CN104673936A - 猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法及其引物和TaqMan探针 - Google Patents

猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法及其引物和TaqMan探针 Download PDF

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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明提供一种猪传染性胃肠炎病毒N基因的RT-qPCR检测方法及其引物和TaqMan探针。具体地，本发明提供一组猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法，采用如序列表SEQ ID No.1所示上游引物，如序列表SEQ ID No.2所示的下游引物以及如序列表SEQ ID No.3所示的TaqMan探针序列。本发明提供了基于上述引物和TaqMan探针的猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法，该检测方法具有良好的检测敏感性，1×105copies/μL-1×101copies/μL时，Ct值与荧光值呈典型的扩增曲线。同时，该检测方法的重复性好、特异性强，操作方便。

Description

猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法及其引物和TaqMan探针
技术领域
本发明涉及猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR的引物、TaqMan探针及其应用。
背景技术
猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种高度接触传染性肠道疾病，临床上以病猪呕吐、严重腹泻和失水为主要特征，不同品种、年龄的猪只都可感染发病，尤以两周龄以内仔猪、断奶仔猪易感性最强，致死率可高达100％。该病是一种世界性疾病，给畜牧业生产带来巨大的经济损失，早发现、早确诊对该病的防治意义重大。
目前，检测TGEV的常规检测方法主要包括以下几类：
1.病原学检测，如病毒的分离鉴定、电镜检测、免疫荧光法和免疫过氧化物酶法等，但病原学检测在实际的生产和应用中存在较多局限，如TGEV的病毒通常的分离通常只能在具有先进配置的实验室进行周期长，且还需通过其它检测手段进行鉴定，而免疫荧光法和免疫过氧化物酶法等同样存在操作过程复杂、耗时长等问题。
2.血清学检测，如血清中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、检测免疫球蛋白特异性抗体的间接免疫过氧化物酶试验等。血清学检测通常是采用间接鉴定，即需先制备TGEV病毒的抗体，所以存在着较严重的非特异性或漏检等问题。
3.分子诊断技术，包括：核酸探针杂交技术、聚合酶链式反应(RT-PCR)技术、多重RT-PCR、RT-nPCR和荧光定量PCR等方法。PCR操作简便，可以判定样品中是否有TGEV的存在，这种方法较已知的、传统的血清学和免疫学方法的优势在于可以免去病毒分离过程，快速准确，有较高的特异性和敏感性。
目前TGEV的荧光定量PCR检测方法，如CN201110068834.2提供的“猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法及其引物”以及CN201110068834.2提供的“一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法”。该两检测方法针对的均是TGEV病毒的S基因的两步法，即先反转录再进行荧光定量PCR反应。两方法针对的是TGEV的S基因，S蛋白基因抗原性较强，保守性较低，针对该S基因设计的引物的通用价值低，且该两方法采用的是特异性相对较低的SYBR Green Ⅰ染料探针。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供特异性更高的，操作更简便的猪传染性胃肠炎病毒N基因的RT-qPCR检测方法及其试剂盒。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一组猪传染性胃肠炎病毒N基因的引物和TaqMan探针，包括：
如序列表SEQ ID No.1所示的猪传染性胃肠炎病毒N基因的上游引物；
如序列表SEQ ID No.2所示的猪传染性胃肠炎病毒N基因的下游引物；
如序列表SEQ ID No.3所示的猪传染性胃肠炎病毒N基因的TaqMan探针序列。
作为优选，所述TaqMan探针序列的5’端标记报告荧光基团为FAM，3’端标记淬灭荧光基团为TAMRA。
一种猪传染性胃肠炎病毒N基因的RT-qPCR检测试剂盒，包括上述猪传染性胃肠炎病毒N基因的上游引物、猪传染性胃肠炎病毒N基因的下游引物以及猪传染性胃肠炎病毒N基因的Taq Man探针。
