CN105506153A - 一种检测维氏气单胞菌的试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测维氏气单胞菌的方法和试剂盒，涉及一种维氏气单胞菌的检测技术。本发明检测鱼类致病菌的试剂盒，其包含序列如SEQ？ID？NO：1～2所示的引物对，扩增来自维氏气单胞菌的基因。本发明提供的检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的检测维氏气单胞菌，且敏感性高、特异性强、耗时短，检测快速，可以用于鱼病的快速检测和预测，预防鱼病的发生，提高经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种维氏气单胞菌的检测方法和检测试剂盒。
背景技术
维氏气单胞菌为兼性厌氧且具有运动能力的革兰氏阴性杆菌，是一种重要的人畜鱼共患的致病微生物。在水产上，它主要引起水产养殖动物败血症或皮肤溃疡等局部感染，如中华鳖腐皮病、穿孔病、出血病，鲤鱼、斑点叉尾鮰等腹水病，华鳗烂尾病，泥鳅皮肤溃疡病、中华绒螯蟹等败血病。患病水产动物的死亡率高达60％～100％，造成严重的经济损失。目前，对维氏气单胞菌的临床诊断多依赖于表观病理观察、细菌的分离鉴定等一般细菌学检测，而维氏气单胞菌引发疾病的病理现象与其他气单胞菌极为相似，很难肉眼判定，常规的细菌分离鉴定又耗时耗力。
PCR技术以其敏感、特异、快速和操作简单等突出的优点而广泛应用于生命科学及预防兽医学的各个领域，特别是在分子水平上，使一些原本在诊断上十分困难的许多疾病得到了确诊。
边宇等，“维氏气单胞菌RCR快速检测方法的建立及初步应用”，中国兽药杂志，2013年01期公开了一种检测维氏气单胞菌的方法，但是其敏感度低，最低检测限度为0.158pg/μL。王惠、边宇等，“维氏气单胞菌双基因PCR检测方法的建立”公开了一种通过同时检测两个基因检测维氏气单胞菌的方法，但是其特异性有待进一步研究，敏感度也较低，最低检测限度仍然为0.158pg/μL。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的检测维氏气单胞菌的试剂盒和方法。
首先，本发明提供了SEQIDNO：1～2所示的引物对。
本发明还提供了SEQIDNO：1～2所示的引物对在制备扩增或检测来自维氏气单胞菌的基因的试剂中的用途。
本发明还提供了检测维氏气单胞菌的试剂盒，包含序列如SEQIDNO：1～2所示的引物对，扩增来自维氏气单胞菌的基因。
本发明还提供了检测维氏气单胞菌的方法，包括如下步骤：
a，提取样本DNA：提取待检样本中的DNA；
b，基因扩增：用权利要求1所述的试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增；
c，结果检测：对DNA扩增结果进行检测。
其中，步骤a所述的样本为鱼体或养殖水体。优选地，所述的鱼体为鱼体的肝脏或者肾脏。
本发明提供的试剂盒和方法可以特异的扩增维氏气单胞菌基因组中的气溶素基因序列，而不会扩增得到其他鱼类致病菌的基因片段，可以准确、有效的检测出待检样本是否感染维氏气单胞菌，特异性强，可以有效区分维氏气单胞菌与其他常见水产病原菌，且灵敏度高，最低检测限度低至0.0096pg/μl，耗时短，检测快速，可以用于鱼病的快速检测和预测，预防鱼病的发生，提高经济效益。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1引物测试结果。M：DNAMarkerI；0：空白对照；1：维氏气单胞菌15-5株；2：维氏气单胞菌15-79株；3：维氏气单胞菌15-96株；4：维氏气单胞菌吕⑦株；5：维氏气单胞菌H10株；
图2特异性检测结果。M：DNAMarkerI；0：阴性对照；1：嗜水气单胞菌；2：迟缓爱德华氏菌；3：嗜麦芽寡养单胞菌；4：无乳链球菌；5：海豚链球菌；6：霍乱弧菌；7：副溶血弧菌；8：温和气单胞菌；9：荧光假单胞菌；10：肠道沙门氏菌；11：溶藻弧菌；12：创伤弧菌；13：维氏气单胞菌；
图3灵敏度检测结果。M：DNAMarkerI；0：空白对照；1：100；2：10-1；3：10-2；4：10-3；5：10-4；6：10-5；7：10-6；8：10-7；9：10-8；
图4灵敏度检测结果。M：DNAMarkerI；0：空白对照；1：100；2：10-1；3：10-2；4：10-3；5：10-4；6：10-5；7：10-6；8：10-7；9：10-8；
图5临床样品检测结果。M：DNAMarkerI；0：空白；1：脾；2：脑；3：肾；4：肝；5：分离的维氏气单胞菌；6：阳性对照。
具体实施方式
一、实验材料和仪器
1、试验菌株
5株不同来源的维氏气单胞菌的信息如下：
维氏气单胞菌15-5株，分离自广东珠海特水所养殖场虾体，其16SrDNA序列如SEQIDNO：3所示；
维氏气单胞菌15-79株，分离自四川眉山沟鲶，其16SrDNA序列如SEQIDNO：4所示；
维氏气单胞菌15-96株，分离自四川崇州唐松云养殖池塘鲫鱼，其16SrDNA序列如SEQIDNO：5所示；
维氏气单胞菌吕⑦株，分离自广东珠海养殖场虾体.其16SrDNA序列如SEQIDNO：6所示；
维氏气单胞菌H10株，分离自海南对虾养殖场虾体，其16SrDNA序列如SEQIDNO：7所示。
2、主要试剂
细菌DNA抽提试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP302。
实施例1引物设计
一、实验方法
1、PCR引物设计与合成
根据维氏气单胞菌气溶素基因序列设计一对引物(表1)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表1PCR引物
2、模板制备
分别取5株不同来源的维氏气单胞菌(通过16SrDNA序列确定为维氏气单胞菌)，使用天根生化科技有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒(提取基因组DNA，作为模板。
