CN110184282A - 猪圆环病毒3型全基因组扩增方法及其pcr引物 - Google Patents

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张学贤
马良
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Abstract

本发明公开了猪圆环病毒3型全基因组扩增方法及其PCR引物。发明所述的猪圆环病毒3型全基因组序列如Seq ID No.1所示。扩增本发明所公布的猪圆环病毒3型全基因组序列所用引物包括P1 5‑ACCCAGGACAAAGCCTCTTC‑3、P2 5‑GGGTGAGCGCTGGTAGTTCC‑3、P3 5‑ATAAGATACTAAAGATGAAAGTTACAC‑3和P4 5‑TTAGAGAACGGACTTGTAACG‑3。本发明所提供的引物P1/P2可直接扩增出猪圆环病毒3型全基因组序列，引物P3/P4扩增出的目的片段序列对引物P1和P2作用位置序列进行补充和修正即可。本发明所述猪圆环病毒3型全基因组序列及特异性检测引物为该病毒的流行病学调查，遗传进化分析等提供了有效的支持。

Description

猪圆环病毒3型全基因组扩增方法及其PCR引物
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及猪圆环病毒3型全基因组测序引物及方法。
背景技术
猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是圆环病毒科圆环病毒属的重要成员。是现在已知的最小的单股环状DNA病毒，该病毒无囊膜对环境抵抗力较强。已分离到毒株并明确分型的有两个基因型：无致病性的1型(PCV1)和具有致病性的2型(PCV2)，PCV2主要损害猪体免疫系统，导致免疫抑制，给世界养猪业造成了巨大损失，与PCV2相关的疾病有仔猪断奶后多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、繁殖障碍、呼吸系统疾病和肠道疾病等。
2015年6月，美国北卡罗来纳州一个商品化猪场暴发了皮炎肾病综合征(PDNS)，母猪死亡率同比往年平均水平增加了10.2％，受孕率下降了0.6％，窝均木乃伊胎同比往年平均水平增加了1.19％。死亡母猪表现出典型PDNS。但所有母猪组织样品，包括肾脏，淋巴结，肺脏和皮肤组织样品，通过免疫组化(IHC)和实时荧光定量PCR(qPCR)检测未发现PCV2，PRRSV和IAV；此外，用qPCR检测胎儿组织，均均呈PCV2，PRRSV和PPV阴性。后用宏基因组测序在发病猪病料中发现了一种新型圆环病毒，命名为PCV3。PCV3基因组包含2000个碱基，具有与PCV1和PCV2类似的基因组结构，主要编码cap和rep两个蛋白。之后我国研究学者通过PCR检查方法发现，PCV3在我国猪群中也存在着广泛分布，截止目前世界范围内尚未有分离到毒株的报道，PCR检查是目前主要的检测手段。
CN106929607A公开了一种检测猪圆环病毒3型病毒的引物对、方法及试剂盒，具体公开了：根据参考比对GenBank中所有PCV3Rep基因序列，选择特定核苷酸序列作为扩增区域，设计了一对用于检测猪圆环病毒3型的SYBR Green I荧光定量RT-PCR引物，建立了特异、灵敏、稳定、可靠的PCV3SYBR GreenRT-qPCR检测系统，操作简单可靠，有利于疾病的及时诊断治疗。
徐朋丽等，2017，中国预防兽医学报，公开了猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及应用，具体公开了：为建立一种用于检测猪圆环病毒3型(PCV3)的PCR方法，针对GenBank中PCV3全基因序列在其保守区设计一对特异性引物，并优化反应条件，建立了PCV3的PCR检测方法。结果显示，该PCR方法仅对PCV3检测为阳性，而对其它常见病原的DNA模板均无扩增。对PCV 3的最低检出量为61.9拷贝/μL。结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性。通过该方法对133份临床样品进行检测，结果显示PCV3阳性率为29％(38/133)，表明PCV3在河南地区已有流行。该方法的建立使PCV3的检测更为快速、简便、经济、实用，为PCV3感染的早期诊断提供了有力的技术支持。
Ku et al.,2017,Transbound Emerg Dis,公开了中国PCV3的鉴定和遗传表征，具体公开了，用两对引物扩增出了PCV3的全基因组。
CN106929607A所公开的检测猪圆环病毒3型的SYBR Green I荧光定量RT-PCR引物虽然在检测PCV3时较为灵敏，但却无法扩增PCV3全基因，不能用于PCV3的全基因遗传进化分析。徐朋丽等，2017，中国预防兽医学报，公开的猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及应用中，PCR所扩增出目的片段为270bp，仅可用于PCV3的检测，无法用于PCV3的全基因遗传进化分析。Ku et al.,2017,Transbound Emerg Dis,公开的中国PCV3的鉴定和遗传表征，该文献通过对PCV3分段扩增，需要拼接处理才能得到其全病毒基因序列。
因此，需要提供一种更简单，更高效的测定PCV3全基因组的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种猪圆环病毒3型的全基因组检测引物及方法，并通过该方法得到了猪圆环病毒3型全基因组序列，该方法特异性强、方便、快捷，适合临床和研究应用。