作为优选，还包括：
1)阴性对照；
2)阳性标准质粒：由猪传染性胃肠炎病毒N基因克隆到质粒载体pMD18-T上而获得。
利用权利要求上述RT-qPCR检测试剂盒非诊断性检测猪传染性胃肠炎病毒N基因的方法，包括以下步骤：
1)提取样品RNA；
2)对提取样品的RNA进行RT-qPCR扩增；
3)根据RT-qPCR反应体系的荧光信号进行结果判定。
作为优选，步骤2)中，RT-qPCR扩增反应体系：2×One Step RT-PCR BufferⅢ 12.5μL，Ex Taq HS 0.5μL，RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL，如SEQ ID No.1所示的上游引物0.75μL，如SEQ ID No.2所示的下游引物0.75μL，如SEQ ID No.3所示的探针0.25μL，模板2μL，补DEPC水至25μL。
作为优选，步骤2)中，RT-qPCR扩增反应条件：42℃5min，95℃10s；然后按95℃10s，57.5℃10s，60℃35s并收集荧光，进行40个循环。
作为优选，步骤2)中，RT-qPCR扩增反应条件：升降温速度均设置为20℃/s。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明提供的方法是针对猪传染性胃肠炎病毒N基因，N基因即核衣壳(N)蛋白包裹着基因组RNA。N蛋白具有高度的保守性，对TGEV不同毒株的N蛋白序列研究发现其氨基酸序列的同源性高达90％以上。针对猪传染性胃肠炎病毒N基因的引物及探针具有较高的通用价值；
2.本发明采用TaqMan探针对猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法的稳定性高、特异性强，其组内和组间的变异系数均在5％以下，且只能特异性检测TGEV，对PCV Ⅱ、PEDV、CSFV和PRRSV核酸进行检测时均没有荧光信号；
3.本发明建立的猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法灵敏度高，所能检测到的最低质粒稀释浓度为1×101copies/μL，高于普通RT-PCR检测方法；
4.本发明提供的猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法，操作简单，不需进行扩增后的电泳等操作，可同时进行定量和定性分析。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1 正常PK-15细胞图(100×)；
图2 接毒后的PK-15细胞图(100×)；
图3 目的基因的扩增结果，
M：DL2000分子标准量；1：目的基因的扩增条带；
图4 阳性标准质粒目的基因的扩增结果，
M：DL2000分子标准量；1：目的基因的扩增条带；
图5 TGEV RT-qPCR动力学扩增曲线，
a-f：重组质粒浓度依次为1×109-1×104copies/μL，
g：阳性对照，h：阴性对照；
图6 TGEV RT-qPCR标准曲线；
图7 TGEV RT-qPCR敏感性试验结果，
a-f：重组质粒浓度依次为1×106-1×101copies/μL，
g：阴性对照；
图8 TGEV RT-qPCR特异性试验结果，
a：TGEV对照；
b-f：CSFV、PRRSV、PEDV、PCV Ⅱ和阴性对照的重合曲线；
图9 TGEV RT-qPCR检测最低浓度质粒实验结果，
a-f，重组质粒浓度依次为1.0×105copies/μL-1.0×100copies/μL，
g：阴性对照；
图10 TGEV普通RT-PCR检测最低浓度质粒实验结果，
1-6，重组质粒浓度依次为1.0×105copies/μL-1.0×100copies/μL，
7：阴性对照。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用试验材料，如无特殊说明，均可商业购买获得。下述实施例中所用试验器材均为一次性塑料器皿或消毒灭菌处理的玻璃器皿。
下述实施例中，猪传染性胃肠炎病毒毒株由本实验室分离鉴定并自存，命名为TGEV PY-D株，猪圆环病毒Ⅱ型(PCV II)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(SCFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)由农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室(广东肇庆)提供。
本发明提供一种猪传染性胃肠炎病毒N基因的引物和TaqMan探针及其在RT-qPCR检测中的应用；
具体地说，一组猪传染性胃肠炎病毒N基因的引物和TaqMan探针，包括如序列表SEQ ID No.1所示的猪传染性胃肠炎病毒N基因的上游引物；
如序列表SEQ ID No.2所示的猪传染性胃肠炎病毒N基因的下游引物；
如序列表SEQ ID No.3所示的猪传染性胃肠炎病毒N基因的TaqMan探针序列。
