法进行处理，然后用试剂盒法分别提取DNA作为模板，按照本实施方式步骤四的方法进行LAMP扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以死菌DNA的LAMP扩增产物作为阴性对照，得到的检测结果电泳图如图3所示。图中M是DNA Marker，泳道1是阴性对照，泳道2的浓度为6.37×10⁷cfu/mL，泳道3的浓度为6.37×10⁶cfu/mL，泳道4的浓度为6.37×10⁵cfu/mL，泳道5的浓度为6.37×10⁴cfu/mL，泳道6的浓度为6.37×10³cfu/mL，泳道7的浓度为6.37×10²cfu/mL，泳道8的浓度为6.37×10¹cfu/mL，泳道9的浓度为6.37×10⁰cfu/mL，泳道10的浓度为6.37×10^-1cfu/mL。

从图3可看出，泳道2～8都有LAMP扩增，而泳道9和10未见LAMP扩增，由此可知在单增李斯特死菌和单增李斯特活菌的混合菌液中，本实施方式的方法对活菌的检出限为6.37×10¹cfu/mL。

Claims (8)

1.一种快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法，其特征在于快速检测单增李斯特菌活菌的方法，按以下步骤进行：一、受检乳样的前处理：向1mL受检乳中加入PMA，使PMA的浓度为50μmol/L，然后置于暗处放置5～30min，接着置于距650W卤素灯15～20cm处，曝光5～30min；二、样品DNA的提取：向步骤一处理后的受检乳中加入150μL浓度为250g/L的柠檬酸钠和100μL浓度为1mol/L的氢氧化钠，然后于10000r/min离心2min，弃上清，得沉淀；三、用质量浓度为0.85％的生理盐水洗涤沉淀，然后于10000r/min离心1min，弃上清，用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，得提取物；四、以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；五、鉴定：取5μL LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法，其特征在于步骤一中置于暗处放置10～20min。

3.根据权利要求1所述的一种快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法，其特征在于步骤一中置于暗处放置15min。

4.根据权利要求1或2所述的一种快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法，其特征在于步骤一中置于距650W卤素灯15cm处。

5.根据权利要求1或2所述的一种快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法，其特征在于步骤一中置于距650W卤素灯20cm处。

6.根据权利要求4所述的一种快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法，其特征在于步骤一中曝光10～20min。

7.根据权利要求4所述的一种快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法，其特征在于步骤一中曝光5min。

8.根据权利要求6所述的一种快速检测液体乳中单增李斯特菌活菌的方法，其特征在于步骤四中LAMP扩增的反应体系为25μL反应体系，由下列成分组成：

LAMP扩增条件为：95℃5min，迅速置于4℃加入Bst酶，63℃60min，80℃2min。

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