本发明提供的猪圆环病毒3型全基因组序列如Seq ID No.1所示。
本发明还提供了一对用于扩增猪圆环病毒3型全基因组序列的引物，其为：
P1：5-ACCCAGGACAAAGCCTCTTC-3(Seq ID No.2)；
P2：5-GGGTGAGCGCTGGTAGTTCC-3(Seq ID No.3)。
本发明还提供了一对修正引物，用所述引物的扩增片段对P1、P2引物作用位置进行修正，其序列为：
P3：5-ATAAGATACTAAAGATGAAAGTTACAC-3(Seq ID No.4)；
P4：5-TTAGAGAACGGACTTGTAACG-3(Seq ID No.5)。
本发明还提供了一种测定猪圆环病毒3型全基因组序列的方法，其包括如下步骤：
1)提取携带猪圆环病毒3型的猪病料DNA；
2)用所述引物P1/P2对提取的病料DNA进行猪圆环病毒3型全基因组PCR扩增，用所述引物P3/P4对提取的病料DNA进行PCR扩增；
3)对所述引物P1/P2扩增的片段和所述引物P3/P4扩增的片段分别进行测序；
4)利用序列分析软件对P1/P2引物扩增的全基因序列进行分析，结合P3/P4引物扩增得到的修正序列对P1/P2引物作用位置进行修正，得到猪圆环病毒3型全基因组序列。
其中，所述PCR扩增程序均为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min30s，共35个循环，最后72℃延伸7min。
优化的PCR反应体系均为：2×Prime STAR GC Buffer(Mg2+plus)12.5μL，dNTPMixture(2.5mM each)2μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，Prime STAR HS DNAPolymerase(2.5U/μL)0.25μL，DNA 2μL，DDH2O 6.25μL，共25μL。
一种体外检测猪圆环病毒3型的方法，其包括如下步骤：
1)提取待检病料DNA；
2)用所述引物P1/P2对提取的病料DNA进行猪圆环病毒3型全基因组PCR扩增；
3)对扩增的片段进行测序，得到猪圆环病毒3型全基因组序列。
本发明所提供的引物P1/P2位于猪圆环病毒3型ORF2序列范围内的保守位置，为了保证能够扩有效增出猪圆环病毒3型全病毒序列，在引物P1/P2的5’端有4bp的碱基重复，因此扩增出序列比猪圆环病毒3型全基因2000bp多4个碱基，得到的目的片段为2004bp，序列分析时只需在所测序列的基础上减去重复的4个碱基即可。
本发明所提供的P1/P2引物可直接扩增出PCV3全基因序列，之后只需通过P3/P4引物扩增片段对P1/P2引物作用位置进行修正即可，该发明所提供的PCV3全基因检测引物及方法在PCV3的全基因测序及遗传进化分析应用中极为方便。
本发明所提供的引物P3/P4扩增序列能够对引物P1/P2作用位置序列进行有效校准，确保得到的猪圆环病毒3型全基因序列为其天然全基因序列。
附图说明
图1所示为猪圆环病毒3型全基因组序列扩增示意图。
图2所示为引物P1/P2所扩增片段的1％琼脂糖凝胶电泳图。图1中M为Trans2KPlus II DNA Marker，1为引物P1/P2所扩增片段，N为阴性对照。
图3所示为引物P3/P4所扩增片段的1％琼脂糖凝胶电泳图。图2中M为DL2000DNAMarker，2为引物P3/P4所扩增片段，N为阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1扩增猪圆环病毒3型全基因组序列
(1)主要试剂及仪器
EasyPure Viral DNA/RNA Kit(ER201-01)、Trans2K Plus II DNA Marker(BM121-02)、EasyPure Quick Gel Extraction Kit(EG101)、pEASY-Blunt SimpleCloning Vector(CB111-02)、Trans1-T1Phage Resistant感受态细胞(CD501-02)均购自北京全式金生物技术有限公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer、6×Loading Buffer(9156)均购自Takara公司；快速质粒小提试剂盒(DP105)购自天根生化科技(北京)有限公司；PCR仪(ABI Veriti 96孔梯度PCR仪)；DYCP-31DN型琼脂糖水平电泳仪购自北京市六一仪器厂等。
(2)引物的设计与合成
参考NCBI上已公布的猪圆环病毒3型全基因序列(GenBank登录号:KT869077、KX778720、KX898030、KX966193、KY354038、KY354039)KF039891)，在猪圆环病毒3型ORF2保守序列处设计特异性引物P1/P2和P3/P4。
P1 5-ACCCAGGACAAAGCCTCTTC-3
P2 5-GGGTGAGCGCTGGTAGTTCC-3；
P3 5-ATAAGATACTAAAGATGAAAGTTACAC-3
P4 5-TTAGAGAACGGACTTGTAACG-3
引物P1/P2可扩增出长度为2004bp的目的片段，引物P3/P4可扩增出长度为404bp的目的片段，引物送北京六合华大基因科技有限公司合成，引物稀释为10μM浓度，-20℃冰箱保存备用。
(3)猪脾脏病料DNA的提取
