CN105331602A - Qpcr检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法 - Google Patents
Qpcr检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105331602A CN105331602A CN201510819208.0A CN201510819208A CN105331602A CN 105331602 A CN105331602 A CN 105331602A CN 201510819208 A CN201510819208 A CN 201510819208A CN 105331602 A CN105331602 A CN 105331602A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- soil
- pedotheque
- minutes
- dna
- centrifugal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000002689 soil Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 241000722096 Tilletia controversa Species 0.000 title abstract description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 13
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 241000031845 Tilletia laevis Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及QPCR检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法，包括：(1)将取回的土壤样品过网筛除去杂质，然后冷冻过夜；(2)采用FastDNATM？SPIN？Kit？for？Soil试剂盒提取土壤样品的总DNA；(3)以待测土壤样品的总DNA以及梯度稀释的阳性对照模板同时进行QPCR反应，得到土壤样品及阳性对照的扩增曲线和Ct值；(4)根据梯度稀释的阳性对照模板的扩增曲线和Ct值以及待测土壤样品的扩增曲线和Ct值，判断土壤样品中是否含有小麦矮腥黑粉菌。该方法通过冷冻处理土壤样品，改良DNA提取方法，能提取质量较好的DNA，解决了从土壤中难以提取DNA的困难，实现了土壤中小麦矮腥黑粉菌的检测。
Description
技术领域
本发明涉及QPCR检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法，属于小麦矮腥黑粉菌防治领域。
背景技术
小麦矮腥黑穗病是由小麦矮腥黑粉菌(TilletiacontroversaKühn，TCK)引起的重要国际检疫性病害，也是我国对外检疫的一类危险性植物病害。该病害危害大、防治难，一旦传入会给小麦生产带来毁灭性危害，通常发病率约等于小麦产量损失率。据Hoffmann报告，在流行年份，因TCK引起的损失率一般为20％～50％，最高可达75％～90％。除了产量损失外，被侵染的小麦出粉率也会随着感染严重程度而降低，并且因含有TCK冬孢子而极大地影响品质。TCK的寄主范围很广，危害小麦、大麦、黑麦等禾本科18个属的70多种植物，其中，对小麦危害最严重。小麦矮腥黑粉菌对我国的小麦生产存在潜在危机，该病在栽培条件下的主要寄主为冬小麦，我国常年小麦种植面积约2300万hm2，其中冬小麦占绝大部分，西北、黄淮海等广大冬麦区均适合小麦矮腥黑粉菌的定殖和发生危害，随着我国加入WTO及与TCK疫区国家-美国小麦贸易的增加，TCK传入我国的可能性日益增大，因此，必须加强小麦矮腥黑穗病的早期预警及检疫检测，为病害防治提供技术储备。
冬季小麦矮腥黑粉菌冬孢子潜藏在土壤中，定性定量检测土壤中小麦矮腥黑粉菌冬孢子的含量，对于早期预警和预防病害，具有重要的意义，然而，小麦矮腥黑粉菌孢子体积质量都非常小，而土壤中微生物种类多，分子生物学检测方法虽然灵敏度高，但是TCK的DNA在土壤样品总DNA中的比例极低，而且TCK孢子的DNA提取率本身极低，常规方法提取的土壤样品总DNA作为模板，容易导致假阴性结果。
发明内容
根据上述领域存在的需求，本发明提供一种QPCR检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法，该方法能够对土壤中的小麦矮腥黑粉菌进行定性和定量，有利于及时采取防治措施，防止小麦矮腥黑穗病的发生。
本发明要求保护的技术方案如下：
土壤中小麦矮腥黑粉菌的总DNA提取方法，其特征在于，提取DNA前对土壤进行冷冻处理。
所述的土壤中小麦矮腥黑粉菌的总DNA提取方法，其特征在于，采用细胞震荡破碎仪以6.5M/S震荡2分钟对土壤样品进行处理。
