CN109762931A - 猪传染性胃肠炎病毒荧光定量rt-pcr检测的引物、探针及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT‑PCR检测的引物、探针及方法。根据猪传染性胃肠炎病毒N基因保守序列，设计合成特异性引物和TaqMan探针，通过优化反应条件，建立了TGEV TaqMan荧光定量RT‑PCR方法。标准曲线具有良好的线性关系；敏感性好，最低可准确检测到102copies/μl；特异性高，除TGEV外的常见猪源病毒均未出现扩增曲线；重复性好，批内和批间重复变异系数均小于2％。本发明的优点在于较高的特异性、敏感性和重复性，可以应用于大规模、高通量的样本检测。

Description

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物、探针及 方法

技术领域

]本发明属于动物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的高度接触性传染病，以引起一周龄以下仔猪呕吐、水样腹泻和高死亡率为主要特征，对我国养猪业造成了巨大的经济损失。TGEV感染的早期诊断对该病的防控，减少经济损失具有重要意义，因此需要建立一种敏感快速的检测方法。目前已经建立了一些检测TGEV的荧光定量PCR方法，但均一些不足之处。如中国文献专利号CN102154516A公开了一种根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因保守序列，设计、优化出一对特异的PCR引物，建立了一种快速定量检测TGEV的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法。该方法检测灵敏度比普通RT-PCR高100倍，并且避免了常规PCR检测带来的高污染率。但是，该专利方法假阳性率较高，敏感性较低，准确性较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，旨在解决现有检测方法灵敏度差，阳性检出率低，重复性不好，不能很好地用于猪传染性胃肠炎病毒临床样品的诊断以及流行病学调查的问题。

荧光定量PCR标准品要求包含高度保守、特异的序列，以保证反应的高度特异性。TGEV编码四种结构蛋白，分别为纤突蛋白(S)、小膜蛋白(sM)、膜内蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，其中N蛋白高度保守，序列分析不同毒株间同源性在95％以上。N蛋白不仅是病毒的主要结构蛋白，而且在病毒RNA的复制加工过程中具有重要作用。因此，可以利用N蛋白来建立针对TGEV的分子生物学诊断技术。而TaqMan探针法对目标序列有很高的特异性，设计相对简单，假阳性低且重复性好。

本发明的目的在于提供一种猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，旨在解决现有检测方法灵敏度差，阳性检出率低，重复性不好，不能很好地用于猪传染性胃肠炎病毒临床样品的诊断以及流行病学调查的问题。

本发明的技术方案如下：

本发明涉及的猪传染性胃肠炎病毒N基因TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，包括步骤如下：

(1)设计、合成引物：根据TGEV N基因保守序列(SEQ ID No.1)，设计一对特异性引物和探针；

(2)制备重组质粒标准品：PCR扩增N基因目的片段，连接pMD18-T载体，挑取阳性克隆测序鉴定，序列为SEQ ID No.2；

(3)优化TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件：

扩增时使用的引物、探针分别为：

正向引物：5'-GCTTGGTAGTCGTGGTGCT-3'(SEQ ID No.3)；

反向引物：5'-TGGATTGTTGCCTGCCTC-3'(SEQ ID No.4)；

探针：5'-FAM-AAATTCGATGGTAAAGTGCCAGGCG-TAMRA-3'(SEQ ID No.5)；

上述引物最佳浓度为0.2mol/L，探针最佳浓度为0.2mol/L；

扩增反应体系：2×RT-PCR Buffer 12.5μl，Ex Taq HS 0.5μl，PrimeScript RTEnzyme 0.5μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，探针0.5μl，无RNA酶水8μl；

取2μl待测样品RNA加入总量为25μl的反应体系中，将配置好反应体系的PCR管于42℃预热5min，95℃预变性10s，95℃变性5s，60℃退火延伸30s，变性与退火过程延伸共40个循环；

(4)结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，判定待测样品阳性或阴性。判定标准：

阳性：检测样品Ct值≤35.0，且扩增曲线有明显的指数增长期；

可疑：检测样品Ct值＞35，且出现典型的扩增曲线，进行重复试验；

阴性：检测不到样品Ct值，且无明显的扩增曲线。

本发明还提供猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测的试剂盒。

本发明还提供上述引物和探针在定量检测猪传染性胃肠炎病毒中的应用。

本发明的有益效果为：本发明提供了猪传染性胃肠炎病毒N基因TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，设计并合成特异性引物和探针，通过对荧光定量反应条件的优化，建立了检测TGEV的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。该方法能够特异的检测TGEV，对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和流行性乙型脑炎病毒(JEV)的检测结果均为阴性，即本发明建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异型强；本发明在108-104copies/μl范围内具有良好的线性关系，灵敏度最低可检测到10copies/μl，敏感性高；批内和批间重复系数均小于2％，重复性好。

附图说明

图1是本发明实施例提供的TGEV N基因PCR扩增产物图，图中，M-DL2000，1-PCR产物，2-阴性对照。

图2是本发明实施例提供的TGEV TaqMan荧光定量RT-PCR的动力学曲线图。

图3是本发明实施例提供的TGEV TaqMan荧光定量RT-PCR的标准曲线图。

图4是本发明实施例提供的TGEV TaqMan荧光定量RT-PCR的特异性试验结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述，下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1：引物及探针设计

根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因DNA Star软件序列比对结果，利用引物探针设计软件Primer Express5.0设计出一对特异性引物和探针，均由北京生工生物有限公司合成，详见表1.

表1 TGEV引物及TaqMan探针序列

实施例2：荧光定量标准品制备

TGEV RNA的提取按照Trizol Reagent试剂盒使用说明操作。用包含荧光定量目的片段在内的特异性引物进行RT-PCR扩增，经PCR扩增纯化得到417bp大小的产物，如图1所示，扩增产物DNA用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果，扩增结果与设计的目的片段相符。将阳性PCR产物经纯化后连接到pMD-18T载体中，并转化到DH5α感受态细胞中。挑取单菌落扩大培养后提取质粒并通过PCR鉴定，将阳性质粒测序检测，以测序成功的阳性质粒作为荧光定量检测的标准品。

实施例3：标准曲线的建立

重组质粒由质粒提取试剂盒提取，用紫外分光光度计定量并计算拷贝数。标准品10倍梯度稀释(108-104copies/μl)，作为模板进行荧光定量PCR，得到检测TGEV的扩增动力学曲线如图2所示，相应的标准曲线如图3所示。标准曲线具有良好的线性关系，回归方程为Y＝-2.954X+42.735，相关系数R2为0.992，扩增效率E＝1.180。

实施例4：敏感性试验

将质粒标准品10倍梯度稀释(108-101copies/μl)，作为模板进行荧光定量PCR反应，确定该方法的灵敏度。结果表明，该方法可检测到的最低浓度为102copies/μl，即105copies/mL，而普通PCR最低只能检测到107copies/mL。因此，该方法比普通PCR方法敏感100倍。

实施例5：特异性试验

用核酸提取试剂盒提取猪流行性腹泻病毒(PEDV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和流行性乙型脑炎病毒(JEV)核酸，作为模板进行荧光定PCR反应，同时设置阴阳性对照。结果如图4所示，只有TGEV出现了明显的扩增曲线，其它猪源病毒及阴性对照均没有扩增曲线。因此，本发明建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性。

实施例6：重复性试验

(1)批间重复性试验：取2×107、2×105和2×102copies/μL 3个不同浓度的质粒标准品，在同一条件下进行3次重复试验；试验结果如表2所示：

表2 TGEV荧光定量RT-PCR批间重复

由表2可知，批间重复的变异系数均小于2％，表明本发明建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法在批间具有良好的重复性。

批内重复性试验：取2×107、2×105和2×102copies/μL 3个不同浓度的质粒标准品，在一次试验中进行3次重复试验；试验结果如表3所示：

表3 TGEV荧光定量RT-PCR批内重复

由表3可知，批间重复的变异系数均小于1％，表明本发明建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法在批内具有良好的重复性。

Claims (9)

1.一组猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物和探针，其特征在于，所述引物序列为：

正向引物：5'-GCTTGGTAGTCGTGGTGCT-3'(SEQ ID No.3)；

反向引物：5'-TGGATTGTTGCCTGCCTC-3'(SEQ ID No.4)；

所述探针的序列为：

5'-FAM-AAATTCGATGGTAAAGTGCCAGGCG-TAMRA-3'(SEQ ID No.5)。

2.猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针。

3.权利要求1所述的引物和探针在定量检测猪传染性胃肠炎病毒中的应用。

4.权利要求2所述的试剂盒在定量检测猪传染性胃肠炎病毒中的应用。

5.猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

(1)提取待测样品中的RNA，设置阴性对照；

(2)制备DNA标准品；

(3)使用权利要求1所述的引物和探针对待测样品进行TaqMan荧光定量RT-PCR扩增反应；

(4)结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，判定待测样品阳性或阴性。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，引物浓度为0.2mol/L，探针浓度为0.2mol/L。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中扩增反应体系为：2×RT-PCR Buffer 12.5μl，Ex Taq HS 0.5μl，PrimeScript RT Enzyme 0.5μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，探针0.5μl，无RNA酶水8μl。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中扩增反应具体为：取步骤(1)中的RNA 2μl和阴性对照2μl分别加入总量为25μl的反应体系中，将配置好反应体系的PCR管于42℃预热5min，95℃预变性10s，95℃变性5s，60℃退火延伸30s，变性与退火过程延伸共40个循环。

9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品阳性或阴性的判定标准为：

(1)阳性：检测样品Ct值≤35.0，且扩增曲线有明显的指数增长期；

(2)可疑：检测样品Ct值＞35，且出现典型的扩增曲线，进行重复试验；

(3)阴性：检测不到样品Ct值，且无明显的扩增曲线。