一种猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测试剂盒，包括上述猪传染性胃肠炎病毒N基因的上游引物、猪传染性胃肠炎病毒N基因的下游引物以及猪传染性胃肠炎病毒N基因的TaqMan探针。
利用权利要求上述RT-qPCR检测试剂盒非诊断性检测猪传染性胃肠炎病毒N基因的方法，包括以下步骤：
1)提取样品RNA；
2)对提取样品的RNA进行RT-qPCR扩增；
3)根据RT-qPCR反应体系的荧光信号进行结果判定。
实施例1：引物和TaqMan探针的设计与合成
TGEV基因组有7个开放阅读框(ORF)，其中N基因编码核衣壳蛋白，具有高度的保守性。以本实验室分离保存的TGEV PY-D株的N基因为靶基因，利用分子生物学软件将其和GenBank上已经发表的基因序列比较分析，设计上游引物TGEV-P1、下游引物TGEV-P2与探针TGEV-Probe的序列见表1，
表1引物与探针
序列号 名称 序列(5'to3') 引物位置 碱基数
SEQ ID No.1 TGEV-P1 gccaagcattacccacaact 811 20bp
SEQ ID No.2 TGEV-P2 cacttctgatggacgagca 1005 19bp
SEQ ID No.3 TGEV-Probe atggcgaccagatagaagtcacgttcac 893 28bp
在进一步的方案中，探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA，该探针命名为TGEV-Probe。
实施例2：TGEV的培养
将PK-15细胞传代培养至其长成单层后，正常的PK-15细胞如图1所示，将本实验保存的TGEV PY-D株冻干毒用DMEM稀释后接种于PK-15细胞上，在37℃5％CO2培养箱中吸附1h后，弃病毒液，加入DMEM维持液，重新置于培养箱中，经过培养45-55h，待出现明显病变后刮取细胞收获病毒液，培养后的PK-15细胞如图2所示。
实施例3：阳性标准质粒的制备
1)cDNA的制备
经AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit试剂盒(AXYGEN)提取病毒RNA，或采用现有技术中已知的方法提取病毒RNA，所提取的RNA经逆转录试剂盒进行逆转录反应，制备cDNA。
RNA/DNA提取试剂盒和胶回收试剂盒可分别采用AXYGEN公司的AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit和Gel Extraxtion Kit产品。
2)目的片段PCR扩增
以本实施例步骤1)所制的cDNA为模板，以引物TGEV-P1和引物TGEV-P2为特异性引物，进行阳性标准质粒目的PCR扩增，PCR扩增条件如下：
采用25μL反应体系：l0×Buffer 2.5μL；引物TGEV-P1 1μL；引物TGEV-P21μL；dNTP 2.0μL，Taq酶0.15μL，ddH2O 17.35μL，cDNA模板1μL；
升温程序：95℃5min；然后按94℃30s，57.5℃40s，72℃45s，进行35个循环；72℃延伸10min；
反应结束后，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测产物，如图3所示，在100bp-250bp之间有一条亮带，说明扩增成功；
3)扩增产物的回收与纯化
将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的片段，按照试剂盒说明书操作，收集目的片段DNA，-20℃保存备用；
4)目的片段DNA与载体的连接
将本实施例步骤3)所获得的目的片断DNA链接到pMD18-T载体上制备连接产物，将DH-5α受体大肠埃希氏菌摇菌制备感受态细胞，并将连接产物与感受态细胞制备菌体并重悬得菌液，将菌液涂于Amp平板上，37℃过夜培养至出现白色菌落，完成目的片断DNA与载体的连接；
5)阳性标准质粒的提取
从Amp平板上挑取单个菌落，接种到LB培养基，37℃振荡过夜培养，取适量菌液接种到含300mL LB的盐水瓶，振荡过夜培养，培养完成后，取菌液，提取DNA，并进行普通PCR鉴定；反应结束后，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测产物，结果见图4，在100bp-250bp之间有一条亮带，说明扩增成功，经质粒提取试剂盒(天根生物技术有限公司)进行质粒大量提取，收集阳性标准质粒，命名为pMD-N，分光光度计测定重组质粒的浓度，于-80℃保存备用。
实施例4：目的基因和阳性标准质粒的克隆与测序
分别以TGEV PY-D株RNA和阳性标准质粒为模板，使用引物TGEV-P1、TGEV-P2，经一步法普通RT-PCR试剂盒(Prime ScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2)，进行目的基因和阳性标准质粒的克隆，M：DL2000分子标准量；1：目的基因的扩增条带，在100bp-250bp之间有一条亮带，说明扩增成功；