还包括如下步骤：
所述冷冻处理之前，对土壤进行前处理：将取回的土壤样品过网筛除去杂质；
提取土壤样品的总DNA：采用FastDNATMSPINKitforSoil试剂盒，步骤如下：
(1)称取500mg土壤加到LysingMatrixETube中；
(2)加978ulsodiumPhosphateBuffer到管中；
(3)加122ulMTBuffer；
(4)14000r/min离心10分钟；
(5)将上清液转移到一个2ml管，加入250ulPPS，混合均匀；
(6)14000r/min离心5分钟，将上清液转移到一个新的2ml管；
(7)加入1ml充分混匀的BindingMatrix；
(8)涡旋2分钟，让DNA充分结合基质，涡旋后将管放到管架上静置3分钟；
(9)去除500ul上清液，避免碰到沉淀；
(10)重悬试管让BindingMatrix重新混匀，取约600ul的混合液转移到SpinFilter中，14000r/min离心1分钟，倒空流出液，再把剩下的上清液加入SpinFilter中，14000r/min离心1分钟，倒出流出液；
(11)加500ul的已加入无水乙醇的SEWS-M到SpinFilter中，利用水流重悬里面的固体；
(12)14000r/min离心1分钟，倒出流出液；
(13)14000r/min空离2分钟，以清空SpinFilter中剩余的SEWS-M液体；
(14)移动SpinFilter到新的CatchTube中，放置于室温下风干5分钟；
(15)加入50ul的DES，用枪头轻轻搅动滤膜，将样品放到55度水浴锅中加热5分钟；
(16)取出样品后，14000r/min离心1分钟，弃掉SpinFilter，将CatchTube中的DNA放置于4度冰箱备用，
所述采用细胞震荡破碎仪，以6.5M/S震荡2分钟对土壤样品进行处理的步骤设置在步骤(3)和(4)之间。
还包括在对土壤样品进行冷冻处理之后以及提取土壤样品的总DNA之前，对土壤样品进行研磨。
QPCR检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)采用权利要求1～3任一所述的方法提取待测土壤样品的总DNA；
(2)以待测土壤样品的总DNA以及梯度稀释的阳性对照模板同时进行QPCR反应，得到土壤样品及阳性对照的扩增曲线和Ct值；
(3)根据梯度稀释的阳性对照模板的扩增曲线和Ct值以及待测土壤样品的扩增曲线和Ct值，判断土壤样品中是否含有小麦矮腥黑粉菌。
所述QPCR反应的体系为：2×SGGreenqPCRMix8μl，10μM的正向引物0.8μl，10μM的反向引物0.8μl，10μM的探针引物0.4μl，20×探针增强因子1μl，DNA模板2μl，不含核酸酶的ddH2O7μl。
所述正、反向引物及探针引物的核苷酸序列为：
正向引物：5’-ACGACCGACTTTCCGAGAGC-3’；
反向引物：5’-GTGTGGGACGAAGGCATCAA-3’；
探针引物：FAM5’-ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3’TAMAR。
所述QPCR反应的程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，40个循环，扩增结束后取荧光。
从土壤中提取的总DNA包含各种微生物的DNA，因此小麦矮腥黑粉菌的含量很低，使用常规PCR检测不到小麦矮腥黑穗病菌，容易产生假阴性结果。而本发明提供的DNA提取方法，通过冷冻处理待测土壤样品，改良DNA提取方法，解决了从土壤中难以提取DNA的困难，实现了土壤中小麦矮腥黑粉菌的定性和定量，能够更早地进行小麦矮腥黑穗病的预警，以便采取有效的防治措施，减少该病害带来的经济损失。
本发明提供的DNA提取方法能够有效地提取出土壤样品的总DNA，并且DNA的质量较好，其OD260nm/OD280nm的比值均在1.8至1.9左右，浓度均在200～300ng/μL，有利于后续的病害检测。
本发明提供的方法利用敏度更高的QPCR反应进行检测，通过优化反应体系和反应程序，能够对土壤中含量极低的小麦矮腥黑粉菌进行定性检测。并且，通过制作标准曲线，获得标准曲线方程，可以对土壤中的小麦矮腥黑粉菌进行定量分析。
附图说明
图1.采用本发明方法提取的土壤样品的总DNA；
图2.采用FastDNATMSPINKitforSoil所附带的提取步骤提取土壤样品的总DNA；
图3.QPCR检测土壤样品中小麦矮腥黑粉菌的扩增曲线，
其中，红色是阳性对照按十倍梯度稀释的扩增曲线，黑色是阴性对照，蓝色和绿色是检测出含冬孢子的不同土壤样品扩增曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，而不以任何形式限制本发明的范围。
下述实施例未特别说明的生物化学试剂，均为本领域常规试剂，可以通过本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可。