3、PCR扩增和检测
PCR扩增体系如表2所示。
表2PCR扩增体系
| 反应物 | 体积 |
| 2×PCR Mix | 12.5μl |
| 10μM Weishi1F/Weishi1R | 各0.25μl |
| 模板 | 2μl |
| ddH2O | 10μl |
PCR扩增程序：95℃预变性5min后，进行如下循环：95℃，30sec，62℃，30sec，72℃，30sec，38个循环后，72℃延伸5min。
取5μL扩增产物，采用1％的琼脂糖凝胶，在恒压80V条件下电泳60min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。PCR阳性扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
二、结果
结果如图1所示，本发明引物对5株不同来源的维氏气单胞菌均能扩增出309bp大小的片段，与预期结果一致(如图1)。扩增出的片段经测序比对，确认是维氏气单胞菌气溶素基因序列。
试验结果说明，本发明引物可以准确扩增维氏气单胞菌的气溶素基因。
实施例2引物特异性试验
一、试验方法
1、PCR引物
同实施例1。
2、模板制备：
分别取嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、无乳链球菌、海豚链球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、温和气单胞菌、荧光假单胞菌、肠道沙门氏菌、溶藻弧菌、创伤弧菌和维氏气单胞菌，使用天根生化科技有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，作为模板。
3、PCR扩增和检测
同实施例1。
二、结果
结果如图2所示，除阳性样品(维氏气单胞菌)可以扩增出309bp大小的靶标条带外，包括气单胞菌属细菌在内的12株其它常见水产病原菌即嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、无乳链球菌、海豚链球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、温和气单胞菌、荧光假单胞菌、肠道沙门氏菌、溶藻弧菌、创伤弧菌均无条带。
本实施例证明了本发明提供的检测方法特异性强，可以准确的将维氏气单胞菌与其他水产致病菌准确的区别开，可准确检测待检样本中是否感染维氏气单胞菌。
实施例4引物敏感性试验
一、试验方法
1、PCR引物
同实施例1。
2、模板制备：
菌体灵敏度：对维氏气单胞菌的过夜培养物进行平板计数，并按照原浓度的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍进行梯度稀释，分别使用天根生化科技有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
DNA灵敏度：取维氏气单胞菌，使用天根生化科技有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，对提取的维氏气单胞菌DNA进行浓度测定，并按照原浓度的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍进行梯度稀释。
3、PCR扩增和检测
同实施例1。
二、结果
菌体灵敏度测试电泳结果如图3所示，对各稀释梯度的维氏气单胞菌菌液，采用建立的方法进行PCR扩增，能检测到原浓度10-6倍的菌悬液，经平板计数确定，该方法的检测限可达2.5cfu/25μl体系。
DNA灵敏度测试电泳结果如图4所示，对各稀释梯度的维氏气单胞菌DNA，采用建立的方法进行PCR扩增，能检测到原浓度10-6倍的DNA溶液，经计算，该方法的检测限可达0.24pg/25μl体系(即0.0096pg/μl)。
本实施例证明了本发明提供的维氏气单胞菌的检测方法灵敏度高。
实施例5组织样品检测
一、实验方法
1、PCR引物
同实施例1。
2、模板制备：
对含菌临床样品(通威水产研究所实验鱼池患病斑点叉尾鮰)，取脾、脑、肾、肝及分离的维氏气单胞菌，使用天根生化科技有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。以维氏气单胞菌15-5株DNA作为阳性对照。
3、PCR扩增和检测
同实施例1。
二、结果
PCR结果如图4所示，阳性对照出现条带，空白对照未出现条带，分离的维氏气单胞菌以及肾、肝出现条带。
试验结果说明，本发明方法可以准确检测待检样本中的维氏气单胞菌。
综上，本发明提供的试剂盒和方法可以特异扩增维氏气单胞菌，可以准确、有效的检测出待检样本是否感染维氏气单胞菌，同时，敏感性高、特异性强、耗时短，检测快速，应用前景良好。
Claims (6)
1.SEQIDNO：1～2所示的引物对。
2.SEQIDNO：1～2所示的引物对在制备扩增或检测来自维氏气单胞菌的基因的试剂中的用途。
3.一种检测维氏气单胞菌的试剂盒，其特征在于：包含序列如SEQIDNO：1～2所示的引物对，扩增来自维氏气单胞菌的基因。
4.一种检测维氏气单胞菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：
a，提取样本DNA：提取待检样本中的DNA；
b，基因扩增：用权利要求1所述的试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增；
c，结果检测：对DNA扩增结果进行检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤a所述的样本为鱼体或养殖水体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的鱼体为鱼体的肝脏或者肾脏。
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