目的基因的克隆产物和重组质粒目的基因的克隆产物送相关部门测序，其序列分别如序列表SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。
实施例5：猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法的建立
1)提取猪传染性胃肠炎病毒RNA；
2)对提取样品的RNA进行RT-qPCR扩增，RT-qPCR扩增条件如下：
反应体系：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μL，Ex Taq HS 0.5μL，RTEnzyme Mix Ⅱ 0.5μL，引物TGEV-P1 0.75μL，引物TGEV-P2 0.75μL，探针TGEV-Probe 0.25μL，模板2μL，补DEPC水至25μL；
反应条件：42℃5min，95℃10s；然后按95℃10s，57.5℃10s，60℃35s并收集荧光，40个循环；
本实施例中，升降温速度均设置为20℃/s。
其中采用如SEQ ID No.1所示的上游引物，采用如SEQ ID No.2所示的下游引物，采用如SEQ ID No.3所示的探针，所述探针5’端标记报告荧光基团为FAM，3’端标记淬灭荧光基团为TAMRA；
3)根据RT-qPCR反应体系的荧光信号进行结果判定。
根据荧光强度判定检测结果，扩增结果Ct值小于37的为阳性，Ct值在37和40之间的被认为可疑，重复试验如果仍然在37和40之间则视为阴性，无Ct值的为阴性。
实施例6：猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测试剂盒
1)RT-qPCR反应液，其包括：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μL，Ex TaqHS 0.5μL，RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL，引物TGEV-P1 0.75μL，引物TGEV-P20.75μL，探针TGEV-Probe 0.25μL，模板2μL，补DEPC水至25μL；
2)阴性对照：ddH2O；
3)阳性标准质粒：实施例3所制备的阳性标准质粒。
方法验证
本发明提供的猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法，在阳性标准质粒浓度1×109copies/μL-1×104copies/μL范围内，呈良好的线性关系，该体系具有良好的重复性，所能检测到的最低质粒稀释浓度为1×101copies/μL，对猪传染性胃肠炎病毒具有良好的特异性。
1)标准曲线的绘制
将实施例3所制的阳性标准质粒pMD-N稀释成1×109copies/μL-1×104copies/μL，以稀释后的质粒为模板，按实施例5步骤2)的RT-qPCR扩增条件进行RT-qPCR扩增试验，每个浓度进行3个平行重复。
本发明的RT-qPCR动力学扩增曲线如图5所示，其中曲线a-f：重组质粒浓度依次为1×109-1×104copies/μL；曲线g：未稀释的阳性标准质粒pMD-N；曲线h：阴性对照。
RT-qPCR扩增结果如图6所示，拷贝数(X)与CT值(Y)满足线性关系：Y＝-3.471X+44.436，相关系数R2＝0.986。
2)方法敏感性验证
将实施例3)所制的阳性标准质粒稀释成1×106copies/μL-1×101copies/μL，以稀释后的阳性标准质粒为模板，按实施例5步骤2)的RT-qPCR扩增条件进行RT-qPCR扩增试验，动力学扩增曲线如图7所示，其中曲线a-f：重组质粒浓度依次为1×106-1×101copies/μL；曲线g：阴性对照。
由图7可知，在25μL反应体系中，阳性标准质粒含量在1×106copies/μL-1×101copies/μL时，Ct值与荧光值呈典型的扩增曲线。本发明提供的RT-qPCR检测方法，表现出良好的敏感性。
3)重复性试验
对同一批实施例2步骤1)培养的TGEV病毒平行提取10次RNA再按实施例5步骤2)的RT-qPCR扩增条件进行组间试验，对同一批样品经实施例5步骤2)的RT-qPCR扩增条件进行组内试验，试验结果如下表2所示，
表2组内、组间重复性试验
其中CV为变异系数；
表2结果表明，本发明所建立的RT-qPCR方法的组内变异系数和组间变异系数均小于5％，表明该检测体系稳定，具有良好的重复性。
4)特异性试验
分别以TGEV、PCV Ⅱ、PEDV、CSFV和PRRSV的RNA为模版，按实施例5步骤2)的RT-qPCR进行RT-qPCR扩增，以确认本发明建立方法的特异性，结果见图8。图8中，曲线a为TGEV对照曲线，曲线b-f依次为CSFV、PRRSV、PEDV、PCV Ⅱ和阴性对照的重合曲线。图8结果表明，除TGEV呈阳性外，其它病毒全部没有荧光信号，表明本发明建立的RT-qPCR检测方法特异性强。
5)与RT-PCR的对比