含有TCK冬孢子的土壤来自中国农业科学院植物保护研究所，为实验室采用TCK冬孢子接种小麦试验过程中产生的侵染土壤。TCK菌种为小麦矮腥黑粉菌(TilletiacontroversaKühn)菌株：本发明所有的TCK菌株为现有文献L.GAOetal.DevelopmentofaSCARMakerbyinter-simplesequencerepeatfordignoisisofDwarfBuntofWheatandDetectionofTilletiacontroversaKühn.FoliaMicrobiol.55(3),258–264(2010)所记载，参见其中材料与方法部分记载的在美国由B.Goates教授分离到的分离株。另外也记载在L.GAOetal.AnISSR-basedApproachfortheMolecularDetectionandDiagnosisofDwarfBuntofWheat,CausedbyTilletiacontroversaKu¨hn.JPhytopathol159:155–158(2011)，为其中材料与方法部分记载的DrBlairGoates所提供的TCK菌株。本实验室亦有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
实施例1.采用本发明方法检测土壤中的小麦矮腥黑粉菌冬孢子
土壤样品的前处理：
将采集的25份鲜土样过40目网筛，放入小号自封袋，并在每个自封袋上写明取样地点、所种植的小麦品种、时期及取样时间，置于-20℃冰箱中过夜。提取DNA前，将经过冷冻处理的土样从冰箱中取出，称取0.5g土样置于2mlLysingMatrixETube中(内含研磨珠)，然后使用细胞震荡破碎仪，6.5M/S震荡2分钟。
1、采用FastDNATMSPINKitforSoil试剂盒，按照下列优化过的步骤提取土壤样品的总DNA：
(a)称取500mg土壤加到LysingMatrixETube中；
(b)加978ulsodiumPhosphateBuffer到管中；
(c)加122ulMTBuffer；
(d)将加好样的LysingMatrixETube放到细胞震荡破碎仪中，6.5M/S震荡2分钟(或Mini-Beadbeater震荡2分钟)；
(e)14000r/min离心10分钟；
(f)将上清液转移到一个2ml管，加入250ulPPS，混合均匀；
(g)14000r/min离心5分钟，将上清液转移到一个新的2ml管；
(h)加入1mlBindingMatrix(使用前充分混匀)；
(i)涡旋2分钟，让DNA充分结合基质，涡旋后将管放到管架上静置3分钟；
(j)去除500ul上清液，避免碰到沉淀；
(k)重悬试管让BindingMatrix重新混匀，取约600ul的混合液转移到SpinFilter中，14000r/min离心1分钟，倒空流出液，再把剩下的上清液加入SpinFilter中，14000r/min离心1分钟，倒出流出液；
(l)加500ul的SEWS-M(药品使用前加入无水乙醇)到SpinFilter中，利用水流重悬里面的固体；
(m)14000r/min离心1分钟，倒出流出液；
(n)14000r/min空离2分钟，以清空SpinFilter中剩余的SEWS-M液体；
(o)移动SpinFilter到新的CatchTube中，放置于室温下风干5分钟；
(p)加入50ul的DES，用枪头轻轻搅动滤膜，将样品放到55度水浴锅中加热5分钟；
(q)取出样品后，14000r/min离心1分钟，弃掉SpinFilter，将CatchTube中的DNA放置于4度冰箱备用。
琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA，结果如图1所示，提取的DNA质量较好。用紫外分光光度计(Denovix)测DNA的浓度，结果表明，采用改良后的方法提取的DNA的OD260nm/OD280nm的比值均在1.8至1.9左右，浓度均在200～300ng/μL，与琼脂糖电泳结果相符合。
2、同样的土样，采用FastDNATMSPINKitforSoil所附带的提取步骤提取DNA。
琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA，结果如图2所示，Marker条带出现，而提取的土壤DNA没有检测到条带。用紫外分光光度计(Denovix)测DNA的浓度，结果表明，提取的DNA的OD260nm/OD280nm的比值均在1.4-1.6左右。由此表明，按照FastDNATMSPINKitforSoil试剂盒说明书中的提取方法不能提取出土壤总DNA。
3、以步骤1和步骤2获得的土壤样品总DNA为分别作为模板，采用下列引物对:
ISSR859-140A：5’-TGGTGGTCGGGAAAGATTAGA-3’，
ISSR859-511A:5’-GGGACGAAGGCATCAAGAAG-3’，
按照下列反应体系和反应程序进行常规PCR反应：
