CN102965438B - 一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重pcr检测引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测引物组、试剂盒及方法，通过设计的两对特异性引物和优选的反应体系、反应条件，可快速、准确检测致病性鳢源舒伯特气单胞菌，为实验室进一步研究该菌及其致病机理奠定了基础。本发明突出的优点是建立的多重PCR反应，敏感性强、特异性高，可以快速、准确地检测出样品中的致病性鳢源舒伯特气单胞菌，同时避免了反复培养、冗长的一系列生化反应，节约时间、劳动能力和成本。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测引物组、试剂盒及方法。
背景技术
鳢科鱼类（Channidae）是我国重要的淡水经济鱼类，在我国分布广泛，其肉质细嫩，味道鲜美，具有较高的营养价值，其中斑鳢(Channa maculata)和乌鳢(Channa argus)和以斑鳢为母本，乌鳢为父本杂交获得杂交鳢(Channa maculata♀ × C. argus♂)均是我国重要的养殖品种，也是我国外贸出口的重要淡水经济鱼类。随着我国池塘鳢科鱼类高密度养殖的发展，养殖鳢科鱼类病害的问题越来越严重，导致鳢科鱼类发病病原包括嗜水气单胞菌、诺卡氏菌、舒伯特气单胞菌等。鳢内脏类结节病是近年来新暴发的鳢科鱼类细菌性病，该病的特点是病鱼体表无明显变化，肝、脾、肾等内脏组织出现白色类结节症状，死亡率可达45%以上，通过分离鉴定确定该病的致病菌为舒伯特气单胞菌。自2009年首次报道以来，鳢内脏类结节病在全国范围内均有发生，近几年该病导致湖北省养殖乌鳢、广东省养殖斑鳢和杂交鳢大面积死亡，造成严重的经济损失。由于该病与鳢科鱼类另一主要疾病诺卡氏菌引起的结节病症状相似，养殖过程中容易误诊，错过最佳治疗时机。
因此，研发一种能快速、准确地检测致病性鳢源舒伯特气单胞菌的方法对于实验室进一步研究该菌及其致病机理具有极其重要的意义。
发明内容
针对现有技术所存在的问题，本发明的一个目的在于提供一组能快速、准确地对致病性鳢源舒伯特气单胞菌进行检测的双重PCR检测引物组。
本发明的另一个目的在于提供一种能快速、准确地对致病性鳢源舒伯特气单胞菌进行检测的双重PCR检测试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供一种能快速、准确地对致病性鳢源舒伯特气单胞菌进行检测的双重PCR检测方法。
本发明所采用的技术方案为：
一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测引物组，包括检测促旋酶的B亚单位基因（gyrB）的引物对和检测溶血素基因（hlyA）的引物对，序列分别如下：
gyrB引物对：
上游引物：TCAACTCCGCTGTCTCTAACCTG（SEQ ID NO.1），
下游引物：GCACCCTTACGGCAAGTCATC（SEQ ID NO.2）；
hlyA引物对：
上游引物：CAGGCTTCCAGCACTGAATACT（SEQ ID NO.3），
下游引物：CCAGTCCCACCACTTCACCT（SEQ ID NO.4）。
一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测试剂盒，包括：上述的检测引物组、10×PCR buffer、dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶、阳性质控品、阴性质控品。
所述阳性质控品为含有gyrB基因序列（GenBank登录号JQ319030）的T载体克隆和含有hlyA基因序列（GenBank登录号JX996182）的T载体克隆，阴性质控品为无菌ddH2O。
一种检测致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR方法，包括以下步骤：
1) 从待检鳢的组织器官分离细菌；
2) 以分离菌株为模板，使用分别根据舒伯特气单胞菌的促旋酶的B亚单位基因（gyrB）、溶血素基因（hlyA）基因序列设计合成的两对引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物，其中引物序列如下：
gyrB引物对：
上游引物：TCAACTCCGCTGTCTCTAACCTG（SEQ ID NO.1），
下游引物：GCACCCTTACGGCAAGTCATC（SEQ ID NO.2）；
hlyA引物对：
上游引物：CAGGCTTCCAGCACTGAATACT（SEQ ID NO.3），
下游引物：CCAGTCCCACCACTTCACCT（SEQ ID NO.4）；
3）扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，然后根据电泳结果进行判定，其中gyrB扩增产物长601 bp，hlyA扩增产物长375 bp。
所述双重PCR反应体系为：待检菌液模板或阳性质控品或阴性质控品2μl，10×buffer 2.5μl，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 0.125μL，MgCl2（250 mmol/L）1.5μL，gyrB上下游引物（20μmol/L）各0.4μL，hlyA上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，ddH2O补齐至25 μl。
所述双重PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，55-58℃ 30s，72℃ 30s，反应30-35次循环；72℃ 10min。
优选的，退火温度为56℃。
优选的，反应循环数为30次。
本发明是以促旋酶的B亚单位基因（gyrB）和溶血素基因（hlyA）为靶基因设计了两对针对致病性鳢源舒伯特气单胞菌的高度特异性引物。
gyrB基因是单拷贝的看家基因，平均碱基替换率为每100万年变化0.7%~0.8%，比16S rDNA的每5000万年变化1%的速度要快，而且不发生水平转移，并普遍存在于各种细菌中。本发明人通过前期实验验证gyrB基因比16S rRNA在区分和鉴定舒伯特气单胞菌及其近缘种上具有更显著的优势。
hlyA基因最早是Aoki等（1991）从罐装牛奶中分离的嗜水气单胞菌ATCC7966 菌株中克隆出来的。该基因在嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌等气单胞菌属菌株中均有分布。舒伯特气单胞菌在毒力基因方面的研究还很少，目前仅有Chen等（2012）从感染斑鳢的舒伯特气单胞菌中克隆了hlyA基因；本发明人所在实验室从患病鳢中分离的舒伯特气单胞菌中克隆了hlyA基因（Genbank登陆号：JX996182）。研究发现气单胞菌属模式菌株嗜水气单胞菌基因表达的溶血素对宿主的破坏力非常强，所以对于毒力嗜水气单胞菌的早期预测及防治变得尤为重要。Micheal 等（1999）对临床和环境（其中包括鱼源）中的 A. hydrophila 进行研究，96%菌株呈 hlyA 阳性，认为所有的毒力嗜水气单胞菌株是 hlyA阳性。
本发明经多次筛选后，以鳢源舒伯特气单胞菌的gyrB基因和hlyA基因为靶基因，设计了两组高特异性的检测引物，并由其建立起的双重PCR检测试剂盒、检测方法敏感性强、特异性高，可以快速、准确地检测致病性鳢源舒伯特气单胞菌。同时避免了反复培养、冗长的一系列生化反应，节约时间、劳动能力和成本。
附图说明
图1为特异性试验电泳图谱（M为DNA Marker，1-12依次为WL-2，温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、诺卡氏菌、迟缓爱德华菌、荧光假单胞菌、柱状黄杆菌、哈氏弧菌、类志贺邻单胞菌、大肠杆菌和阴性对照）；
图2为敏感性试验电泳图谱（M为DNA Marker，1-7分别为WL-2的模版菌落个数分别为3×100，3×101，3×102，3×103，3×104，3×105，3×106，8为阴性对照）；
图3为病料检测试验电泳图谱（1-21依次为21个待检测菌株，22为阳性质控品，23为阴性质控品）。
具体实施方式
下面结合具体实施案例进一步描述本发明，但并不局限于此，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
引物的设计：根据GenBank中WL-2的gyrB基因序列（GenBank登录号JQ319030）和hlyA基因序列（GenBank登录号JX996182），设计和筛选出两对特异性片段引物。各引物序列和预期扩增片段长度如下：
实施例1
1. 试验用菌株
鳢源致病性舒伯特气单胞菌分离株WL-2（其分离、鉴定方法参见文献：杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)内脏类结节病病原菌的分离、鉴定与特性分析[J]，刘春等，水产学报，2012年07期），温和气单胞菌，嗜水气单胞菌，无乳链球菌，诺卡氏菌，迟缓爱德华菌，荧光假单胞菌，柱状黄杆菌，哈氏弧菌，大肠杆菌由本发明人所在实验室（中国水产科学研究院珠江水产研究所水产病害与免疫研究室）分离、鉴定和保存。
2. 细菌的培养
舒伯特气单胞菌分离株WL-2、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、迟缓爱德华菌、荧光假单胞菌、类志贺邻单胞菌采用脑心浸液琼脂平板28℃恒温培养24h；诺卡氏菌采用脑心浸液琼脂平板28℃恒温培养5d；柱状黄杆菌采用0.05％胰蛋白胨琼脂平板28℃恒温培养48h；哈氏弧菌采用胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板28℃恒温培养24h；大肠杆菌采用LB肉汤琼脂平板37℃恒温培养24h。各培养的细菌经0.65%无菌生理盐水洗涤到1.5 mL离心管中，调节菌液浓度到1×106CFU/mL。无菌ddH2O作为阴性对照模板。
3. 双重PCR扩增
联合使用gyrB和hlyA上下游引物进行双重PCR扩增。反应体系为50μl：0.2 ml的PCR反应管中加入菌液模板2μl，10×buffer 5μl，MgCl2（25mmol/L）3μl，gyrB和hlyA上下游引物（25μmol/L）各1μl，dNTP （2.5mmol/L）8μl，Taq酶（10U/μl）0.25μl，ddH2O补齐至50μl。扩增条件为： 使用95℃ 5min预变性，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，30个循环，72℃延伸10min的PCR条件。
PCR扩增后的产物，用10g/L的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳25min，用凝胶成像系统观察并拍照。
4. 特异性试验
用上述双重PCR方法对舒伯特气单胞菌分离株WL-2、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、诺卡氏菌、迟缓爱德华菌、荧光假单胞菌、类志贺邻单胞菌、柱状黄杆菌、哈氏弧菌、大肠杆菌的菌液进行扩增，阴性对照以ddH2O为模板。评价该双重PCR法鉴别检测的特异性。结果显示采用上述双重PCR方法，WL-2株扩增出601bp条带和375bp，其他模板均无条带。阴性对照也没有任何条带出现，如图1所示，其中M为DNA Marker，1-12依次为WL-2，温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、诺卡氏菌、迟缓爱德华菌、荧光假单胞菌、柱状黄杆菌、哈氏弧菌、类志贺邻单胞菌、大肠杆菌和阴性对照的扩增结果。
5. 敏感性试验
用麦氏比浊仪测定WL-2株的浓度，再进行10倍梯度稀释。对不同浓度模板进行双重PCR扩增后，电泳显示在菌落个数为3×102时，依然可以观察到清晰的两条特异性目的条带，菌落个数为3×100时，还可以观察到601bp特异性带，表明双重PCR反应能检测细菌的最低含量为102，如图2所示，其中M为DNA Marker，1-7分别为WL-2的模版菌落个数分别为3×100，3×101，3×102，3×103，3×104，3×105，3×106，8为阴性对照。
实施例2
1. 病料采集
从广州市和佛山市收集病鱼，分离到菌株样品21份。
2. 病料检测
运用实施例1中所述双重PCR方法对21个分离菌株进行检测，以含有gyrB基因序列（GenBank登录号JQ319030）的T载体克隆和含有hlyA基因序列（GenBank登录号JX996182）的T载体克隆为阳性质控品，无菌ddH2O作为阴性质控品。
含gyrB基因序列T载体克隆的制备：以舒伯特气单胞菌分离株WL-2为模板，利用gyrB引物对（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）进行PCR扩增，得到601bp的扩增产物，经测序与GenBank登录号JQ319030的序列相符，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中。
含hlyA基因序列T载体克隆的制备：以舒伯特气单胞菌分离株WL-2为模板，利用hlyA引物对（SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4）进行PCR扩增，得到375bp的扩增产物，经测序与GenBank登录号JX996182的序列相符，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中。
将含gyrB基因序列的T载体克隆与含hlyA基因序列的T载体克隆等量混合，即为阳性质控品。
结果2和11两份样品扩增出特异性目的条带，如图3所示，其中1-21依次为21个待检测菌株，22为阳性质控品，23为阴性质控品的扩增结果。将21份分离菌株通过传统的微生物生理生化鉴定技术结合16S rDNA分子生物学方法鉴定后，验证出双重PCR检测方法的准确性为100%。
以上实施例均表明，本发明针对鳢源舒伯特气单胞菌的特异性靶基因所设计的两组高特异性的检测引物，并由其建立起的双重PCR检测试剂盒、检测方法敏感性强、特异性高，可以快速、准确地检测致病性鳢源舒伯特气单胞菌。
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测引物组、试剂盒及方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcaactccgc tgtctctaac ctg 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcacccttac ggcaagtcat c 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caggcttcca gcactgaata ct 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccagtcccac cacttcacct 20
Claims (2)
1.一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测引物组，包括检测gyrB基因的引物对和检测hlyA基因的引物对，序列分别如下：
gyrB引物对：
上游引物：TCAACTCCGCTGTCTCTAACCTG（SEQ ID NO.1），
下游引物：GCACCCTTACGGCAAGTCATC（SEQ ID NO.2）；
hlyA引物对：
上游引物：CAGGCTTCCAGCACTGAATACT（SEQ ID NO.3），
下游引物：CCAGTCCCACCACTTCACCT（SEQ ID NO.4）。
2.一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测引物组。
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