将实施例3)所制的阳性质粒稀释成1×105copies/μL-1×100copies/μL，以稀释后的阳性标准质粒为模板，使用引物TGEV-P1、TGEV-P2，分别按实施例5步骤2)的RT-qPCR扩增条件进行RT-qPCR扩增反应，
扩增曲线如图9所示，其中曲线a-f：重组质粒浓度依次为1×105-1×100copies/μL；曲线g：阴性对照。当阳性标准质粒含量在1×105copies/μL-1×101copies/μL时，Ct值与荧光值呈典型的扩增曲线。本发明提供的RT-qPCR检测方法，较传统的RT-PCR的敏感性高。
将实施例3)所制的阳性质粒稀释成1×105copies/μL-1×100copies/μL，以稀释后的阳性标准质粒为模板，使用引物TGEV-P1、TGEV-P2，以下条件进行普通RT-PCR扩增反应，
PCR反应体系为25μL：PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，2×1step Buffer12.5μL，引物均为0.5μL，Template RNA 1μL，ddH2O 9.5μL；反应程序：54℃10min；94℃3min，然后按94℃30s，57.5℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃10min。反应结束后于4℃保存，取5μL PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察结果，
紫外凝胶成像系统观察结果如图10所示，普通RT-PCR检测方法所能检测到的最低质粒稀释浓度为1×103copies/μL，说明本发明所建立的RT-qPCR的敏感性是普通RT-PCR的100倍。
临床试验检测
对收集到的65份疑似猪传染性胃肠炎样品，分别PK-15细胞接种分离检测、本发明建立的RT-qPCR方法和普通RT-PCR方法进行检测，结果见下表3，
表3临床试验检测
由表3可知，PK-15细胞分离病毒方法检测到19份阳性病料，本发明建立的RT-qPCR检测结果有20份阳性病料，普通RT-PCR检测结果有14份阳性病料。以PK-15细胞分离病毒方法为参考，本发明建立的RT-qPCR检测方法的准确率为95％；普通RT-PCR检测方法的准确率为71％。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (8)

1.一组猪传染性胃肠炎病毒N基因的引物和TaqMan探针，包括：
如序列表SEQ ID No.1所示的猪传染性胃肠炎病毒N基因的上游引物；
如序列表SEQ ID No.2所示的猪传染性胃肠炎病毒N基因的下游引物；
如序列表SEQ ID No.3所示的猪传染性胃肠炎病毒N基因的TaqMan探针序列。
2.如权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒N基因的引物和TaqMan探针，其特征在于，所述TaqMan探针序列的5’端标记报告荧光基团为FAM，3’端标记淬灭荧光基团为TAMRA。
3.一种猪传染性胃肠炎病毒N基因的RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒N基因的上游引物、猪传染性胃肠炎病毒N基因的下游引物以及猪传染性胃肠炎病毒N基因的TaqMan探针。
4.如权利要求3所述的RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，还包括：
1)阴性对照；
2)阳性标准质粒：由猪传染性胃肠炎病毒N基因克隆到质粒载体pMD18-T上而获得。
5.利用权利要求4所述的RT-qPCR检测试剂盒非诊断性检测猪传染性胃肠炎病毒N基因的方法，包括以下步骤：
1)提取样品RNA；
2)对提取样品的RNA进行RT-qPCR扩增；
3)根据RT-qPCR反应体系的荧光信号进行结果判定。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：
步骤2)中，RT-qPCR扩增反应体系：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μL，Ex Taq HS 0.5μL，RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL，SEQ ID No.1所示的上游引物0.75μL，SEQ ID No.2所示的下游引物0.75μL，SEQ ID No.3所示的探针0.25μL，模板2μL，补DEPC水至25μL。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2)中，RT-qPCR扩增反应条件：42℃5min，95℃10s；然后按95℃10s，57.5℃10s，60℃35s并收集荧光，进行40个循环。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2)中，RT-qPCR扩增反应条件：升降温速度均设置为20℃/s。
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