PCR反应体系
PCR反应程序
采用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果所有样品中都没有靶带扩增。本研究采用试剂盒提取土壤总DNA，使用常规PCR检测不到小麦矮腥黑穗病菌，说明总DNA中菌量含量极低，有必要采用灵敏度更高的方法进行定量分析。
4、实时荧光定量PCR(QPCR)检测TCK冬孢子
(1)采用TIANGENRealMasterMix(Probe)试剂盒，以步骤1及步骤2获得的土壤总DNA为模板，使用下列荧光定量引物：
| 正向引物 | 5’-ACGACCGACTTTCCGAGAGC-3’ |
| 反向引物 | 5’-GTGTGGGACGAAGGCATCAA-3’ |
| 探针引物 | FAM 5’-ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3’TAMAR |
按照下列反应体系和程序进行QPCR反应：
QPCR体系配置
将上述体系中的反应物混合均匀，离心，分到96孔PCR板里，每个样品3个PCR平行反应。
PCR反应程序设置
(2)采用100ng/μl的TCK冬孢子DNA，按十倍梯度稀释为5个浓度，得到浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、1×10-1ng/μl、1×10-2ng/μl、1×10-3ng/μl的模板，作为阳性对照，同时以ddH2O为模板，作为阴性对照，按照上述步骤(1)中的反应体系和程序分别进行QPCR。
根据阳性对照的实时扩增曲线验证探针引物特异性及引物的扩增效率，同时阳性对照梯度浓度对应可检测出最低含量冬孢子的CT值范围；待测样品检测结果出现扩增曲线及对应的CT值可得出是否含小麦矮腥黑粉菌冬孢子。
结果如图3所示，是步骤1提取的DNA为模板的检测结果，其中红色是阳性对照按十倍梯度稀释的扩增曲线，Ct＝20.21；黑色曲线是阴性对照，Ct＝2.4；蓝色和绿色是检测出含冬孢子的不同土壤样品的扩增曲线。
以步骤2提取的DNA为模板，除了阳性对照，土壤样品DNA没有扩增曲线。
Claims (8)
1.土壤中小麦矮腥黑粉菌的总DNA提取方法，其特征在于，提取DNA前对土壤进行冷冻处理。
2.根据权利要求1所述的土壤中小麦矮腥黑粉菌的总DNA提取方法，其特征在于，采用细胞震荡破碎仪以6.5M/S震荡2分钟对土壤样品进行处理。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：
所述冷冻处理之前，对土壤进行前处理：将取回的土壤样品过网筛除去杂质；
提取土壤样品的总DNA：采用FastDNATMSPINKitforSoil试剂盒，步骤如下：
(1)称取500mg土壤加到LysingMatrixETube中；
(2)加978ulsodiumPhosphateBuffer到管中；
(3)加122ulMTBuffer；
(4)14000r/min离心10分钟；
(5)将上清液转移到一个2ml管，加入250ulPPS，混合均匀；
(6)14000r/min离心5分钟，将上清液转移到一个新的2ml管；
(7)加入1ml充分混匀的BindingMatrix；
(8)涡旋2分钟，让DNA充分结合基质，涡旋后将管放到管架上静置3分钟；
(9)去除500ul上清液，避免碰到沉淀；
(10)重悬试管让BindingMatrix重新混匀，取约600ul的混合液转移到SpinFilter中，14000r/min离心1分钟，倒空流出液，再把剩下的上清液加入SpinFilter中，14000r/min离心1分钟，倒出流出液；
(11)加500ul的已加入无水乙醇的SEWS-M到SpinFilter中，利用水流重悬里面的固体；
(12)14000r/min离心1分钟，倒出流出液；
(13)14000r/min空离2分钟，以清空SpinFilter中剩余的SEWS-M液体；
(14)移动SpinFilter到新的CatchTube中，放置于室温下风干5分钟；
(15)加入50ul的DES，用枪头轻轻搅动滤膜，将样品放到55度水浴锅中加热5分钟；
(16)取出样品后，14000r/min离心1分钟，弃掉SpinFilter，将CatchTube中的DNA放置于4度冰箱备用，
所述采用细胞震荡破碎仪，以6.5M/S震荡2分钟对土壤样品进行处理的步骤设置在步骤(3)和(4)之间。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，还包括在对土壤样品进行冷冻处理之后以及提取土壤样品的总DNA之前，对土壤样品进行研磨。
5.QPCR检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)采用权利要求1～3任一所述的方法提取待测土壤样品的总DNA；
(2)以待测土壤样品的总DNA以及梯度稀释的阳性对照模板同时进行QPCR反应，得到土壤样品及阳性对照的扩增曲线和Ct值；