取少量采集自江苏省某猪场的猪脾脏病料加适量PBS液充分研磨后，反复冻融3次，12000rpm，离心5min，取200μL上清液按照北京全式金生物技术有限公司EasyPureViral DNA/RNA Kit(ER201-01)病毒基因提取试剂盒说明书进行病毒DNA的提取。将提好的病毒DNA溶解于40μL已高压灭菌的DDH2O中，-20℃冰箱保存备用。
猪圆环病毒3型基因片段的PCR扩增
用引物P1/P2和P3/P4分别对制备好的病料DNA进行PCR扩增，扩增时两对引物的PCR反应体系均为：
扩增时两对引物的PCR反应程序可采用下面同一程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min30s，共35个循环，最后72℃延伸7min。
目的片段的回收与连接
回收引物P1/P2和P3/P4PCR扩增目的片段时，均用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit(EG101)胶回收试剂盒进行目的片段的回收。最终两个回收的PCR扩增片段均用30μL已高压灭菌的DDH2O进行洗脱。
纯化后目的条带分别与pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(CB111-02)载体连接，体系及反应条件均为：目的条带4μL，载体1μL，25℃作用20min，收样暂置于冰上。
连接产物转化感受态细胞
取两种连接产物5μL，分别加入Trans1-T1Phage Resistant感受态细胞50μL中，冰浴30min，42℃热激45s，立即冰浴2min；补加950μL无抗性LB培养基，37℃220rpm，摇菌培养1h；再3000rpm离心5min，弃去800μL上清，将剩余菌体重悬，取50μL涂LB/Amp/X-Gal/IPTG平板，37℃过夜培养。
(7)阳性克隆的鉴定与质粒提取
取过夜培养的转化平板，挑取白色菌斑，分别用引物P1/P2和P3/P4进一步按照(4)PCR反应条件鉴定为PCV3阳性后，用天根生化科技(北京)有限公司的快速质粒小提试剂盒(DP105)提取阳性菌液质粒，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
(8)序列分析
用Lasergene序列分析软件对P1/P2引物扩增克隆全基因序列进行分析，结合P3/P4引物扩增克隆得到的修正序列，得到猪圆环病毒3型全基因组序列，具体猪圆环病毒3型全基因组序列如Seq ID No.1所示，通过序列比对确定其为猪圆环病毒3型全基因组序列。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心
福州大北农生物技术有限公司
北京科牧丰生物制药有限公司
北京大北农科技集团股份有限公司
<120> 猪圆环病毒3型全基因组扩增方法及其PCR引物
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2000
<212> DNA
<213> Porcine circovirus
<400> 1
acccggcacc tcggaacccg gatccacgga ggtctgtagg gagaaaaagt ggtatcccat 60
tatggatgct ccgcaccgtg tgagtggata taccgggcag tggatgatga agcggcctcg 120
tgttttgatg ccgcaggacg gggactggat aactgagttt ttgtggtgct acgagtgtcc 180
tgaagataag gacttttatt gtcatcctat tctaggtccg gagggaaagc ccgaaacaca 240
ggtggtgttt tacgataaac aactggaccc cgaccgagtg ggaatctatt gtggagtgtg 300
gaggcagtat agcgagatac cttattatcg gcaaagaggt tggaaaaagc ggtaccccac 360
acttgcaagg gtacgtgaat ttcaagaaca aaaggcgact cagctcggtg aagcgcttac 420
ccggatttgg tcgggcccat ctggagccgg cgagggggag ccacaaagag gccagcgagt 480
attgcaagaa agagggggat tacctcgaga ttggcgaaga ttcctcttcg ggtaccagat 540
cggatcttca aacagcagct cggattctga cggagacgtc gggaaatctg actgaagttg 600
cggagaagat gcctgcagta tttatacgct atgggcgggg tttgcgtgat ttttgcgggg 660
tgatggggtt gggtaaacct cgtgatttta aaactgaagt ttatgttttt attggtcctc 720
caggatgcgg gaaaacgcgg gaagcttgtg cggatgcggc tgcgcgggaa ttgcagttgt 780
atttcaagcc acgggggcct tggtgggatg gatataatgg ggagggtgct gttattctgg 840
atgattttta tgggtgggtt ccatttgatg aattgctgag aattggggac aggtaccctc 900
tgagggttcc tgttaagggt gggtttgtta attttgtggc taaggtatta tatattacta 960
gtaatgttgt accggaggag tggtattcat cggagaatat tcgtggaaag ttggaggcct 1020
tgtttaggag gttcactaag gttgtttgtt ggggggaggg gggggtaaag aaagacatgg 1080
agacattgta tccaataaac tattgatttt atttgcactt gtgtacaatt attgcgttgg 1140
ggtgggggta tttattggga gggtgggtgg gcagccccct agccacggct tgtcgccccc 1200
accgaagcat gtgggggatg gggtccccac atgcgagggc gtttacctgt gcccgcaccc 1260
gaagcgcagc gggagcgcgc gcgaggggac acggcttgtc gccaccggag gggtcagatt 1320
tatatttatt ttcacttaga gaacggactt gtaacgaatc caaacttctt tggtgccgta 1380
gaagtctgtc attccagttt tttccgggac ataaatgctc caaagcagtg ctccccattg 1440
aacggtgggg tcatatgtgt tgagccatgg ggtgggtctg gagaaaaaga agaggctttg 1500
tcctgggtga gcgctggtag ttcccgccag aagtggtttg ggggtgaagt aacggctgtg 1560
ttttttttta gaagtcataa ctttacgagt ggaactttcc gcataagggt cgtcttggag 1620
ccaagtgttt gtggtccagg cgccgtctag atctatggct gtgtgcccga acatagtttt 1680
tgtttgctga gccggagaaa ttacagggct gagtgtaact ttcattttta gtatcttata 1740
atattcaaag gtaattgcag tttcccattc gtttaggcgg gtaatgaagt ggttggcgtg 1800
ccagggcttg ttattctgag gggttccaac ggatatgacg ttcatcgtgg agtatttctt 1860
tgtgtagtat gtgccagctg tgggcctcct aatgaatagt cttcttctgg catagcgcct 1920
tctgtggcgt cgtcgtctcc ttgggcgggg tcttcttctg aatatagctc tgtgtctcat 1980
tttggtgccg ggctagtatt 2000
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Porcine circovirus
<400> 2
acccaggaca aagcctcttc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Porcine adenovirus
<400> 3
gggtgagcgc tggtagttcc 20
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Porcine adenovirus
<400> 4
ataagatact aaagatgaaa gttacac 27
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Porcine adenovirus
<400> 5
ttagagaacg gacttgtaac g 21

Claims (5)

1.一种猪圆环病毒3型全基因组，其序列如Seq ID No.1所示。
2.一对用于扩增猪圆环病毒3型全基因组的引物，其为：
P1：5-ACCCAGGACAAAGCCTCTTC-3(Seq ID No.2)；
P2：5-GGGTGAGCGCTGGTAGTTCC-3(Seq ID No.3)。
3.一对修正引物，用所述引物的扩增片段对权利要求2所述的P1、P2引物作用位置进行修正，其序列为：
P3：5-ATAAGATACTAAAGATGAAAGTTACAC-3(Seq IDNo.4)；
P4：5-TTAGAGAACGGACTTGTAACG-3(Seq ID No.5)。
4.一种测定猪圆环病毒3型全基因组序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取携带猪圆环病毒3型的猪病料DNA；
2)用权利要求2所述引物对提取的病料DNA进行猪圆环病毒3型全基因组PCR扩增，用权利要求3所述引物对提取的病料DNA进行PCR扩增；
3)对权利要求2所述引物扩增的片段和权利要求3所述引物扩增的片段分别进行测序；
4)利用序列分析软件对P1/P2引物扩增的全基因序列进行分析，结合P3/P4引物扩增得到的修正序列对P1/P2引物作用位置进行修正，得到猪圆环病毒3型全基因组序列。
5.一种体外检测猪圆环病毒3型的方法，其包括如下步骤：
1)提取待检病料DNA；
2)用权利要求2所述引物对提取的病料DNA进行猪圆环病毒3型全基因组PCR扩增；
3)对扩增的片段进行测序，得到猪圆环病毒3型全基因组序列。
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