(3)根据梯度稀释的阳性对照模板的扩增曲线和Ct值以及待测土壤样品的扩增曲线和Ct值，判断土壤样品中是否含有小麦矮腥黑粉菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述QPCR反应的体系为：2×SGGreenqPCRMix8μl，10μM的正向引物0.8μl，10μM的反向引物0.8μl，10μM的探针引物0.4μl，20×探针增强因子1μl，DNA模板2μl，不含核酸酶的ddH2O7μl。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述正、反向引物及探针引物的核苷酸序列为：
正向引物：5’-ACGACCGACTTTCCGAGAGC-3’；
反向引物：5’-GTGTGGGACGAAGGCATCAA-3’；
探针引物：FAM5’-ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3’TAMAR。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述QPCR反应的程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，40个循环，扩增结束后取荧光。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510819208.0A CN105331602A (zh) | 2015-10-29 | 2015-11-23 | Qpcr检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2015107165423 | 2015-10-29 | ||
| CN201510716542 | 2015-10-29 | ||
| CN201510819208.0A CN105331602A (zh) | 2015-10-29 | 2015-11-23 | Qpcr检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105331602A true CN105331602A (zh) | 2016-02-17 |
Family
ID=55282368
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510819208.0A Pending CN105331602A (zh) | 2015-10-29 | 2015-11-23 | Qpcr检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105331602A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101560515A (zh) * | 2009-06-02 | 2009-10-21 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种小麦矮腥黑粉菌的特异基因序列、特异性scar标记及pcr检测方法 |
| CN102154279A (zh) * | 2009-06-02 | 2011-08-17 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种小麦矮腥黑粉菌的检测方法及特异性scar标记 |
| CN102154278A (zh) * | 2009-06-02 | 2011-08-17 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种小麦矮腥黑粉菌的快速检测方法及其特异性scar标记 |
| CN104673936A (zh) * | 2015-02-26 | 2015-06-03 | 广东大华农动物保健品股份有限公司 | 猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法及其引物和TaqMan探针 |
-
2015
- 2015-11-23 CN CN201510819208.0A patent/CN105331602A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101560515A (zh) * | 2009-06-02 | 2009-10-21 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种小麦矮腥黑粉菌的特异基因序列、特异性scar标记及pcr检测方法 |
| CN102154279A (zh) * | 2009-06-02 | 2011-08-17 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种小麦矮腥黑粉菌的检测方法及特异性scar标记 |
| CN102154278A (zh) * | 2009-06-02 | 2011-08-17 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种小麦矮腥黑粉菌的快速检测方法及其特异性scar标记 |
| CN104673936A (zh) * | 2015-02-26 | 2015-06-03 | 广东大华农动物保健品股份有限公司 | 猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法及其引物和TaqMan探针 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YANGJING345: "《豆丁 http://www.docin.com/p-673745248.html》", 4 July 2013 * |
| 张力文等人: "实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌方法的建立及评价", 《吉林大学学报（医学版）》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103352078B (zh) | 一种基于lamp技术检测大豆尖镰孢菌的方法及使用的引物组合物 | |
| CN104372104B (zh) | 一种樟疫霉菌的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法 | |
| CN104313175A (zh) | 一种致病疫霉的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法 | |
| CN104611428A (zh) | 一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用 | |
| CN104774955A (zh) | 一种葡萄座腔菌的检测方法 | |
| WO2016065983A1 (zh) | 一组家蚕蚕卵微孢子虫的lamp检测引物及试剂盒 | |
| CN111534621A (zh) | 用于橡胶树胶孢炭疽菌实时荧光定量pcr检测的引物及检测方法 | |
| CN113151522A (zh) | 基于lfd-rpa技术的水稻细菌性条斑病菌检测试剂盒及其引物探针组合物与应用 | |
| CN105112564A (zh) | 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒 | |
| CN104561278A (zh) | 一种西瓜枯萎病菌的检测引物、检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN104232782A (zh) | 一种检测烟草土传真菌病原物的pcr引物及应用与方法 | |
| CN106381341B (zh) | 一种芋疫霉菌巢式pcr检测引物及其应用 | |
| CN113684321B (zh) | 香蕉线条病毒ol rpa检测引物、检测试剂盒及应用 | |
| CN105671169A (zh) | 柑橘黄龙病菌亚洲种检测用引物、试剂盒及检测方法 | |
| WO2016065982A1 (zh) | 一种家蚕蚕卵微孢子虫的lamp检测引物及其应用 | |
| CN107130057B (zh) | 检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的rt‑pcr及其应用 | |
| CN101475991B (zh) | 一种鉴定黑木耳菌株185的方法及用于鉴定黑木耳菌株185的基因序列 | |
| CN108384881B (zh) | 煤污假尾孢的荧光定量pcr检测方法 | |
| CN105200122A (zh) | 小麦条锈菌的定量检测试剂盒及其应用 | |
| CN105331602A (zh) | Qpcr检测土壤中小麦矮腥黑粉菌的方法 | |
| CN103882109B (zh) | 甘蔗梢腐病病原菌小种gx1的分子检测方法 | |
| CN109988860B (zh) | 一种用于检测冬生疫霉的引物及探针组合物及其试剂盒和检测方法 | |
| CN105420372A (zh) | 检测梨黑斑病菌的pcr引物以及使用该引物的检测方法 | |
| CN102888470B (zh) | 一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物及检测方法 | |
| CN113005218A (zh) | 一种腐皮镰刀菌的lamp检测引物、试剂盒及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160217 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |